NADPH在制备治疗心肌肥厚与心力衰竭的药物中的应用的制作方法

本发明属于药物领域，具体涉及NADPH在制备治疗心肌肥厚与心力衰竭的药物中的应用。

背景技术：

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide，NADPH)由葡萄糖经过磷酸戊糖途径(PPP)代谢产生，作为细胞内最为重要的电子供体和生物合成的还原剂，可为还原性生物合成提供氢离子。NADPH是谷胱甘肽(GSH)还原酶的辅酶，可使氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型GSH，维持还原型GSH的正常含量。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，可保护一些含巯基的蛋白质、脂肪和蛋白酶类免受氧化剂的破坏，特别在维持红细胞膜的完整性方面起着重要作用。NADPH除了参与胆固醇、脂肪酸、单加氧酶系、类固醇激素等的生物合成，还参与体内羟化反应和药物、毒物及某些激素的生物转化；例如，NADPH可利用解毒细胞的电子供体，通过体内代谢减少生物体氧化型化合物，维持其氧化还原的平衡，在氧化防御系统发挥重要作用。NADPH也可以借助于异柠檬酸穿梭作用进入呼吸链产生ATP：由于线粒体内膜对物质的通透性很低，线粒体外产生的NADPH不能直接进入呼吸链被氧化。NADPH上的H可以在异柠檬酸脱氢酶的作用下被交给NAD+，然后由NAD+进入呼吸链产生能量。细胞能量代谢的维持和减少ROS(活性氧簇)对细胞生存，特别对缺血缺氧的组织至关重要，普遍认为能量代谢障碍和氧化应激是心脑缺血疾病的重要机制。

心肌肥厚(cardiac hypertrophy)尤其是左室肥厚(Left ventricular hypertrophy,LVH)是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的靶器官反应。我国现有高血压病患者约2.66亿，其中三分之一的高血压患者可伴发LVH。心肌肥厚是一种极其重要的心血管危险因素，能增加冠心病、充血性心衰、中风或暂时缺血性心脏病发作等发生猝死的机率；更为重要的是，心肌肥厚也是慢性心力衰竭发生和发展的重要机制之一。

心力衰竭(heart failure)是指在正常的静脉回流情况下，由于心输出量绝对或相对减少，不能满足机体代谢需要而引起以循环障碍为主的综合征。临床上，以肺循环和(或)体循环瘀血以及组织血液灌注不足为主要特征，按心力衰竭的发展过程，可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭；急性心力衰竭是指心输出量短期内急剧下降甚至丧失泵血功能，其发展迅速，根据严重程度可表现为昏厥、心源性休克、急性肺水肿、心脏骤停；慢性心力衰竭亦称充血性心力衰竭或慢性心功能不全，是指由于致病因素使心脏长期处于压力和(或)容量负荷过重状态，造成心脏贮备力耗竭，逐渐丧失代偿功能，心输出量绝对或相对不足，不能维持身体代谢需要。心力衰竭的病因是多重而复杂的，主要包括心肌收缩和/或舒张功能障碍和心脏负荷长期过重及心室充盈受限，心力衰竭实际是心脏功能由代偿向失代偿转化的结果；心力衰竭尤其是慢性心力衰竭时，机体防止心输出量减少产生的代偿反应包括神经内分泌反射和心肌构型重建，心肌肥厚就是心脏构型重建的主要表现。心肌肥厚早期对心功能具有一定的代偿意义；然而，在心肌肥厚晚期，病理性心肌肥厚伴随着心肌细胞凋亡、心肌成纤维细胞增殖和心肌纤维化间质增生，促使心脏功能逐渐由代偿转化为失代偿，参与了心力衰竭的发生和发展。

