汉黄芩素在制备治疗肾细胞癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及汉黄芩素在制备治疗肾细胞癌药物中的应用，属于药物开发技术领域。

背景技术：

随着人们生活方式和生活环境的改变，癌症的发病率和死亡率均呈上升趋势，已成为导致人口死亡的重要原因，也是世界性的热点健康问题。肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占所有恶性肿瘤的3％，且近年来其发病率呈上升趋势。据世界癌症中心资料显示，2015年美国预测新发的肾癌患者人数为61,560，肿瘤特异性死亡患者数目也高达14,080。我国肾癌的患病人数也逐年增加，成为泌尿男生殖系第二位肿瘤。

肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)起源于肾实质肾小管上皮细胞，发病率高，大约90％的肾脏癌为rcc。rcc对于传统的放疗、化疗并不敏感，因此对于rcc尤其是中晚期转移性rcc，免疫治疗和靶向药物治疗已成为各大指南推荐的治疗策略。尤其随着分子遗传学的发展，越来越多的分子信号通路被发现在rcc中行使着重要的功能。在此基础上，美国、欧洲以及中国批准了越来越多的靶向酪氨酸激酶的抑制剂药物如舒尼替尼、索拉非尼等用于治疗晚期转移性rcc。因为患者通过免疫治疗获益极其有限，所以靶向治疗已成为晚期肾癌的一线治疗手段。然而，随着分子靶向药物的应用，靶向药物的耐药性问题严重影响了rcc治疗的疗效。在精准医疗的时代背景下，患者基因检测指导下的个体化靶向用药也不能很好的解决晚期肾细胞癌患者靶向耐药的问题。因此，靶向治疗和免疫治疗在晚期肾细胞癌的治疗中疗效有限，并且毒副作用较大、价格昂贵。所以寻找新药物，开发新疗法成为肾癌治疗的重点研究方向。

中药在恶性肿瘤的治疗中表现出一定的效果，并且毒副作用较小。从有效抗肿瘤传统中药中分离得到活性天然化合物是抗肿瘤新药研发的重要手段之一。唇形科(labiatase)植物黄芩是我国一味常用中药。汉黄芩素是黄芩及同属相应植物根中提取的黄酮类化合物，是黄芩药物有效成分之一。研究已表明汉黄芩素具有抗炎、抗氧化，抗病毒等多方面的生物活性。

此外，汉黄芩素在胃癌中可以通过增加细胞内活性氧的含量，诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤周围新生血管生成以及逆转化疗药物的耐药等多种方式发挥抗肿瘤的功能。

但由于不同癌细胞的发病机制不相同，汉黄芩素在是否能够调控肾细胞癌以及分子机制尚不清楚。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供汉黄芩素在制备治疗肾细胞癌药物中的应用，具体涉及汉黄芩素在制备肾细胞癌临床药物中的医学用途。

本发明技术方案如下：

汉黄芩素在制备治疗肾癌药物中的应用。

上述汉黄芩素通过引起肾细胞癌细胞dna复制障碍，诱发dna损伤，诱导细胞凋亡。

根据本发明的某些实施方式，所述肾癌是肾细胞癌。

根据本发明的某些实施方式，所述汉黄芩素的给药浓度是1～100μm。

除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。

汉黄芩素(wogonin)，又名5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4h-1-苯并呋喃-4-酮。常温下为黄色针状结晶物，不溶于水，易溶于有机溶剂，例如乙醇、丙酮等。汉黄芩素是从黄芩的根中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、降血脂、抗血栓形成等作用。

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，包括肾细胞癌、肾母细胞瘤及肾盂癌等

肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)，又称为肾腺癌，是肾癌最常见的病理类型，约占肾癌的80％～85％。rcc是起源于肾实质肾小管上皮细胞的恶性肿瘤。rcc对于传统的放疗、化疗并不敏感。

