载多金属氧酸盐抗癌纳米制剂的制备的制作方法

本发明属于纳米药物领域，具体涉及针对多金属氧酸盐作为抗癌药物的局限性，利用生物相容材料对其进行包裹，从而制备出载多金属氧酸盐抗癌纳米制剂。

背景技术：

根据世界卫生组织(who)在2016年发布的《globecancer2016》显示出：癌症已经成为除心脑血管疾病以外的全球人类死亡的第一因素，发展能够更加有效地治疗癌症的手段，对促进人类健康具有重大意义。纳米药物的出现，为癌症治疗带来了新的希望。纳米载药系统是一种新型纳米级别的给药系统，用合成或天然的高分子材料作为载体，利用纳米技术对药物进行包裹或者修饰制得粒径在10～1000nm的药物输送系统。纳米载药系统的载体一般都具有体内长循环和靶向功能，因此，纳米载药系统在癌症治疗的发展中具有重大意义。

用于纳米载药系统的抗癌药物有多种，如阿霉素、多西紫杉醇等，本发明所用具有抗癌作用的药物是一种新型无机材料——多金属氧酸盐(poms)，它是由前过渡金属离子通过氧连接而形成的一类多金属氧簇化合物。它丰富的结构类型和巨大的抗癌潜力使其具有成为高效化疗药物的可能，但其水溶性差且在水相中不稳定，因而限制其在抗癌领域的应用。本发明利用具有生物相容性的材料对其进行包裹，再用靶向分子叶酸对纳米载体表面进行修饰，制备出可用于癌症治疗的新型纳米制剂，为新一代纳米体系发展提供基础，促进针对肿瘤治疗的研究发展。

技术实现要素：

为了克服多金属氧酸盐的抗癌应用局限性，本发明提供了一种载多金属氧酸盐抗癌纳米制剂及其制备方法。

载多金属氧酸盐抗癌纳米制剂是利用生物材料对多金属氧酸盐进行包裹制得纳米载体，再用靶向分子叶酸对纳米载体表面进行修饰；所用的生物材料为具有生物相容性的pla-peg2000及tpgs-cooh。所用多金属氧酸盐(poms)为[eu(h2o)3(p2w17o61)]2。

所述采用的技术方案是利用具有生物相容性的材料，采用单乳超声法对多金属氧酸盐进行包裹，再进行叶酸表面修饰，最终制备出具有体内长循环、疗效高、毒副作用小、稳定性好等功能的新型纳米制剂。

本发明的具体步骤为：

步骤1、生物材料tpgs-cooh的制备：

1)分别称取维他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，备用；

2)将步骤1)称取的药品混合溶于10ml二甲基亚砜中，室温下反应24小时；

3)步骤2)的反应过程会产生n，n-二环己基脲，通过过滤去除该副产物。将滤液转移进入透析袋，以二甲基亚砜为透析液，透析24小时去除未反应的dcc。冷冻干燥，得到tpgs-cooh；

步骤2、载多金属氧酸盐纳米载体的制备：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作为乳化剂，备用；

2)分别称取多金属氧酸盐25mg、pla-peg200050mg及步骤1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，备用；

3)轻柔搅拌下将步骤2)所得溶液缓慢倒入步骤1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超声波细胞粉碎机将步骤3)的混合溶液在25w条件下超声120s得到乳液，将该乳液在室温下搅拌过夜蒸发有机溶剂三氯甲烷，得到纳米粒子悬浮液；

5)将步骤4)得到的纳米粒子悬浮液在离心机上以10500rpm离心15min后得到纳米粒子；

6)用蒸馏水洗涤步骤5)得到的纳米粒子，并超声再次打碎，如此反复三次后可得到产物，并将其分散于水中，冻干两天得到纳米粉体。

步骤3、用叶酸对载多金属氧酸盐纳米载体表面进行修饰：

a、氨基化叶酸(fol-nh2)的制备：

1)分别称取叶酸(fol)441.4mg、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)230mg、n，n-二环己基碳二亚胺(edc)103mg，备用；

2)将步骤1)称取的药品混合溶于30ml二甲基亚砜中，50℃下反应6小时；

3)步骤2)的反应过程中会产生副产物n，n-二环己基脲，通过过滤去除该副产物；

4)在步骤3)所得的滤液中加入过量的乙二胺，以吡啶为催化剂，过夜反应；

5)在步骤4)反应完全的混合溶液中加入大量的乙腈将氨基化叶酸(fol-nh2)沉淀出来，离心收集，真空过滤后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化叶酸(fol-nh2)对载多金属氧酸盐纳米载体表面进行修饰：

1)称取步骤2所得的纳米粒子10mg分散于5ml蒸馏水中，超声30分钟；

2)在步骤1)所得溶液中以摩尔比为tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下反应2小时，激活纳米粒子表面的羧基端；

3)在步骤2)所得混合溶液中以摩尔比为tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步骤3)所得混合溶液中加三乙胺调节ph值至8，37℃下反应4个小时后进行离心；