目前，临床上治疗心肌肥厚或心力衰竭的药物相近，主要是抑制心衰或心肌肥厚过程中神经内分泌的过度激活，纠正血流动力学紊乱，常用的治疗药物包括：(1)血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIs))和血管紧张素Ⅱ受体I阻断剂(ARBs)，作用机制为：减少血管紧张素(ACEIs)的生成和作用，舒张动静脉，降低心脏前后负荷，并可逆转心血管重塑和左心室肥厚；(2)利尿剂，作用机制为：通过排除机体多余的水分，减少有效循环血量，减轻心脏前负荷，消除组织间隙水肿或肺水肿，螺内酯等醛固酮受体拮抗剂还可对抗醛固酮的心脏重塑作用；(3)钙拮抗剂，作用机制为：抑制胞外Ca²⁺内流，使胞内游离Ca²⁺浓度下降，舒张血管，降低血压，减轻前和/或后负荷来改善心脏功能；(4)β受体阻滞剂，作用机制为：阻断β受体，抑制交感神经系统活性及肾素释放，降低血压，消退或部分逆转心脏构型重建，上调β受体，恢复心脏对交感神经递质的敏感性；(5)正性肌力药物，作用机制为：如洋地黄类及非苷性正性肌力药(包括磷酸二酯酶抑制剂和β受体激动剂)，直接加强心肌收缩力，增加心输出量，减少心脏收缩末期残余血量，降低前负荷，恢复心功能。上述第(1)-(4)类药物缓解或逆转心肌肥厚，逐渐改善心功能，适用于心肌肥厚或慢性心力衰竭的长期治疗，但由于它们不具有强心作用，在心肌肥厚向心衰发展的失代偿期疗效一般，且不能用于急性心力衰竭的治疗；而第(5)类药物，临床应用时其不良反应较多而严重，如：增加心律失常的风险，甚至增加心衰的死亡率。

目前，尚无NADPH用于治疗心肌肥厚与心力衰竭的报道。

技术实现要素：

为此，本发明提出NADPH在制备治疗心肌肥厚与心力衰竭的药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供NADPH在制备治疗心肌肥厚的药物中的应用。

本发明还提供NADPH在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。

优选地，本发明上述应用，所述药物包括药学上有效量的NADPH和药学上可接受的载体。

进一步优选地，本发明上述应用，所述载体选自常用的药用辅料、或者生理盐水、或者蒸馏水。

进一步优选地，本发明上述应用，所述药物为NADPH按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。

进一步优选地，本发明上述应用，所述药物的给药方式选自口服给药、注射给药、舌下给药、直肠给药、经皮给药、喷雾吸入中的至少一种。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明通过研究发现，NADPH不仅具有显著的强心作用，而且能够对心肌肥厚有缓解作用，因此可以作为治疗心肌肥厚与心力衰竭的药物；

(2)本发明通过研究进一步发现，NADPH能够提高小鼠的心肌组织中的Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶和总ATP酶的活性，推测NADPH可能通过上述机制发挥对心肌肥厚的缓解作用；

(3)此外，NADPH对正常大鼠的血压无明显影响，治疗心肌肥厚与心力衰竭时不良反应较小。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1(a)表示的为实验例1中NADPH对离体原位蛙心的心收缩力的影响，数值表示的为收缩力相比正常的百分比；图1(b)表示的为实验例1中NADPH对离体原位蛙心的心输出量的影响；图1(c)表示的为实验例1中NADPH对离体原位蛙心的心率的影响；图1(d)表示的为实验例1中NADPH对离体原位蛙心的心收缩力影响的曲线图，平均值±标准差，N＝8-10；与正常组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与低钙相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；

图2(a)表示的为实验例2中NADPH对ISO致心肌肥厚的影响；图2(b)表示的为实验例2中各组小鼠的心脏HE染色图；图2(c)表示的为实验例2中NADPH对ISO诱导小鼠心肌肥厚中心重指数的影响；测定心脏和左心室的湿重，计算心重指数(HWI＝HW/BW)和左心指数(LVWI＝LVW/BW)，平均值±标准差；与对照组相比，^###P<0.001；与ISO组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；N(L)表示的为NADPH 1mg/kg，N(M)表示的为NADPH 2mg/kg，N(H)表示的为NADPH 4mg/kg；

图3(a)表示的为实验例2中各组小鼠的心电图；图3(b)表示的为实验例2中NADPH对ISO所致小鼠的心电图的R波波幅的影响；平均值±标准差；与对照组相比，^###P<0.001；N(L)表示的为NADPH 1mg/kg，N(M)表示的为NADPH 2mg/kg，N(H)表示的为NADPH 4mg/kg；

图4是实验例2中NADPH对小鼠心功能的影响；N(L)表示的为NADPH 1mg/kg，N(M)表示的为NADPH 2mg/kg，N(H)表示的为NADPH 4mg/kg；

图5是实验例2中NADPH对小鼠的心肌组织中ATP酶含量的影响；N(L)表示的为NADPH 1mg/kg，N(M)表示的为NADPH 2mg/kg，N(H)表示的为NADPH 4mg/kg；