中药治疗肿瘤具有改善病情、延长缓解期、副作用小，远期疗效好且费用低廉等特点，彰显出了独特的优势。

肾细胞癌研究中，经常使用人肾细胞癌细胞株786-o和os-rc-2细胞来分析基因或药物对肾细胞癌细胞肿瘤特性的影响。而作为对照，正常人胚肾上皮细胞系hek293细胞则常用以比较药物对肾癌以及正常肾细胞的毒性差异，以评估肿瘤药物的毒副作用。

根据本发明的某些实施方式，所述汉黄芩素的给药浓度是1-100μm，例如1-90μm、1-80μm、1-70μm、1-60μm、1-50μm、1-40μm、1-30μm、1-20μm、1-10μm、5-100μm，5-90μm、5-80μm、5-70μm、5-60μm、5-50μm、5-40μm、5-30μm、5-20μm、5-10μm、10-100μm、10-90μm、10-80μm、10-70μm、10-60μm、10-50μm、10-40μm、10-30μm、10-20μm、20-100μm、20-90μm、20-80μm、20-70μm、20-60μm、20-50μm、20-40μm、20-30μm、30-100μm、30-90μm、30-80μm、30-70μm、30-60μm、30-50μm、30-40μm、40-100μm、40-90μm、40-80μm、40-70μm、40-60μm、40-50μm、50-100μm、50-90μm、50-80μm、50-70μm、50-60μm、60-100μm、60-90μm、60-80μm、60-70μm、70-100μm、70-90μm、70-80μm、80-100μm、80-90μm、或90-100μm。根据本发明的某些实施方式，所述汉黄芩素的给药浓度是1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、或100μm。

药物组合物和药盒

术语“药物组合物”表示含有治疗有效量的一种或多种所述化合物及其药学上可接受的互变异构体、溶剂合物、水合物或盐，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向对象给药。

本申请中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本申请公开了包含治疗有效量的所述治疗剂或药物组合物的药盒。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的治疗剂。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。

本发明中汉黄芩素可将其制备成药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、口服剂、冲剂、注射剂、脂质体、靶向给药注射剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂等。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的ph通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。

术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予对象。

所述“给药方式”包括但不限于口服给药、静脉内给药、呼吸道内给药、舌下给药、局部给药、肌肉内给药、眼内给药、透皮吸收、胃肠外给药、腹膜内给药、阴道给药、颊部给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式取决于多个因素，所述因素包括疾病的位置、对象的年龄、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。

在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。

除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

有益效果

本发明首次公开了汉黄芩素作为治疗肾细胞癌药物的应用。实验结果证实，异常快速dna复制以及细胞增殖是肿瘤的重要特征之一，抑制dna复制可导致肿瘤细胞dna损伤，诱导肿瘤细胞凋亡。汉黄芩素能够有效抑制肾细胞癌细胞dna复制和增殖，抑制细胞侵袭和迁移，诱导细胞dna损伤，诱发细胞凋亡。汉黄芩素的作用机制与特异性抑制肾细胞癌细胞内cdc6蛋白的表达有关。汉黄芩素在肾细胞癌治疗中的应用前景广泛，也为肾细胞癌的治疗提供了更多的药物选择。

附图说明

图1显示了汉黄芩素对肾细胞癌的生长具有抑制作用；

其中：图1(a)显示了mtt实验结果显示汉黄芩素对体外培养的肾细胞癌细胞生长具有抑制作用；

图片中的数据是3次平行实验的结果，每次实验设定5个重复孔，使用t检验，*表示p≦0.05；**表示p≦0.01；

图1(b)显示了汉黄芩素对体内裸小鼠人肾细胞癌移植瘤的生长具有抑制作用；

图中的数据是5只小鼠重复结果，使用t检验，*表示p≦0.05；**表示p≦0.01；

图2显示了transwell实验结果表明汉黄芩素对体外培养的肾细胞癌细胞的侵袭具有抑制作用；

图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验随机选取3个视野计数，每个视野细胞数大于200个；结果使用t检验，**表示p≦0.01；

