半胱氨酸双加氧酶、基因及其催化产物半胱亚磺酸的新用途的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种半胱氨酸双加氧酶，该酶的直接催化产物半胱亚磺酸，及该酶基因的新用途。

背景技术：

母乳是婴儿成长最自然、最安全、最完整的天然食物，为婴儿生长发育提供最佳的营养。调查发现，国内65.3％的哺乳期妇女为6月龄内的婴儿提供配方奶粉喂养，其中绝大多数(86.2％)是由于母乳不足(widespreadusageofinfantformulainchina：amajorpublichealthproblem，birth41(4)：339-343，2014)。人类乳腺发育不良致母乳不足对婴儿发育和人口质量具有长远影响。

另据研究表明，仔猪断奶前的生长速度及成活率与哺乳母猪乳腺发育程度密切相关，哺乳母猪泌乳不足是仔猪死亡的重要原因之一。山羊生产中也存在母羊泌乳不足造成羔羊发育不良和死亡的问题。对于奶牛，乳腺发育程度更是影响其乳产量和泌乳寿命的主要决定性因素。

半胱氨酸双加氧酶(cysteinedioxygenase，cdo)是一种非血红素类单亚铁核心离子金属酶，能催化半胱氨酸加一分子氧生成半胱亚磺酸(cysteinesulfinicacid，csa)。半胱亚磺酸在半胱亚磺酸脱羧酶(csad)作用下生成亚牛磺酸并进一步转化为牛磺酸。小鼠、大鼠、猪、牛和人的cdo基因结构、表达规律和功能高度相似，均由5个外显子构成，均编码200个氨基酸，其蛋白氨基酸序列同源性高于90％。已有报道cdo基因缺陷会引起自主免疫性疾病(abnormalsulphuroxidationinsystemiclupuserythematosus，lancet339(8784)：25-26，1992)和神经性疾病(阿兹海默症和帕金森综合症)(plasmacysteineandsulphatelevelsinpatientswithmotorneurone，parkinson′sandalzheimer′sdisease，neuroscilett110(1-2)：216-220，1990)。此外，cdo可能与肿瘤抑制相关(cysteinedioxygenase1isatumorsuppressorgenesilencedbypromotermethylationinmultiplehumancancers，plosone7(9)：e44951，2012；frequentinactivationofcysteinedioxygenasetype1contributestosurvivalofbreastcancercellsandresistancetoanthracyclines，clincancerres19(12)：3201-3211，2013)。

目前cdo相关的研究主要集中在牛磺酸的合成及牛磺酸的功能调控。cdo的直接催化产物半胱亚磺酸的生物学功能尚未见报道。尚未见半胱氨酸双加氧酶及其催化产物半胱亚磺酸与乳腺发育相关的研究和报道。

技术实现要素：

本发明提供一种半胱氨酸双加氧酶，该酶的直接催化产物半胱亚磺酸，及该酶基因的新用途，具体为半胱氨酸双加氧酶及其基因，以及其直接催化产物半胱亚磺酸与哺乳动物乳腺发育和泌乳相关，能够促进乳腺导管延伸和分枝，促进泌乳，可作为治疗乳腺发育不良的一种手段。