图6是实验例3中NADPH对正常大鼠的血压的影响；NS表示的为生理盐水，SBP表示的为收缩压，DBP表示的为舒张压，MBP表示的为平均动脉压，平均值±标准差。

实验例

下述各实验例证明本发明所述的技术效果。

实验例1 NADPH对离体原位蛙心的强心作用的实验

(1)实验材料

蟾蜍(60～80g)由苏州大学医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037；

动物饲养环境：室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄取食物和水；

外源性NADPH药物的来源可以通过人工合成、半合成、生物提取获得；

(2)实验方法

将蟾蜍毁髓后固定于蛙板，分离左右主动脉和下腔静脉，下腔静脉插入静脉套管，左主动脉插入动脉套管，右主动脉结扎，用任氏液(1000mL：NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl₂0.12g、NaHCO₃ 0.2g、NaH₂PO₄ 0.01g、葡萄糖1g、双蒸水)冲洗心脏，蛙心夹夹住心尖，通过张力换能器连接Medlab操作系统，记录正常蛙心搏动曲线、心率及心输出量，换入等量低钙任氏液(CaCl₂含量为任氏液的1/2)灌流心脏，当心脏收缩显著减弱时，向静脉套管内加入NADPH(纯度>97％，Roche，10621706001)，记录心脏搏动曲线、心率及心输出量变化。

(3)实验结果

NADPH对离体原位蛙心的影响如图1(a)、1(b)、1(c)、1(d)所示。

由图1(a)、1(b)、1(c)、1(d)可知，离体蛙心经低钙任氏液灌流后，心收缩力辐度显著降低，心输出量减少；在低钙任氏液中加入5μg/mL NADPH或10μg/mLNADPH后，离体蛙心的收缩辐度可以显著提高，心输出量增加，但对心率无显著影响；给药20min后，开始出现强心作用，维持时间长达2h。

(4)实验结论

NADPH可以显著提高离体蛙心的收缩辐度，增加心输出量，但对心率无显著影响；即：NADPH具有显著的强心作用。

实验例2小鼠心肌肥厚模型实验

(1)实验材料

SPF级ICR小鼠(雄性，体重18～22g)由苏州大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：XCYK(苏)2002-2009；

动物饲养环境：室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄取食物和水；

外源性NADPH药物的来源可以通过人工合成、半合成、生物提取获得；

ATP酶试剂盒(A070-6)，购自南京建成生物工程研究所；

异丙肾上腺素(ISO)和卡托普利(Cap)均购自上海麦克林生化科技有限公司；

水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司；

心电图仪(Kenz,ECG-103)。

(2)实验方法

1)异丙肾上腺素致小鼠心肌肥厚模型

异丙肾上腺素(ISO)是一种非选择性β-肾上腺素受体激动剂，小剂量长期给药能够增加心肌收缩力和耗氧量，并促进胞内环磷酸腺苷(cAMP)和糖原合成，增加心肌细胞总蛋白和非收缩蛋白合成，引起心肌肥厚，尤其是左心室肥厚。

ICR小鼠随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组—ISO组、阳性对照组—ISO+卡托普利(Cap)100mg/kg、ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组。

各组的给药方法为：正常对照组每日皮下注射(sc)等容积生理盐水；其他各组每日皮下注射(sc)ISO 2次，每次1mg/kg，2次间隔8h，ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组每天上午sc ISO，4h后腹腔注射相应剂量的NADPH，阳性对照组每天上午scISO，4h后腹腔注射相应剂量的Cap，模型对照组腹腔注射等容积生理盐水；连续给药14d。

2)小鼠超声心动图测定

小鼠腹腔注射4％水合氯醛10mg/kg麻醉，脱净小鼠胸部皮毛，采用高分辨率小动物超声影像系统(VISUΛLSONICS，VEVO2100)，探头频率为8MHz，置于胸骨左侧，选取标准左室乳头肌短轴切面和长轴切面结合M型和多普勒超声进行检测，分别测量小鼠心脏收缩期和舒张期时射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、左室内径(LVID)、左室后壁厚度(LVPW)、左室前壁厚度(LVAW)、左室容积(LVvol)，均取连续3个心动周期的平均值。

3)小鼠心电图测定

小鼠腹腔注射4％水合氯醛 10mL/kg麻醉，将针状电极红色连与(R)右上肢、黄色(L)左上肢、绿色(LF)左下肢、黑色(RF)右下肢，采用心电图仪检测Ⅱ导联心电图，频率50Hz，纸速25mm/s。

4)小鼠心脏重量指数的测定

给药14d后，测量小鼠体重(body weight，BW)，麻醉处死，开胸取心脏，用生理盐水洗净残血，滤纸吸干拍照，称量全心重(heart weight，HW)和左心室重(left ventricle weight，LVW)，计算心重指数(HWI＝HW/BW)和左心指数(LVWI＝LVW/BW)。部分左心室置4％中性甲醛固定，部分左心室置-80℃保存。