5)用二甲基亚砜洗涤步骤4)离心得到的混合物，以去除未反应的fol-nh2，然后再用去离子水洗涤。冷冻干燥，得到表面经叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米制剂。

本发明利用具有生物相容性的材料对多金属氧酸盐进行包裹，再进行叶酸表面修饰，制得具有体内长循环、主动靶向、疗效高、毒副作用小等功能的新型纳米制剂，有效克服多金属氧酸盐水溶性差且在水相中不稳定的缺陷，进一步发挥多金属氧酸盐的抗癌作用，开阔其在生物领域的应用，为癌症治疗的纳米体系发展提供新的思路，促进针对癌症治疗的研究发展。

附图说明

图1为制备载多金属氧酸盐抗癌纳米制剂的过程图；

图2为载多金属氧酸盐纳米粒的sem检测图；

如图所示，多金属氧酸盐被生物材料包裹，制备的纳米粒子呈椭球状；

图3为载多金属氧酸盐纳米粒的粒径分布图；

如图所示，载多金属氧酸盐纳米粒粒径的平均尺寸在174.2nm；

图4为无叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米粒细胞毒性数据；

如图所示，制备出的无叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米制剂，通过细胞毒性实验，比较不同剂量不同时长下，癌细胞的存活率虽然呈现出降低趋势，但总体效果不明显；

图5为叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米粒细胞毒性数据；

如图所示，制备出经叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米制剂，通过细胞毒性实验，比较不同剂量不同时长下，癌细胞的存活率呈现出明显降低趋势，且在200μg/ml、24h时达到最低，不足1％；

由图4、图5，首先说明本发明所制备的纳米制剂具有抗癌作用，二者对比看出经叶酸修饰的纳米制剂具有良好的靶向作用，能够更好地靶向作用于癌细胞。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明。

实施例1

生物材料tpgs-cooh的制备：

1)分别称取维他命e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)757mg、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)103mg、戊二酸66mg，备用；

2)将步骤1)称取的药品混合溶于10ml二甲基亚砜中，室温下反应24小时；

3)步骤2)的反应过程会产生n，n-二环己基脲，通过过滤去除该副产物。将滤液转移进入透析袋，以二甲基亚砜为透析液，透析24小时去除未反应的dcc。冷冻干燥，得到tpgs-cooh；；

实施例2

载多金属氧酸盐纳米载体的制备：

1)配制60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液，作为乳化剂，备用；

2)分别称取多金属氧酸盐25mg、pla-peg200050mg及步骤1所得tpgs-cooh80mg混合溶于4ml的三氯甲烷中，备用；

3)轻柔搅拌下将步骤2)所得溶液缓慢倒入步骤1)的60ml含有0.5％聚乙烯醇水溶液中；

4)利用超声波细胞粉碎机将步骤3)的混合溶液在25w条件下超声120s得到乳液，将该乳液在室温下搅拌过夜蒸发有机溶剂三氯甲烷，得到纳米粒子悬浮液；

5)将步骤4)得到的纳米粒子悬浮液在离心机上以10500rpm离心15min后得到纳米粒子；

6)用蒸馏水洗涤步骤5)得到的纳米粒子，并超声再次打碎，如此反复三次后可得到产物，并将其分散于水中，冻干两天得到纳米粉体。

实施例3

用叶酸对载多金属氧酸盐纳米载体表面进行修饰：

a、氨基化叶酸(fol-nh2)的制备：

1)分别称取叶酸(fol)441.4mg、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)230mg、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)103mg，备用；

2)将步骤1)称取的药品混合溶于30ml二甲基亚砜中，50℃下反应6小时；

3)步骤2)的反应过程中会产生副产物n，n-二环己基脲，通过过滤去除该副产物；

4)在步骤3)所得的滤液中加入过量的乙二胺，以吡啶为催化剂，过夜反应；

5)在步骤4)反应完全的混合溶液中加入大量的乙腈将氨基化叶酸(fol-nh2)沉淀出来，离心收集，真空过滤后，放入真空干燥箱中烘干。

b、用氨基化叶酸(fol-nh2)对载多金属氧酸盐纳米载体表面进行修饰：

1)称取步骤2所得的纳米粒子10mg分散于5ml蒸馏水中，超声30分钟；

2)在步骤1)所得溶液中以摩尔比为tpgs-cooh/edc/nhs＝1∶20∶6.7加入nhs和edc，室温下反应2小时，激活纳米粒子表面的羧基端；

3)在步骤2)所得混合溶液中以摩尔比为tpgs-cooh/fol-nh2＝1∶10加入fol-nh2；

4)在步骤3)所得混合溶液中加三乙胺调节ph值至8，37℃下反应4个小时后进行离心；

5)用二甲基亚砜洗涤步骤4)离心得到的混合物，以去除未反应的fol-nh2，然后再用去离子水洗涤。冷冻干燥，得到表面经叶酸修饰的载多金属氧酸盐纳米制剂。