一种葛根素水凝胶在心肌梗死治疗药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种通过自组装形成的葛根素小分子水凝胶在心肌修复中的应用。

背景技术：

心肌梗死严重威胁着人类健康，现今治疗手段均未能解决心梗后心肌细胞数量绝对不足这一关键问题，干细胞移植治疗存在移植后细胞存活和滞留不足的问题。可注射性水凝胶制剂一方面可以提供物理支撑力，另一方面可以携带细胞或者药物进行心梗后移植治疗。近期的临床试验也证实可注射性水凝胶治疗心肌梗死的安全性及有效性，展现出良好的应用前景。我们前期工作中发现葛根素可以不进行任何的化学修饰自组装形成水凝胶，是迄今为止自然界发现的第一种基于天然药物本身的自组装水凝胶。我们进一步发现其是一种可注射性水凝胶，基于葛根素药物的强抗过氧化保护细胞作用及可注射性水凝胶在心肌梗死中的良好应用，我们将应用可注射性葛根素水凝胶治疗心肌梗死的研究，观察其修复心梗后心肌组织的作用及能否改善干细胞移植治疗心肌梗死的效果。

技术实现要素：

本发明的内容在于提供一种可注射性葛根素水凝胶，其具有良好的细胞相容性，在体外可以对抗过氧化氢诱导的细胞过氧化水平，在体内能够应用于动物心肌梗死后心肌组织修复。

为了解决上述问题，本发明一个方面提供了葛根素水凝胶在制备治疗心肌梗死的药物中的用途。

为了解决上述问题，本发明另一个方面提供了葛根素水凝胶在制备抗过氧的药物中的用途，优选为制备降低氧化氢诱导的细胞ros水平升高的药物中的用途。

为了解决上述问题，本发明另一个方面提供了葛根素水凝胶在制备促进梗死心肌修复的药物中的用途，

在本发明的技术方案中，葛根素水凝胶通过将葛根素溶解于水溶性介质后加热至溶解，然后进行冷却获得。

在本发明的技术方案中，葛根素小分子自组装水凝胶中葛根素的含量为0.8％wt-8％wt，优选为2％wt-6％wt。

在本发明的技术方案中，水溶性介质为ph6-8的水溶液，优选为ph6.8-7.4的pbs溶液。

在本发明的技术方案中，加热温度为80℃-100℃。

在本发明的技术方案中，葛根素小分子自组装水凝胶呈纳米纤维状。

本发明把葛根素溶于生理盐水中，通过加热冷却的方式自组装形成水凝胶。

实验表明，葛根素水凝胶对大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞无毒性作用，具有良好的细胞相容性。

实验表明，葛根素水凝胶体外培养骨髓间充质干细胞(mscs)可以减少过氧化氢诱导的细胞过氧化损伤作用。

实验表明，葛根素水凝胶进行大鼠心梗后心肌组织注射，具有增加梗死区室壁厚度、减少心肌纤维化程度、减少心梗面积，增加心肌血管新生，改善心功能的作用。

本发明的有益效果是：

1本发明是提供前期发现的葛根素水凝胶，其具有良好的细胞相容性，适合组织工程学应用。

2本发明提供的葛根素水凝胶，具有良好的抗过氧化作用，能够促进动物心肌梗死后心肌组织修复，还可以作为支架材料承载骨髓间充质干细胞进行心肌注射，促进骨髓间充质干细胞修复梗死心肌组织的效果，改善心功能。

附图说明

图1：不同时间点不同浓度葛根素水凝胶对心肌细胞(a)和心肌成纤维细胞(b)存活和增殖的影响；

图2：葛根素水凝胶对h2o2诱导的mscs细胞sod活性和mda含量的影响，^*p<0.001vscon,^#p<0.001vsh2o2；

图3：葛根素水凝胶对h2o2诱导mscs细胞内dhe水平的影响，a正常mscs组，bh2o2干预组，ch2o2+2％pg组，dh2o2+4％pg组，eh2o2+6％pg组，^*p<0.001vsh2o2；