图3显示了汉黄芩素抑制肾细胞癌细胞的dna复制，诱导dna损伤；

其中：图3(a)显示了edu实验结果表明汉黄芩素抑制肾细胞癌细胞dna复制效率；

图3(b)显示了彗星实验结果显示汉黄芩素诱导肾细胞癌细胞dna损伤增加；

图4显示了汉黄芩素能够诱导肾细胞癌细胞的凋亡；

其中：图4(a)显示了tunel实验结果表明汉黄芩素能够诱导肾细胞癌细胞凋亡；

图4(b)显示了免疫印迹实验(westernblot)结果表明汉黄芩素能明显增加活化半胱天冬酶(caspase)3的表达；

图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验随机选取3个视野计数，每个视野细胞个数大于200个；结果使用t检验，**表示p≦0.01。

图5显示了汉黄芩素能够通过特异性降低肾细胞癌细胞内cdc6蛋白的表达实现对肾细胞癌dna复制的抑制作用；

图中的数据是3次平行实验的结果，每次实验随机选取3个视野计数，每个视野细胞数大于200个；结果使用t检验，**表示p≦0.01，#表示p≦0.05；

其中：图5(a)显示了免疫印迹实验(westernblot)结果表明汉黄芩素能明显降低肾细胞癌细胞内cdc6蛋白的表达；

图5(b)显示了免疫印迹实验(westernblot)结果表明汉黄芩素不降低人肺癌、胰腺癌、肝癌以及胃癌细胞内cdc6蛋白的表达；

图5(c)转染外源cdc6表达质粒能有效拯救汉黄芩素导致肾细胞癌细胞内cdc6蛋白表达的降低；

图5(d)显示了edu实验结果表明汉黄芩素通过抑制肾细胞癌细胞内cdc6蛋白表达实现对肾细胞癌细胞dna复制效率的抑制。

具体实施方式

以下结合具体实例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不局限于这些实例。

实施例1：汉黄芩素对体外培养的肾细胞癌细胞的生长具有抑制作用

本实施例表明汉黄芩素对体外培养的肾细胞癌细胞的生长具有抑制作用。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o和os-rc-2细胞。

汉黄芩素购自上海源叶生物科技有限公司(产品号zcx-00023510-005)，将其溶于dmso中配制成0.1m(mol/l)的母液并于-20℃贮藏。mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(产品号c0009)。人胚肾上皮细胞hek293(产品号gnhu-43)、人肾透明细胞腺癌细胞786-o(产品号tchu186)和os-rc-2(产品号tchu40)细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞培养均使用rpmi-1640培养基(美国gibco公司，产品号11875127)添加10％(v/v)胎牛血清(美国gibco公司，(产品号1099141)，并加入100u/ml的青霉素和100mg/ml链霉素。所有的细胞均以37℃、co2分压为5％(体积百分数)的条件培养。

噻唑蓝(mtt)实验：将处于对数生长期的hek293、786-o和os-rc-2细胞以10×10⁴/ml细胞浓度接种入96孔细胞培养板内，每孔100μl，设5复孔，置于37℃，5％co2孵箱内培养24小时左右，再分别加入终浓度为含5、10、20、40、60、80μm汉黄芩素的rpmi-1640完全培养基，加入0.1％(体积分数)dmso处理的细胞设为对照组。孵育48小时后，每孔加入20μl5mg/ml的mtt工作液。摇匀后将培养板放回37℃，5％co2培养箱中继续培养4-6小时后，将含mtt工作液的上清小心移除，每孔加入100μl二甲基亚砜溶液，将培养板放入37℃，5％co2培养箱中孵育，待紫色结晶全部溶解且溶液透明度均一后(约20分钟)，于多功能酶标仪570nm波长处测定吸光度值(od)，以od值计算细胞存活率。

