一种新型包载雷公藤甲素和羟基喜树碱的多臂聚乙二醇纳米药物的制备方法与流程

本发明涉及了一种新型包载雷公藤甲素和羟基喜树碱的多臂聚乙二醇纳米药物的制备方法，特别是涉及一种利用多臂聚乙二醇与疏水药物的反应，同另一种疏水药物自组装形成纳米粒子的方法，属于先进纳米技术和生物制药领域。

背景技术：

雷公藤甲素（triptolide,tp）是中药雷公藤（tripterygiumwilfordiihook.f.）中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。由于雷公藤的生理活性强，具有显著的免疫抑制、抗炎、抗肿瘤和抗生育作用。但它属于毒性很强的药物，临床不良反应的发生频率远高于其它药物，主要发生在消化系统、泌尿系统、生殖系统、心血管系统、骨髓和血液系统。其中又以消化系统最为常见，主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻及消化道出血等。因此，研究新型的给药系统以降低其毒性具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型包载雷公藤甲素和羟基喜树碱的多臂聚乙二醇纳米药物的制备方法，该方法具有步骤简单，成本低，载药材料无毒，联合载药效果好的优点。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：多臂聚乙二醇与雷公藤甲素偶联，在自组装过程中包裹另一种抗癌药物羟基喜树碱，形成双载药系统的纳米粒子胶束。具体步骤如下：

（1）将多臂聚乙二醇分散于吡啶中，浓度为0.01-5毫克/毫升，磁力搅拌10-30分钟，使其溶解；

（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），激活羧基30分钟，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶（dmap）；

（3）取适量雷公藤甲素溶于吡啶，并转移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反应过夜，并连续通入氮气，去除酯化反应生成的水；

（4）向反应后的混合液中1:3（体积比）的比例加入无水乙醚，出现絮状沉淀，4000转离心30分钟，收集沉淀，继续用乙醚洗涤沉淀两次，离心收集固体沉淀；

（5）将上述所得固体沉淀溶于去离子水，用磷酸盐缓冲溶液透析12小时，并轻微搅拌透析外液，加快透析速度，每隔4小时更换透析外液；

（6）将上述透析物零下80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48小时，得到偶联物白色粉末；

（7）取上述粉末适量与羟基喜树碱共同溶于二甲基亚砜，搅拌均匀，然后缓慢滴入剧烈搅拌的去离子水中，自组装得到纳米粒子，将溶液8000转离心30分钟，收集沉淀物，重新分散在去离子水中，透析6小时，透析物零下80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48小时，得到白色粉末，即为多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物。

所述的多臂聚乙二醇可为单臂，四臂或八臂聚乙二醇，可以含不同的官能团，与不同拒水药物发生反应，且分子量2000~80000之间；

所述的不溶水药物雷公藤甲素依然适用于含反应功能基团的其它拒水药物，如熊果酸；

所述的包裹药物羟基喜树碱可以由其它疏水性强的药物替代，或者纳米级金属，纳米级金属氧化物；

所述的吡啶用四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷替代，其偶联方法仍然适用；

所述的纳米粒子粒径均一，且在10-100nm。

本发明具有以下优点：

1）本发明的反应机理是通过高分子化合物多臂聚乙二醇的羧基与雷公藤甲素的羟基发生酯化反应，得到多臂聚乙二醇药物偶联物。

2）本发明的自组装过程是通过反应到多臂聚乙二醇上的疏水药物基团的拒水作用，形成空心内核，多臂聚乙二醇的亲水端为外层，疏水药物羟基喜树碱为内核核心，自组装形成的两亲性纳米粒子，纳米粒子均一。

3）本发明针对运载两种疏水药物的设计，根据两种疏水药物的不同作用机制，可实现联合杀死肿瘤细胞。

4）本发明不需要高温高压等耗能设备，亦不需要复杂装置，所用化学试剂用量少，可回收，工艺简单，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明制备多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素的紫外图。

图2为本发明制备多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物的场发射电镜形貌图。

图3为本发明制备多臂聚乙二醇-雷公藤甲素雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物的扫描电镜形貌图。

具体实施方式

实施例一

（1）取多臂聚乙二醇1g，分散于20ml吡啶中，磁力搅拌30min，使其溶解；

（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），激活羧基30分钟，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶（dmap）；