5)小鼠心肌组织HE染色

取心尖部左心室组织固定于4％中性甲醛溶液，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片，行HE染色，光学显微镜下观察拍照。

6)小鼠生化指标测定

小鼠左心室组织匀浆取上清，应用试剂盒测定心肌组织Na⁺-K⁺、Ca²⁺-Mg²⁺、T-ATP酶水平。

(3)实验结果

NADPH对减轻ISO所致小鼠心肌肥厚的影响如图2(a)、2(b)、2(c)所示。

由图2(a)可知，模型对照组小鼠心脏比正常对照组明显增大，阳性对照组、ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组心脏有所缩小。

由图2(b)可知，病理学检查显示：模型对照组心肌组织经HE染色后心肌细胞肥大，细胞核深染，细胞间距变大；ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组，随着NADPH剂量的增大，心肌细胞肥大现象的减轻越明显；这表明，NADPH能够减轻ISO所致小鼠心肌细胞肥大的病理改变。

如图2(c)可知，ISO处理2w后，模型对照组的心脏HWI和LVWI均显著增加；与模型对照组相比，阳性对照组、ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组的心脏HWI和LVWI显著降低；这表明，NADPH能够有效缓解ISO所致小鼠心肌肥厚。

QRS波群反映左右心室去极过程中电位和时间的变化。在左心室肥大时，心电图出现QRS波群电压增高，波群时间延长。NADPH对ISO所致小鼠心电图变化的影响如图3(a)、3(b)所示。

由图3(a)、3(b)可知，模型对照组QRS波幅明显高于正常对照组，表明小鼠发生左室心肌肥厚；阳性对照组、ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组小鼠的QRS波电压均有所降低；这表明NADPH对心肌肥厚有缓解作用。

NADPH对小鼠心功能的影响如表1和图4所示。

表1 NADPH对小鼠心功能的影响

由表1和图4可知，(1)与正常对照组相比，模型对照组小鼠的收缩期左室内径(LVIDs)、舒张期左室内径(LVIDd)、左室收缩末期容积(LVVols)、左室舒张末期容积(LV Vold)显著升高，而射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)明显降低；这表明，模型对照组小鼠发生左室心肌肥厚、心功能降低；(2)阳性对照组、ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组小鼠的上述指标有一定程度改善，尤其ISO+NADPH 2mg/kg组小鼠的EF和FS有提高的趋势；这表明NADPH对ISO所致的心肌肥厚及心功能缺损有缓解作用。

Na+-K+-ATP酶依赖ATP使Na⁺外流和K⁺内流，以维持细胞内外的Na⁺，K⁺水平；Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶依赖ATP将胞内Ca²⁺泵至肌浆网或胞外，以维持胞内钙离子稳态。NADPH对小鼠的心肌组织中ATP酶含量的影响如图5所示。

由图5可知，与模型对照组相比，ISO+NADPH 1mg/kg组、ISO+NADPH 2mg/kg组、ISO+NADPH 4mg/kg组小鼠的心肌组织中的Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶和总ATP酶活性均显著升高。

(4)实验结论

(1)NADPH能够减轻小鼠心肌细胞肥大的病理改变，对心肌肥厚有缓解作用；(2)NADPH能够提高小鼠的心肌组织中的Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶和总ATP酶活性，维持细胞内离子稳态。

实验例3 NADPH对正常大鼠的血压的影响

(1)实验材料

SD大鼠(雄性，体重250～300g)由苏州大学医学院实验动物中心提供；

动物饲养环境：室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄取食物和水；

无创血压检测系统(Kent Scientific,CODA20496)。

(2)实验方法

大鼠无创尾动脉血压测定：采用容量压力记录传感器无创测量清醒大鼠血压，大鼠正常饲养2天，应用无创血压检测系统测量大鼠血压，实验环境控制安静、恒温，适应性训练3天后开始正式实验。分为两组：生理盐水组；NADPH 10mg/kg组。每次实验进行2只大鼠，先测量记录基础血压，基础血压平稳后，一只静脉注射生理盐水2mL/kg，另一只静脉注射0.5％NADPH 2mL/kg，记录静脉注射药物30min、60min、90min、120min后的血压。

(3)实验结果

NADPH对正常大鼠的血压的影响如图6所示。

由图6可知，NADPH在给药30min、60min、90min、120min后，正常大鼠的收缩压、舒张压、平均血压和脉压差与给药前相比无显著差异，且在各时间点与生理盐水组也无统计学差异(P>0.05)。

(4)实验结论

NADPH对正常大鼠的血压无明显影响。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。