细胞存活率＝(试验组细胞od值-空白组细胞od值)/(对照组细胞od值-空白组细胞od值)×100％；

结果如图1(a)所示，汉黄芩素能够显著抑制肾细胞癌细胞的生长，如20μm汉黄芩素处理786-o细胞48小时后，与未加入汉黄芩素处理786-o细胞相比，细胞活力减少了约45％；40μm汉黄芩素处理48小时后，细胞活力减少了约77％；60μm汉黄芩素处理48小时后，细胞活力减少了约83％。与786-o细胞类似，汉黄芩素处理也可导致os-rc-2细胞的活力有明显下降。与未加入汉黄芩素处理os-rc-2细胞相比，40μm汉黄芩素处理48小时后，细胞活力减少了约30％；60μm汉黄芩素处理48小时后，细胞活力减少了约55％；80μm汉黄芩素处理48小时后，细胞活力减少了约70％。

然而，与汉黄芩素可明显抑制肾细胞癌细胞生长的特点形成对比，汉黄芩素对正常肾上皮生长抑制作用较弱。结果如图1(b)所示，20-60μm汉黄芩素处理48小时后，其细胞活力与未处理hek293细胞相比，没有差别。而80μm汉黄芩素处理48小时后，与未处理细胞相比，处理后的hek293细胞活力仅仅降低20％。

这些结果表明汉黄芩素对体外培养的肾细胞癌细胞的生长有特异性的抑制作用，并且该抑制作用呈现出显著的浓度依赖性。

实施例2：汉黄芩素对体内裸小鼠人肾细胞癌移植瘤的生长具有抑制作用

本实施例表明汉黄芩素对体内裸小鼠人肾细胞癌移植瘤的生长具有抑制作用。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞os-rc-2细胞。os-rc-2细胞具有较强的体内成瘤能力，是体内实验分析肾细胞癌细胞生长能力的重要模型。

裸鼠为雌性balb/c裸小鼠，限公周龄4-6周，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(品系编码211)。在12小时日照，温度为23±2℃，湿度为55±5％的条件下饲养，同时给与啮齿类动物标准饲养的水与饲料。将含1×10⁶个对数生长期os-rc-2细胞的100μl的pbs注射入裸鼠背部右侧侧翼部皮肤皮下，接种3天后，称重并分组。

设汉黄芩素处理组(40mg/kg)和对照处理组(生理盐水)。每组动物均为5只，进行腹腔注射给药，隔日注射一次，连续给药3周。小鼠给药3周后用脊髓脱臼法处死，小心剥下肿瘤组织，用无菌去离子水冲洗后用吸水纸吸除表明水分，统计肿瘤重量以及肿瘤体积。

结果如图1(c)所示，与对照处理组相比，汉黄芩素处理组肿瘤的重量和体积分别下降了约50％和60％。

这些结果说明汉黄芩素能够显著抑制小鼠体内肾细胞癌细胞的生长。

实施例3：汉黄芩素对肾细胞癌细胞的侵袭具有抑制作用

本实施例表明汉黄芩素对肾细胞癌细胞的侵袭具有抑制作用。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o和os-rc-2细胞。

含有matrigel基质的transwell小室购自美国康宁(corning)公司(产品号354480)，结晶紫染液购自购自碧云天生物技术有限公司(产品号c0121)。

侵袭检测实验：细胞培养的方法同实施例1。选取对数生长期细胞，加入不同浓度汉黄芩素处理24小时，胰酶消化收取细胞沉淀，pbs清洗3次后用无血清培养基重悬，调整至5×10⁵个/毫升，取200μl接种在transwell系统的上室中，设置3个复孔。transwell下室中加入600μl的含10％fbs的培养基作为趋化因素，避免产生气泡；将孔板放置在37℃、5％co2培养箱中培养36小时；用棉棒轻轻擦去transwell小室滤膜上表面的细胞，再将transwell小室放入甲醇中固定20min，pbs漂洗3次去除甲醇，加结晶紫染液染色30min，流水洗至不再脱色，常温晾干；显微镜下拍照，每个transwell小室随机选取大约10个视野进行拍照，然后计数染色细胞。结果如图2所示，汉黄芩素处理显著降低了穿过含基质胶的滤膜的细胞数，并且随汉黄芩素浓度增加，穿过滤膜的细胞数呈现减少趋势，如20μm汉黄芩素处理786-o细胞24小时后，与未加入汉黄芩素处理细胞相比，786-o细胞侵袭能力降低了约49％；40μm汉黄芩素处理24小时后，786-o细胞侵袭能力降低了约71％。与之类似，黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞的侵袭能力也有明显下降。与未加入汉黄芩素处理os-rc-2细胞相比，40μm汉黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞侵袭能力降低了约55％；80μm汉黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞侵袭能力降低了约90％。

