本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架及其制备方法与应用。
背景技术：
骨组织工程在损伤及病变骨的修复中是受到广泛应用与关注的途径之一。在体内植入进行修复之前，干细胞通常被接种在具有3d连通孔结构且在生物体内可自行降解的具有良好生物相容性的支架上。在应用中，由于3d生物支架将充当人造细胞外基质，因此制备得到的3d生物支架应与天然细胞外基质相仿。首先，用于制备3d生物支架的原料需具有良好生物相容性，并且能于体内以适当的速度自行降解。第二，产物支架在结构上需具备连通的多级孔结构，其中包括维持支架结构稳定，促进细胞粘附和增殖，运输营养物质的大孔(直径几百微米)；促进血管化，促进代谢废物的运输的中孔(直径几十微米)以及影响细胞基因表达等行为的小孔(直径几微米及以下)。另外，合格的生物支架还必须具备足够支撑细胞培养过程中的物理负荷的力学性能。此外，由于在细胞接种以及支架植入初期经常会引起局部炎症反应。因此，3d生物支架还应该具备药物载体的功能。
由于其良好的生物相容性和易加工性能，合成生物可降解聚酯，尤其是左旋聚乳酸(plla)和聚己内酯(pcl)被广泛用于3d生物支架的制备。然而，纯plla与纯pcl体系的机械性能较差，限制了其在生物医学领域的应用。通过将pcl，plla以及具有生物活性的无机纳米粒子进行结合，可有效提高体系的力学性能。
pickering高内相乳液模板法与3d打印技术是近年来受到广泛关注的制备3d生物支架的简易方法。其中，pickering高内相乳液模板法是指：以内相体积高于74%的固体粒子为稳定剂的乳液为模板，通过溶剂挥发制备得到3d生物多孔支架的方法。pickering高内相乳液模板法简单易操作，但是通常制备得到的支架只具有中孔及小孔结构(acsappl.mater.interfaces,2014,19:17166-17175;j.control.release2015,e127-e127)，因此不能为细胞黏附提供充足的空间。3d打印技术作为新兴的制备生物支架的技术，可以实现对支架孔结构的精准调控，但制备微米(及以下)级的孔结构对机械的精密度以及编程的难度提出了更高的要求，因此大大提高制备了成本。不难看出，pickering高内相乳液模板法与3d打印技术进行结合，为3d生物支架的制备提供了一种行之有效且经济简便的方法。
然而，3d打印对pickering乳液的粘度有较高的要求，而大部分固体粒子稳定的pickering乳液粘度均较小，如疏水改性羟基磷灰石纳米粒子稳定的pickering高内相乳液，由于其粘度达不到3d打印的要求(j.mech.behav.biomed.,2014,88-99)，因而限制了其进一步的发展。疏水改性二氧化硅粒子由于其良好的机械性能及良好的生物相容性也受到了广泛关注。并且，由疏水改性二氧化硅粒子稳定的pickering高内相乳液粘度较高，可以达到3d打印技术的要求，因此为pickering高内相乳液模板法与3d打印技术的结合奠定了坚实的基础。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架，该类纳米复合生物支架可用作组织工程支架，用于组织的修复和再生。
本发明的另一目的在于提供所述一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，该制备方法基于油包水pickering高内向乳液模版法与3d打印技术，工艺简单，材料来源广泛、安全无毒，制备条件温和，结构可控，重复性好，适于工业化生产，具有良好的应用前景。
本发明的目的还在于提供所述一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的应用。
一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括如下步骤：
（1）将生物可降解聚酯加入有机溶剂中，超声作用下充分溶解；
（2）将二氧化硅粒子加入步骤（1）得到的溶液中，超声作用下分散均匀，配制得到油相；
（3）将蒸馏水加入步骤（2）得到的油相中，乳化，得到油包水（w/o）型乳液；
（4）将步骤（3）得到的乳液通过3d打印技术进行打印，得到具备规则孔结构的多孔支架，室温放置，使溶剂和水相蒸发，得到所述多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
进一步地，步骤（1）中，所述生物可降解聚酯为人工合成的生物可降解聚酯，包括聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚乳酸-己内酯共聚物、聚羟基丁酸戊酯和聚β-羟基丁酸酯中一种以上。
进一步地，步骤（1）中，所述生物可降解聚酯相对于油相的质量分数为1~8%，优选为4~6%。
进一步地，步骤（1）中，所述有机溶剂包括二氯甲烷。
进一步地，步骤（2）中，所述二氧化硅粒子为疏水改性二氧化硅粒子，粒径分布为20nm～30nm。
进一步地，步骤（2）中，所述二氧化硅粒子相对于油相的质量分数为0.5~4%，优选为2~2.5%。
进一步地，步骤（3）中，所述蒸馏水与油相的体积比为3~5:1。
进一步地，步骤（3）中，所述乳化是通过涡旋混合器在100～2800r/min下涡旋振荡混合15～30min。
进一步地，步骤（4）中，所述3d打印选用300cc的美式针筒，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头进行打印。
进一步地，步骤（4）中，所述具备规则孔结构的多孔支架为规整的立方体结构，其中长、宽为35～40mm，高为7~12mm，共6~10层，每层平行均匀分布13~15条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布。
进一步地，步骤（4）中，所述放置的时间为48~72h。
由上述任一项所述的制备方法制得的一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架，具备规则的大孔、中孔和小孔结构，大孔直径分布在300～700um，中孔直径分布在10～100um，小孔直径分布在1～10um，且支架孔结构相互连通，疏水改性二氧化硅粒子附着或镶嵌在孔壁表面，使得多孔支架孔壁表面粗糙。
多级可控通孔结构的纳米复合生物支架中，大孔结构由3d打印技术实现调控，中孔与小孔结构由pickering乳液模板法实现控制，
所述的一种多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的应用，用作组织工程支架或药物载体。
进一步地，所述组织工程支架包括骨组织工程支架。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
（1）本发明制备工艺简单，生产效率高，重复性好，实现了pickering乳液模版法与3d打印技术的结合，生产成本低，适宜工业化生产；
（2）本发明制备方法条件温和，不涉及任何化学反应，原料简单，制备条件可控，可通过改变乳液制备条件方便快捷地调节多孔支架的孔结构，实现孔结构的设计与实现的统一；
（3）本发明制备的具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架，可通过编写不同的打印程序，对支架结构进行调控，便利地按照需求制备不同形状的支架，使其更好的满足实际应用中的需求；
（4）本发明制备的具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架，可用作组织工程支架或药物载体，所用材料生物可降解聚酯和疏水改姓二氧化硅纳米粒子，为常用的多孔支架制备原料，来源丰富，安全无毒，具有良好的生物相容性；其中生物可降解聚酯还具可生物降解性，在应用过程中可随着细胞的繁殖逐渐降解，为细胞的生长创造新空间，最终引导组织生长成为特定的形状；二氧化硅纳米粒子还具良好的生物活性和机械强度。
附图说明
图1为实施例1中制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此；其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将240mg聚乳酸和240mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将16mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相；