本发明采取的技术方案如下：

1.半胱氨酸双加氧酶基因、半胱氨酸双加氧酶或其催化产物半胱亚磺酸在制备促进乳腺导管发育的药物中的应用。

2.半胱氨酸双加氧酶基因、半胱氨酸双加氧酶或其催化产物半胱亚磺酸在制备促进泌乳的药物中的应用。

3.半胱氨酸双加氧酶基因、半胱氨酸双加氧酶或其催化产物半胱亚磺酸在制备预防或治疗乳腺发育不良的药物中的应用。

4.半胱氨酸双加氧酶基因、半胱氨酸双加氧酶或其催化产物半胱亚磺酸在制备促进乳腺导管延伸与分枝的药物中的应用。

5.半胱氨酸双加氧酶基因、半胱氨酸双加氧酶或其催化产物半胱亚磺酸在制备促进乳腺腺泡发育的药物中的应用。

优选的，所述药物以哺乳动物为治疗对象。

优选的，所述哺乳动物为人、猪、牛、绵羊、山羊、小鼠或大鼠。

本发明的有益效果在于：本发明通过将雌性小鼠cdo基因敲除后发现乳腺导管系统发育严重受损，由于乳腺发育不良导致泌乳不足，所育后代发育受阻或死亡；而为青春期cdo基因敲除雌鼠补充cdo的直接催化产物半胱亚磺酸后，其乳腺导管系统发育得到部分恢复。对野生型小鼠(cdo未敲除)，补充一定剂量半胱亚磺酸后乳腺导管发育明显加快(导管延伸加快、分枝增多)。本发明的研究表明，cdo通过其催化产物半胱亚磺酸促进哺乳动物乳腺导管系统发育，为乳腺发育不良的预防和治疗及提高哺乳动物泌乳能力提供了新的思路。

附图说明

图1为cdo蛋白在小鼠各组织器官及乳腺中的westernblot分析结果；a图中1-9依次为cdo蛋白在心脏、肝脏、脾、肺、肾、下丘脑、垂体、卵巢、乳腺中的相对表达量；b图中1-7依次为小鼠在21日龄、6周龄、12周龄、妊娠14.5天、泌乳第一天、泌乳第7天、乳腺退化期的cdo蛋白相对表达水平；

图2为cdo基因敲除小鼠信息；图中a为cdo基因结构及cas9n靶点示意图；b图为试验中采用的cdo突变小鼠dna测序结果(cdo基因编码区dna序列缺失83bp，从编码区第42位至第124位碱基缺失)；c图为cdo突变小鼠dnasanger测序峰图；d图为cdo基因突变小鼠乳腺cdo蛋白表达验证(cdo和csad抗体来自abcam公司)；

图3cdo敲除(cdo^-/-)及野生型(cdo^+/+)雌性小鼠乳腺全组织染色结果；具体为21日龄(21day)、6周龄(6week)、12周龄(12week)野生型(cdo^+/+)小鼠和cdo敲除(cdo^-/-)小鼠乳腺全组织染色结果；

图4半胱亚磺酸(csa)、牛磺酸(taurine)及半胱氨酸盐酸盐(cysteine-cl)对乳腺导管发育的影响。

图5为半胱亚磺酸(csa)促进野生型小鼠乳腺导管延伸和分枝染色结果。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

相关哺乳动物cdo基因mrna序列ncbi登录号：

小鼠cdo基因mrna序列ncbi登录号nm_033037；

大鼠cdo基因mrna序列ncbi登录号nm_052809；

人cdo基因mrna序列ncbi登录号nm_001323565、nm_001801、nm_001323566、nm_001323567；

牛cdo基因mrna序列ncbi登录号nm_001034465；

山羊cdo基因mrna序列ncbi登录号xm_005685043；

绵羊cdo基因mrna序列ncbi登录号xm_015096777；

猪cdo基因mrna序列ncbi登录号nm_001167643。

实施例1

采用westernblot方法对6周龄雌性小鼠各组织器官中cdo蛋白表达量进行相对定量分析，实验结果表明cdo在乳腺中高表达(表达量仅次于肝脏)，而在下丘脑、垂体和卵巢等内分泌器官中表达量很低(图1中a图)；与现有相关报道吻合。对不同发育期雌性小鼠乳腺组织中cdo蛋白进行westernblot定量分析发现，在各发育期乳腺组织中cdo蛋白表达量呈明显规律性变化。在青春期到成年发育期间(3周龄-12周龄，此时乳腺导管快速延伸并大量分枝)乳腺中cdo呈现高水平表达，而在妊娠期和泌乳期(此时乳腺腺泡大量分化)乳腺中cdo表达量显著降低，而泌乳期结束后乳腺退化期(此时乳腺腺泡退化，乳腺逐渐恢复到妊娠前状态)cdo蛋白又重新恢复到妊娠前的表达水平(图1中b图)。cdo蛋白在乳腺导管延伸和分枝发育期高表达，而乳腺腺泡发育期低表达的规律恰好符合乳腺“未孕-怀孕-泌乳-退化”的循环发育规律，提示cdo可能与乳腺导管延伸与分枝密切相关。