这些结果表明汉黄芩素能够有效抑制肾细胞癌细胞的侵袭能力，且抑制作用呈现浓度依赖性。

实施例4：汉黄芩素能够抑制肾细胞癌细胞dna复制

本实施例表明汉黄芩素能够抑制肾细胞癌细胞dna复制。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o和os-rc-2细胞。

细胞免疫染色固定液购自碧云天生物技术有限公司(产品号p0098)，edu细胞增殖检测试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司(产品号c10310-1)。抗淬灭剂购自invitrogen公司(产品号p36931)。彗星实验试剂盒购自trevigen公司(产品号4250-050-k)。

edu细胞增殖检测：细胞培养同实施例1。选取对数生长期细胞，os-rc-2细胞分别加入40和80μm汉黄芩素，786-o细胞分别加入20和40μm汉黄芩素，处理24小时后，加入edu后放置在37℃、5％co2培养箱中培养20分钟，pbs清洗一遍。使用细胞免疫染色固定液4℃固定过夜，进行edu染色。加入含dapi的抗淬灭剂，荧光显微镜拍照。

结果如图3(a)所示，汉黄芩素处理显著降低了edu掺入阳性细胞的比例。并且随汉黄芩素浓度增加，edu掺入阳性细胞的比例呈现减少趋势。如未处理786-o细胞edu掺入比例约为38％，20μm汉黄芩素处理24小时后，786-o细胞edu掺入比例降低至约24％；40μm汉黄芩素处理24小时后，786-o细胞edu掺入比例降低至约15％。与之类似，黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞的edu掺入比例也有明显下降。未处理os-rc-2细胞edu掺入比例约为47％，40μm汉黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞edu掺入比例降低至约28％；80μm汉黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞edu掺入比例降低至约13％。

这些结果表明汉黄芩素能够有效抑制肾细胞癌细胞的dna复制能力，且其抑制作用呈现浓度依赖性。

实施例5：汉黄芩素能够诱导细胞dna损伤

本实施例表明汉黄芩素能够诱导细胞dna损伤。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o和os-rc-2细胞。

彗星电泳实验：细胞培养同实施例1。选取对数生长期的786-o和os-rc-2细胞，加入30μm汉黄芩素处理24小时，胰酶消化收取细胞沉淀，用pbs重悬并调整至1×10⁵个/毫升。在37℃的环境中将1μl吹匀后的细胞悬液混入50μl的低熔点琼脂糖凝胶液并滴加至带有圆形标记的载玻片上并涂匀。将载玻片胶面向上，置于湿盒放入4℃避光处10-30分钟。将载玻片胶面向上浸入预冷的dna裂解液中，置于4℃避光处60分钟。然后于4℃避光处浸入50ml预冷中性电泳液30分钟，以洗脱裂解液。将载玻片胶面向上，浸入电泳液，4℃避光放置5分钟；4℃避光环境，以电极间距(cm)×1v的恒压电泳1小时；将载玻片没入dna沉淀液，室温放置30分钟；弃dna沉淀液，加入70％乙醇，室温放置30分钟；在烘箱中以小于45℃的温度烘烤玻片10-15分钟至其完全干燥以将细胞置于同一层面。每个样品滴加约100μl的green工作液(购自thermofisher公司，产品号s7567)，避光放置30分钟。将玻片竖立以弃掉多余染液，避光放置至其干燥。荧光显微镜观察并拍照，使用casp软件分析数据。

结果对彗星细胞的尾长度进行采集并作为损伤评估参数。彗星头部中心到彗星尾部重力中心的距离即为彗星尾长度，细胞内的断裂点越多，彗星尾长度就会越大。结果以箱型图表示每组细胞彗星尾长度(尾距)的分布情况。