（3）将24ml蒸馏水分6批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器2800r/min涡旋混合乳化30min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(35*35*7mm)，共6层，每层平行均匀分布13条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；
（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置48小时，自然干燥，得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（500～700um），中孔（38～73um）以及小孔（1～10um），其扫描电镜图（如图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。
实施例2
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将320mg聚乳酸和320mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将20mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相；
（3）将24ml蒸馏水分6批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器2800r/min涡旋混合乳化30min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(35*35*9mm)，共8层，每层平行均匀分布13条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；
（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置72小时，自然干燥，得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（500～700um），中孔（30～75um）以及小孔（1～7um），其扫描电镜图（参见图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。
实施例3
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将40mg聚乳酸和40mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将3mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相；
（3）将32ml蒸馏水分5批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器1000r/min涡旋混合乳化15min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(40*40*7mm)，共6层，每层平行均匀分布15条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；
（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置48小时，自然干燥，得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（300～600um），中孔（30～88um）以及小孔（4～10um），其扫描电镜图（参见图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。
实施例4
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将280mg聚乳酸和280mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将20mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相；
（3）将40ml蒸馏水分4批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器2800r/min涡旋混合乳化30min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(38*38*7mm)，共6层，每层平行均匀分布14条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置64小时，自然干燥，得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（300～600um），中孔（41～100um）以及小孔（4～10um），其扫描电镜图（参见图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。
实施例5
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将280mg聚乳酸和280mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将32mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相。
（3）将32ml蒸馏水分7批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器2000r/min涡旋混合乳化20min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(35*35*9mm)，共8层，每层平行均匀分布13条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；
（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置48小时，自然干燥，得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架。
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（300～700um），中孔（30～68um）以及小孔（4～7um），其扫描电镜图（参见图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。
实施例6
一种具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将240mg聚乳酸和240mg聚己内酯加入8ml二氯甲烷中，在冰水浴中超声10min，使聚乳酸和聚己内酯完全溶解；
（2）将16mg疏水改性二氧化硅纳米粒子（粒径为20～30nm）加入步骤(1)得到的溶液中，在冰水浴中超声5min，分散均匀，配制得到油相；
（3）将24ml蒸馏水分5批加入油相，油水混合体系经涡旋混合器2000r/min涡旋混合乳化30min得到；
（4）将步骤（3）得到的乳液装入300cc的美式针筒中，并组装配套的美式活塞与内径为0.9mm的平头针头，在点胶机的系统内进行程序编辑，并通过点胶机将乳液打印为规整的立方体结构(35*35*12mm)，共10层，每层平行均匀分布13条圆柱状乳液，其中，奇数层呈横向分布，偶数层呈纵向分布；
（5）将步骤（4）得到的支架在室温下于通风橱中放置48小时，自然干燥得到具备多级可控通孔结构的纳米复合生物支架
制备的多级可控通孔结构的纳米复合生物支架具备多级孔结构，其中包括大孔（300～500um），中孔（34～85um）以及小孔（5～10um），其扫描电镜图（参见图1）所显示，制备得到的纳米复合生物支架具备连通孔结构，各孔之间由不同尺寸的孔喉进行连通。