图4：h2o2干预下annexinv-fitc/pi检测葛根素水凝胶对mscs凋亡率的影响，a正常mscs组，bh2o2干预组，ch2o2+2％pg组，dh2o2+4％pg组，eh2o2+6％pg组；

图5冰冻切片检测cm-dii标记的mscs体内移植后4周细胞的滞留率，^*p<0.001vsmscs组；

图6：定量分析cm-dii标记mscs体内移植后4周细胞滞留率：^*p<0.001vsmscs组；

图7：he染色和masson染色观察相对心肌梗死面积及室壁相对厚度比较结果：a心肌梗死区室壁相对厚度；b相对心肌梗死面积，^*p<0.05vspbs组，^#p<0.001vsmscs组和4％pg组(n＝5)；

图8：he染色和masson染色观察相对心肌梗死面积及室壁相对厚度比较结果图；

图9：masson染色观察各组对大鼠心梗后心肌纤维化程度的影响：蓝色为纤维化区，红色为正常心肌组织。^*p<0.001vspbs组，^#p<0.05vsmscs组和4％pg组(n＝5)；

图10：免疫荧光组织化学染色分析各组心肌特异性蛋白ctnt/a-sarcomericactin/connexin43的表达；

图11：免疫荧光组织化学染色检测各组梗死区α-sma/vwf蛋白的表达情况；

图12：移植后4周心脏m型超声心动图，a：sham组,b：pbs组,c:mscs组,d4％pg组,emscs+4％pg组(n＝5)；

图13：定量分析移植后4周各组心脏超声ef,fs,lvids和lvidd的值；

图14：本发明的治疗作用示意图。

具体实施方式

实施例1：葛根素水凝胶的制备

称取葛根素，加入pbs(磷酸盐缓冲液)，使葛根素在pbs中的浓度分别为2％wt、4％wt、6％wt，酒精灯加热至80℃-100℃使得葛根素完全溶解，自然冷却至室温5分钟后，即可形成果冻样的葛根素水凝胶。

实施例2：葛根素水凝胶对心肌细胞和心肌成纤维细胞存活和增殖的影响

1)在96孔板中置入不同浓度(2％，4％和6％)的葛根素水凝胶，在孔中加入细胞，细胞密度设置为5×10⁴/ml，以没有水凝胶为对照组，以没有细胞的不同浓度葛根素水凝胶为空白孔；

2)到测定时间时用移液器吸出原培养基，用pbs洗2次，往每个孔中用移液枪加入10μlcck-8试剂盒中的溶液；

3)将96孔板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中温育4小时；

4)从培养箱中取出96孔板放置在水平式摇床上，慢速摇10min；

5)用酶标仪将波长设置为450nm进行吸光度测定。

实验结果参见图1，结果表明，2％，4％和6％浓度的葛根素水凝胶对大鼠心肌细胞无毒性作用，对心肌成纤维细胞增殖性无不良影响，具有良好的细胞相容性。

实施例3：葛根素水凝胶对h2o2诱导的mscs细胞sod活性和mda含量的影响

本实验采用h2o2作为外源性ros模拟体内心肌梗死后过氧化环境，h2o2的浓度为100μmol/l，干预1h；实验分组：正常mscs培养组，h2o2干预组，h2o2+2％pg(葛根素水凝胶)组，h2o2+4％pg组，h2o2+6％pg组；细胞内超氧化物歧化酶(sod)活力和细胞内丙二醛(mda)含量检测参照检测说明书进行。

实验结果参见图2，与正常组比较，h2o2诱导1h后mscs的sod活性和mda含量明显升高(p＜0.001)；而不同浓度的葛根素水凝胶均很好地对抗h2o2导致的氧化应激水平，与h2o2组比较，2％、4％和6％的葛根素水凝胶均能显著降低细胞内sod活性(p＜0.001)和mda含量(p＜0.001)。结果表明葛根素水凝胶体外培养骨髓间充质干细胞(mscs)可以减少过氧化氢诱导的细胞过氧化损伤作用。