结果如图3(b)所示，汉黄芩素处理组细胞的彗星尾长度均值较对照组相比有明显增加。未处理os-rc-2细胞尾距为36μm％，30μm汉黄芩素处理24小时后，os-rc-2细胞尾距上升至326μm％；30μm汉黄芩素处理24小时后，786-o细胞的尾距也由未处理前的7.3μm％上升至92μm％。这些结果表明汉黄芩素处理能够显著增加肾细胞癌细胞的dna损伤。

实施例6：汉黄芩素能够诱导肾细胞癌细胞凋亡

本实施例表明汉黄芩素能够诱导肾细胞癌细胞凋亡。由于上述研究发现汉黄芩素对786-o细胞杀伤作用更明显，因此在本实施例中，所用肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o细胞。

一步法tunel细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)购自碧云天生物技术有限公司(产品号c1089)。活性半胱天冬酶3(产品号ab32042)、parp(产品号ab32561)以及肌动蛋白(actin，产品号ab8227)一抗以及hrp标记的二抗均购自abcam公司(产品号ab6721)。ecl发光检测液(产品号wbkls0100)以及pvdf膜(产品号ipvh00010)购自美国密理博公司。蛋白酶抑制剂购自thermofisher公司(产品号88266)。蛋白裂解液、蛋白加样缓冲液(loadingbuffer)以及bca蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(产品号分别为p0013c，p0015f，p0009)。蛋白标记物(marker)购自thermofisher公司(产品号26623)。

tunel法检测细胞凋亡：细胞培养同实施例1。选取对数生长期786-o细胞，分别加入20和40μm汉黄芩素处理24小时，pbs洗一遍，加入免疫染色固定液室温固定20分钟。弃固定液，pbs洗2次，加入0.5％tritonx100的pbs室温处理30分钟。弃上清，pbs洗2次，将20μl新鲜配制的tunel染色液滴加到细胞爬片上，37℃避光孵育60分钟，加入含dapi的抗淬灭剂，使用荧光显微镜观察拍照。

结果如图4(a)所示，未处理786-o细胞凋亡比例仅为2.1％，20μm汉黄芩素处理24小时后凋亡细胞比例上升至18.2％，而40μm汉黄芩素处理24小时后凋亡细胞比例为36.8％。该结果表明汉黄芩素能够诱导肾细胞癌细胞凋亡，且诱导凋亡作用呈现浓度依赖性。

免疫印迹(westernblot)法检测细胞凋亡标志物的表达：选取对数生长期os-rc-2以及786-o细胞，加入不同浓度汉黄芩素处理24小时，pbs洗一遍，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液重悬细胞，冰上放置20分钟，其间震荡悬液充分裂解细胞。将细胞裂解液4℃12000rpm离心30分钟，上清液为细胞总蛋白。采用bca法定量蛋白浓度。将40μg总蛋白量的处理样品加入加样缓冲液混匀，99℃变性10min，进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后将蛋白转移到pvdf膜。转膜完毕，用5％脱脂奶粉的tbs室温封闭1小时。弃封闭液，用tbst将pvdf膜漂洗干净，加入用tbst稀释的一抗4℃孵育过夜。用tbst清洗3次后加入用tbst稀释二抗室温震荡反应1h。反应结束后弃二抗，用tbst清洗3次，加入ecl发光液检测凋亡相关蛋白的表达，以肌动蛋白为内参。

结果见图4(b)，汉黄芩素导致细胞内凋亡标志物活性半胱天冬酶3、parp的表达升高，并且表达量随汉黄芩素浓度的增加逐步上调。这些结果进一步表明汉黄芩素诱导肾细胞癌细胞凋亡，且诱导作用呈浓度依赖性。