（3）取0.5g雷公藤甲素溶于5ml吡啶，并转移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反应过夜，并连续通入氮气，去除酯化反应生成的水；

（4）向反应后的混合液中1:3（v/v）的比例加入无水乙醚，出现絮状沉淀，4000rpm离心30min，收集沉淀，继续用乙醚洗涤沉淀两次，离心收集固体沉淀；

（5）将上述所得固体沉淀溶于去离子水，用磷酸盐缓冲溶液透析12h，并轻微搅拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更换透析外液；

（6）将上述透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到偶联物白色粉末；

（7）取上述粉末0.1g与羟基喜树碱0.05g共同溶于2ml二甲基亚砜，搅拌均匀，然后缓慢滴入剧烈搅拌的去离子水中，自组装得到纳米粒子，将溶液8000rpm离心30min，收集沉淀物，重新分散在去离子水中，透析6h，透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物。

实施例二

（1）取多臂聚乙二醇0.5g，分散于10ml吡啶中，磁力搅拌20min，使其溶解；

（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），激活羧基30min，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶（dmap）；

（3）取0.1g雷公藤甲素溶于5ml吡啶，并转移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反应过夜，并连续通入氮气，去除酯化反应生成的水；

（4）向反应后的混合液中1:3（v/v）的比例加入无水乙醚，出现絮状沉淀，4000rpm离心30min，收集沉淀，继续用乙醚洗涤沉淀两次，离心收集固体沉淀；

（5）将上述所得固体沉淀溶于去离子水，用磷酸盐缓冲溶液透析12h，并轻微搅拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更换透析外液；

（6）将上述透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到偶联物白色粉末；

（7）取上述粉末0.01g与羟基喜树碱0.005g共同溶于0.5ml二甲基亚砜，搅拌均匀，然后缓慢滴入剧烈搅拌的去离子水中，自组装得到纳米粒子，将溶液8000rpm离心30min，收集沉淀物，重新分散在去离子水中，透析6h，透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物。

实施例三

（1）取多臂聚乙二醇2g，分散于30ml吡啶中，磁力搅拌30min，使其溶解；

（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），激活羧基30min，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶（dmap）；

（3）取0.5g雷公藤甲素溶于5ml吡啶，并转移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反应过夜，并连续通入氮气，去除酯化反应生成的水；

（4）向反应后的混合液中1:3（v/v）的比例加入无水乙醚，出现絮状沉淀，4000rpm离心30min，收集沉淀，继续用乙醚洗涤沉淀两次，离心收集固体沉淀；

（5）将上述所得固体沉淀溶于去离子水，用磷酸盐缓冲溶液透析12h，并轻微搅拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更换透析外液；

（6）将上述透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到偶联物白色粉末；

（7）取上述粉末0.1g与羟基喜树碱0.02g共同溶于二甲基亚砜1.5ml，搅拌均匀，然后缓慢滴入剧烈搅拌的去离子水中，自组装得到纳米粒子，将溶液8000rpm离心30min，收集沉淀物，重新分散在去离子水中，透析6h，透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物。

实施例四

（1）取多臂聚乙二醇1g，分散于20ml吡啶中，磁力搅拌30min，使其溶解；

（2）向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc），激活羧基30min，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶（dmap）；

（3）取0.3g雷公藤甲素溶于5ml吡啶，并转移到多臂聚乙二醇溶液中，35℃反应过夜，并连续通入氮气，去除酯化反应生成的水；

（4）向反应后的混合液中1:3（v/v）的比例加入无水乙醚，出现絮状沉淀，4000rpm离心30min，收集沉淀，继续用乙醚洗涤沉淀两次，离心收集固体沉淀；

（5）将上述所得固体沉淀溶于去离子水，用磷酸盐缓冲溶液透析12h，并轻微搅拌透析外液，加快透析速度，每隔4h更换透析外液；

（6）将上述透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到偶联物白色粉末；

（7）取上述粉末0.1g与羟基喜树碱0.01g共同溶于二甲基亚砜2ml，搅拌均匀，然后缓慢滴入剧烈搅拌的去离子水中，自组装得到纳米粒子，将溶液8000rpm离心30min，收集沉淀物，重新分散在去离子水中，透析6h，透析物-80℃冷冻过夜，并冷冻干燥48h，得到多臂聚乙二醇-雷公藤甲素（羟基喜树碱）纳米药物。