实施例4：葛根素水凝胶对h2o2诱导mscs细胞内dhe水平的影响

具体方法：

1)实验分组：正常mscs培养组，h2o2干预组，h2o2+2％pg组，h2o2+4％pg组，h2o2+6％pg组；

2)将各实验组用浓度为100μmol/l的h2o2干预1h；

3)在各组培养液中直接加入dhe荧光探针溶液，室温下避光孵育30min；

4)用pbs洗涤两遍；

5)用荧光显微镜观察细胞的红色荧光强度；

6)用image-proplus6.0软件计算荧光强度。

实验结果参见图3，a正常mscs组，bh2o2干预组，ch2o2+2％pg组，dh2o2+4％pg组，eh2o2+6％pg组，^*p<0.001vsh2o2；与正常对照组比较，h2o2诱导1h后mscs细胞内荧光强度明显增加(p＜0.001)，而2％，4％和6％的葛根素水凝胶培养的mscs细胞内荧光强度较h2o2组明显降低，有显著统计学差异(p＜0.001)，而各个浓度间的荧光强度没有统计学差异(p>0.05)。结果表明h2o2可以诱导mscs细胞内的ros损伤，而葛根素水凝胶可以明显地减少其诱导的细胞内ros损伤。

实施例5：h2o2干预下annexinv-fitc/pi检测葛根素水凝胶对mscs凋亡率的影响

具体操作步骤：

1)实验分组：正常mscs培养组，h2o2干预组，h2o2+2％pg组，h2o2+4％pg组，h2o2+6％pg组；

2)用h2o2干预1h后，用0.25％胰酶消化收集各组细胞；

3)用4℃预冷的pbs洗涤2次，离心(1000rpm，5min)；

4)收集细胞1×10⁶个，加入1×bindingbuffer100ul，用移液枪吹打成单细胞悬液，转移到流式细胞仪检测专用管；

5)加入5μlannexinv混匀后，再加入5μl碘化丙啶(pi)混匀，室温下避光反应15min；

6)每管再加入400ul1×bindingbuffer，轻轻振荡混匀；

7)用流式细胞仪检测分析各组细胞的凋亡率。

实验结果参见图4，a正常mscs组，bh2o2干预组，ch2o2+2％pg组，dh2o2+4％pg组，eh2o2+6％pg组；经h2o2诱导过氧化损伤1h后，annexinv/pi双标流式细胞术检测显示，与正常组相比较，h2o2组能显著诱导细胞凋亡(28.07±1.34vs7.37±0.79，p<0.001)，而2％、4％、6％的葛根素水凝胶均能显著减少h2o2诱导细胞凋亡(15.14±0.69,13.17±1.70,14.56±0.81vs28.07±1.34,p<0.001)结果表明葛根素水凝胶体外培养骨髓间充质干细胞(mscs)可以减少过氧化氢诱导的细胞过氧化损伤作用。

实施例6：cm-dii标记mscs体内移植后4周

实验分组：空白对照组，mscs组，4％pg+mscs组

制备心肌梗死动物模型,并在造模成功后30分钟后给药,空白组注射pbs100μl，mscs组注射cm-dii标记的mscs细胞100μl，4％pg+mscs组联合注射cm-dii标记的mscs和4％pg共100μl，移植细胞数约0.5*10⁷。术后正常饲养，在动物心梗后4周，完整取出心脏，用预冷的pbs洗净血液，将心脏置于-80摄氏度冰箱中，48小时后取心脏进行冰冻切片，取乳头肌水平切面，每张片厚度5微米，荧光显微镜下观察拍照。

实验结果见图5-图6，移植后4周，4％pg+mscs组cm-dii荧光标记的细胞分布明显高于mscs组，两组比较具有显著性差异(p<0.001)；4％pg+mscs组可见成簇红色荧光分布于心肌间隙间，细胞分布均匀，而单纯mscs移植组几乎未见红色荧光标记的移植细胞。结果表明：移植msc4周后，4％葛根素水凝胶能显著提高细胞的滞留率。