实施例7：汉黄芩素能够特异性抑制肾细胞癌细胞dna复制相关蛋白cdc6的表达

本实施例表明汉黄芩素能够特异性抑制肾细胞癌dna复制相关蛋白-细胞分裂周期蛋白6(celldivisioncycle6,cdc6)的表达。在本实施例中，所述肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o和os-rc-2细胞，肺腺癌细胞为h1299细胞，肝癌细胞为hepg2细胞，胃癌细胞为sgc-7901细胞，人胰腺癌细胞为panc-1细胞。

细胞培养同实施例1。免疫印迹(westernblot)法检测细胞同实施例6。人肺癌细胞为h1299(产品号tchu160)细胞，人肝癌细胞为hepg2(产品号tchu72)细胞，人胰腺癌细胞为panc-1(产品号tchu98)细胞，人胃癌细胞为sgc-7901(产品号tchu46)细胞，均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。cdc6抗体(产品号ab109315)购自abcam公司。

cdc6蛋白是dna复制的关键蛋白，在多种肿瘤的表达增加。抑制cdc6的表达可抑制肿瘤细胞的dna复制。结果见图5(a)，汉黄芩素处理导致人肾透明细胞癌细胞786-o和os-rc-2内cdc6蛋白表达量明显降低，并且表达量随汉黄芩素浓度的增加逐步减少。表明汉黄芩素可以抑制肾细胞癌细胞内cdc6的表达，且抑制作用呈浓度依赖性。

为了进一步分析汉黄芩素抑制cdc6的表达是否存在肿瘤特异性，发明人又分析了汉黄芩素对人肺癌细胞h1299，人肝癌细胞hepg2，人胰腺癌细胞panc-1以及人胃癌细胞sgc-7901内cdc6表达的影响。结果见图5(b)，与肾细胞癌细胞不同，80μm汉黄芩素处理并不能导致cdc6蛋白在这几种细胞内表达降低，表明汉黄芩素抑制cdc6的表达具有肾细胞癌特异性。

实施例8：汉黄芩素通过抑制cdc6的表达实现对肾细胞癌细胞dna复制的抑制作用

本实施例表明汉黄芩素能够通过抑制cdc6的表达实现抑制肾细胞癌细胞dna复制的功能。由于上述研究发现汉黄芩素对786-o细胞dna复制抑制作用更明显，因此在本实施例中，所用肾细胞癌细胞是人肾透明细胞腺癌细胞786-o细胞。

ha标签的cdc6表达质粒以及对照空质粒由drury博士赠送(clarehalllaboratories,cancerresearchuk,london,england)。lipofectamine^tm2000购自thermothermofisherscientific公司(产品号11668-027)。

细胞培养同实施例1。edu法检测细胞dna复制同实施例4。免疫印迹(westernblot)法检测细胞同实施例6。质粒的细胞转染：将细胞接种到6孔板，24小时后细胞密度达到约80～90％时，弃去原培养基，用无血清无抗生素的培养液洗涤细胞两次；取1.5ml无菌ep管，分别加入100μl无血清无抗生素的培养基，2μllipofectamin2000转染试剂，混匀。加入4μg待转染质粒，混匀，室温放置15分钟。将配制好的转染复合物加入到细胞生长的培养板中，5％co2，37℃恒温培养箱中培养6小时之后，换以含血清的完全培养基继续培养；24小时后收集细胞。

为了明确抑制cdc6蛋白表达在汉黄芩素治疗肾细胞癌中的作用。发明人又将cdc6表达质粒转染细胞后再使用汉黄芩素处理，进行了cdc6拯救实验。结果如图5(c)，外源cdc6质粒的转染可以有效逆转汉黄芩素处理导致细胞内cdc6的降低。

edu检测结果如图5(d)所示。转染空对照载体与未转染细胞类似，edu掺入阳性细胞的比例约为51％与53％；20μm汉黄芩素处理后，这两种细胞edu掺入阳性细胞的比例显著降低至23％与24％；但是转染有cdc6表达质粒的细胞，汉黄芩素处理后edu掺入阳性细胞的比例有明显的上升，约为36％。这些结果说明，汉黄芩素通过抑制cdc6的表达实现抑制肾细胞癌细胞dna复制的功能。

以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。