实施例2

为了揭示cdo对乳腺发育的调控作用，我们利用crispr/cas9技术，在cdo基因第一外显子编码区设置两个反向缩短的sgrna靶点(图2中a图)配合cas9n(d10a)切刻酶，避免了脱靶的发生。利用t7转录试剂盒(mmessagemachinet7kit，life公司)合成cas9n基因mrna，利用t7高效转录试剂盒(hiscribe^tmt7highyieldrnasynthesiskit，neb)合成两个sgrna。通过小鼠受精卵显微注射cas9nmrna(60ng/μl)和两个sgrna(20ng/μl)并胚胎移植获得cdo基因移码突变小鼠(图2中b图和c图)。经扩繁获得纯合突变(cdo基因敲除)个体，通过westernblot验证cdo敲除小鼠乳腺中cdo蛋白表达缺失(图2中d图)。

实施例3

经过仔细观察发现cdo基因敲除雌鼠所育后代发育不良，且不能存活，但将其后代寄养于哺乳期野生型(cdo未敲除)雌鼠后正常存活，并健康发育。说明cdo基因敲除雌鼠泌乳不足至后代发育不良并死亡。进一步进行乳腺全组织染色，实验步骤包括：采集小鼠第四对乳腺在玻片上铺平，于卡诺固定液(酒精∶氯仿∶冰醋酸＝6∶3∶1体积比)中固定过夜，然后在体积分数70％的酒精中平衡5分钟，置于醋酸洋红染液中染色2小时，酒精梯度(80％-90％-95％-100％)脱水(每级10分钟)，二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。染色结果见图3，结果表明，同窝的野生型(cdo^+/+)雌鼠乳腺发育正常，而cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠乳腺导管延伸明显变慢，而且分枝也显著减少。

实施例4

根据半胱氨酸代谢途径分析，cdo敲除后，一方面会导致半胱亚磺酸(csa)和牛磺酸(taurine)合成障碍，另一方面半胱氨酸(cysteine)向下代谢受阻而在细胞中积累。课题组分别对青春期cdo基因敲除(cdo^-/-)和野生型(cdo^+/+)雌鼠通过腹腔注射补充半胱亚磺酸(csa)、牛磺酸(taurine)或过量的半胱氨酸盐酸盐(cysteine-cl)，分析这些物质对乳腺发育的影响。具体方法为：对21日龄至35日龄cdo敲除(cdo^-/-)雌鼠通过腹腔注射csa(100mg/kg体重/天)或taurine(100mg/kg体重/天)；对21日龄至35日龄野生型(cdo^+/+)雌鼠通过腹腔注射质量分数0.8％nacl(每天0.2ml对照)、taurine(100mg/kg体重/天)、csa(100mg/kg体重/天)或cysteine-cl(200mg/kg体重/天)后乳腺全组织染色(染色步骤同实施例3)；csa、taurine和cysteine-cl分别用0.8％的nacl溶解。结果见图4，连续补偿csa(从21日龄～35日龄，100mg/kg体重/天)，不但能明显改善cdo基因敲除雌鼠乳腺导管发育不良的问题，而且也显著促进野生型小鼠乳腺导管的延伸和分枝发育，而牛磺酸对照处理并无明显变化；过量的半胱氨酸盐酸盐(200mg/kg体重/天，从21日龄～35日龄)处理，也不影响野生型雌鼠乳腺导管发育。以上结果表明cdo主要通过其下游产物半胱亚磺酸调控乳腺导管发育。

实施例5

为了进一步验证半胱亚磺酸促进乳腺导管发育的功能，课题组对21日龄至42日龄野生型(cdo^+/+)小鼠每天通过腹腔注射补充半胱亚磺酸(100mg/kg体重)或对照处理(质量分数0.8％nacl)，43日龄采集第四对乳腺组织进行全组织染色。结果见图5，图的结果表明csa处理小鼠相对于对照组(质量分数0.8％nacl)，乳腺导管延伸明显加快、分枝显著增多，csa能显著促进野生型小鼠乳腺导管延伸和分枝发育。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。