实施例7：he染色和masson染色观察相对心肌梗死面积及室壁相对厚度比较

超声心动图检测完毕后，颈部脱臼处死大鼠，完整取出心脏，用预冷的pbs洗净血液，放置于4％多聚甲醛中固定，制备石蜡切片行下一步实验：

he染色具体步骤如下：

1)将制作的石蜡切片浸泡在二甲苯中，进行脱蜡2次，每次约10分钟；

2)依次放入100％、95％、85％、70％浓度梯度的乙醇中，每次5min，最后用蒸馏水过水转入染液；

3)放入苏木精染液中染色切片约10分钟；

4)用蒸馏水冲洗玻片上的多余染液，用0.5～1％盐酸酒精分色，显微镜下观察以便控制好染色的进度，待细胞核与核内染色体显示清晰为止，清水冲洗15分钟；

5)放入0.1～0.5％的伊红染液中染色1分钟，用清水洗涤切片1分钟；

6)依次经70％、85％、95％、100％的浓度梯度乙醇脱水，每次5min；

7)用二甲苯i透明染好的切片2次，共10min左右；

8)封片：用滤纸吸除切片周围的液体，滴入适量中性树胶，盖玻片封片，倒置显微镜下查看染色情况并拍片。

masson染色具体操作步骤：

1)取制作的石蜡切片；

2)在二甲苯中脱蜡2次，每次10min；

3)依次放置入100％、95％、85％、70％乙醇各5min，完成后经蒸馏水转入染液；

4)浸入苏木精染液染色10min；

5)用清水冲洗玻片上多余的染液，0.5～1％盐酸酒精分色。镜检观察，直至细胞核及核内染色质显色清晰为止，约数十秒；

6)用流水冲洗15min；

7)masson丽春红酸性复红液染色5-10min，用2％冰醋酸水溶液浸洗切片；

8)1％磷钼酸水溶液分化3-5min；

9)苯胺蓝或光绿液染色5min；

10)0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；

11)二甲苯透明2次，共10min；

12)封片：小心吸去切片周围多余的二甲苯，滴加适量中性树胶，盖玻片封片；

13)倒置显微镜下观察拍照。

心梗面积和室壁厚度的计算：

采用倒置显微镜观察he染色和masson染色，并拍照，结果用imagepro6.0软件分析测量，心梗面积和室壁厚度的计算方法如下：心梗面积＝(心梗区域左心室心内膜长度+外膜长度)/(左心室完整心内膜周长+心外膜周长)×100％，梗死区室壁厚度的方法：取测量梗死区中点处、梗死区边缘的左侧和右侧、梗死区中点与左侧点的中心、梗死区中点与右侧的中心共5处的室壁厚度值取平均值，每个标本随机取3个切面，计算平均值。

实验结果见图7-图8，he和masson染色结果显示，pbs组左室壁明显变薄，左室腔明显扩大，梗死区细胞排列紊乱。与pbs组比较，mscs组、4％pg组、mscs+4％pg组也均有所改善，mscs+4％pg组改善最明显，结果表明葛根素水凝胶进行大鼠心梗后心肌组织注射，具有增加梗死区室壁厚度、减少心梗面积的作用。

实施例8：masson染色观察各组对大鼠心梗后心肌纤维化程度的影响

masson染色各实验组切片后，采用imagepro6.0软件计算出蓝色区域面积与红色区域面积的比值，每组重复5个样本，进行两组间t检验统计学方法分析。实验结果见图9，masson染色结果显示，pbs组左室腔明显扩大，左室壁明显变薄，蓝色面积最大即纤维化最严重，与pbs组比较，mscs组、4％pg组和mscs+4％pg组均有所改善(p<0.001)，但mscs+4％pg组较mscs组和4％pg组改善更加明显(p<0.05)，结果表明葛根素水凝胶进行大鼠心梗后心肌组织注射，具有降低心肌纤维化程度的作用。

实施例9：免疫荧光组织化学染色分析各组心肌特异性蛋白的表达

取实施例7制备的切片，室温复温30min，pbs冲洗2次，免疫组化笔沿组织周围画圆，0.5％tritonx-100通透15min后，pbs冲洗3次，每次2min；山羊封闭血清于室温下封闭40min，pbs冲洗3次，每次2min；一抗孵育：以1:100稀释浓度分别加入兔抗大鼠的ctnt、connexin43、a-a-sarcomericactin一抗，阴性对照组用pbs代替，放置于湿盒中，于4℃孵育过夜；室温下复温45min，用pbs洗涤3次，每次2min；二抗孵育：加入羊抗兔标志二抗工作液，37℃下避光孵育2h；pbs漂洗3次，每次2min，用抗淬灭剂封片；荧光显微镜下观察绿色荧光、蓝色荧光、红色荧光阳性的细胞，将拍照参数设置在同一条件下拍照。

实验结果参见图10，荧光倒置显微镜下可以观察到心梗组织中带有红色荧光(ctnt和a-sarcomericactin)或者绿色荧光(connexin43)的细胞，代表心肌组织。从结果可以看出，pbs组几乎未见明显的ctnt、a-sarcomericactin和connexin43荧光表达，而mscs注射组，4％pg注射组和mscs+4％pg注射组均有不同程度的荧光表达，其中，mscs+4％pg注射组较4％pg注射组和mscs注射组荧光表达数量明显增多。以上结果说明mscs组，4％pg组和mscs+4％pg治疗组均可以不同程度地保护心肌细胞，增加心肌细胞数量，而且mscs+4％pg治疗组效果最为显著。

实施例10：免疫荧光组织化学染色分析各组血管新生特异性蛋白的表达

取实施例6制备的切片，室温复温30min，pbs冲洗2次，免疫组化笔沿组织周围画圆，0.5％tritonx-100通透15min后，pbs冲洗3次，每次2min；山羊封闭血清于室温下封闭40min，pbs冲洗3次，每次2min；一抗孵育：以1:100稀释浓度分别加入兔抗大鼠的vwf、a-smoothmuscle一抗，阴性对照组用pbs代替，放置于湿盒中，于4℃孵育过夜；室温下复温45min，用pbs洗涤3次，每次2min；二抗孵育：加入羊抗兔标志二抗工作液，37℃下避光孵育2h；pbs漂洗3次，每次2min，用抗淬灭剂封片；荧光显微镜下观察绿色荧光、蓝色荧光、红色荧光阳性的细胞，将拍照参数设置在同一条件下拍照。

实验结果参见图11，荧光倒置显微镜下可以观察到心梗组织中带有绿色荧光(vwf和α-sma)表达，代表毛细血管(vwf)和小动脉(α-sma)。从结果可以看出，pbs组的荧光表达数量明显少于其他各组，而mscs注射组，4％pg注射组和mscs+4％pg注射组均较多的荧光表达，其中，mscs+4％pg注射组较4％pg注射组和mscs+4％pg注射组荧光表达数量明显增多。以上结果说明mscs组，4％pg组和mscs+4％pg治疗组均可以不同程度地增加新生毛细血管和小动脉的数量，而mscs+4％pg治疗组效果最为显著。

实施例11：移植后4周心脏m型超声图检测心功能

按实施例6的方法制备心肌梗死模型并给药，正常饲养4周后，将超声探头置于左前胸壁，探头频率为15mhz，取样容积0.6mm，扫描速度100mm/s，取乳头肌水平短轴切面，选择清晰图像拍照。在超声仪上二维图像上获取m型曲线进行测量，采用单平面改良的simpson法，测定左室收缩末期直径(lveds)、左心室舒张末期直径(lvedd)，并计算出左室短轴缩短率(fs)和左室射血分数(ef)。应用telchholz校正公式计算ef和fs，公式如下：ef(％)＝[(lvedd³﹣lveds³)/lvedd³]×100，fs(％)＝[(lvedd﹣lveds)/lvedd]×100，每个超声测定值取三个连续心动周期测量的均值。

实验结果参见图13，结果表明：4％pg和mscs都可以改善心脏收缩功能，但在减小lvidd、lvids的作用中mscs作用明显较弱，4％pg组更强，但当两者联合应用时，评价心脏功能的指标lvfs、lvef、lvidd、lvids均有明显改善。