山奈酚在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及含有杂环化合物的医药配制品，具体涉及来自姜科植物的黄酮醇类化合物的抗瘤药物制剂。

背景技术：
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肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症，是威胁人类生命和健康最大的恶性肿瘤之一，并在相当长的一段时间内将仍然是导致人类因癌症死亡的首要疾病。全球肺癌的发病率和死亡率仍然居高不下，并呈继续增长的趋势，尤其在中国等经济发展中国家。在我国，随着工业化速度加快、环境污染加重、人口老龄化加剧，肺癌的癌症负担日益加重，迫切需要开发更有效的治疗方法和药物。目前，肺癌的控制已成为全世界广泛关注的问题，手术、放疗和化疗是常见的西医治疗方法，目前中药治疗也日益受到重视。

山奈酚(kaempferol)主要来源于姜科植物山柰(kaempferiagalangall)的根茎，广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中。山奈酚属于黄酮醇类化合物，其化学名称为3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4h-chromen-4-one，分子量为286.23，微溶于水，溶于热乙醇，乙醚和碱，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效。但是，目前尚未见山奈酚具有抗肺癌作用的报道。

技术实现要素：
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本发明要解决的技术问题是提供山奈酚的新用途，即在制药中的新应用。

上述在制药中的新应用即为，山奈酚在制备抗肺癌药物中的应用。

上述应用中，所述的药物由吴茱萸碱和医学上可接受的辅料组成。

上述应用中，所述的药物为片剂或注射剂。

本发明所述应用中的山奈酚与set7/9甲基转移酶具有较好的亲和力，在体外对肺癌细胞有很强的生长抑制作用。

附图说明：

图1为肺癌细胞活力与山奈酚浓度关系的曲线图。

图2为不同浓度的山奈酚与set7/9分子对接的效果图。

图3为山奈酚与set7/9进行热转移实验的原理示意图，其中，a图中左边为蛋白质免疫印迹电泳图，右边为统计曲线图；b图中左边为蛋白质免疫印迹电泳图，右边为统计曲线图。

图4为不同浓度的山奈酚与set7/9共定位情况的显微照片。

具体实施方式：

实验例1：山奈酚对体外肺癌细胞的抑制作用

取对数生长的肿瘤细胞，以3000/孔接种于96孔培养板中，培养过夜，细胞生长状态良好后，弃去原有的培养基，然后按照设计的山奈酚浓度作用于a549细胞5天后停止培养；然后加入0.5mg/ml的mtt溶液，处理4小时后，弃上清，最后加入150μldmso震荡混匀，置于酶标仪中年测定其吸光度值(测定波长为570nm)。结果如图1所示，山奈酚可明显抑制肺癌细胞a549的生长。

实验例2：分子对接技术分析山奈酚与set7/9结合能力情况

为了评估山奈酚与set7/9作用亲和力。蛋白-配体的结合能量是由autodock4.2版进行对接。山奈酚配体的3d结构(pubchemcid:5280863)是通过openbabelgui软件转换为pdbqt格式。对于对接研究，蛋白靶标(ncbiproteinid:xp_016864150.1)的3d晶体结构被分配于蛋白序列比对。预期的蛋白配体复合物被最优化以及根据经验打分函数screenscore排名，从而评估配体-受体复合物的结合自由能以及ki值。结果如图2所示，山奈酚-set7/9对接成功，山奈酚与set7/9有很好的结合能力，亲和性很好。

实验例3：细胞热转移实验分析山奈酚与set7/9结合能力情况

不同浓度山奈酚处理a549细胞后，收集细胞，pbs清洗细胞，加入一定体积含蛋白酶抑制剂pmsf的pbs。用液氮反复冻融细胞团块，然后置于离心机中4℃，20000g离心20分钟，取上清，分成两份，一份用山奈酚处理，一份用作dmso对照。室温30分钟孵育，每份取出6个10μl溶液，在abi常规pcr仪按照温度梯度44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃加热6分钟，然后在室温下平衡3分钟。之后置于离心机中4℃，20000g离心20分钟，取上清。其中上清中包含剩下的可溶蛋白，加入上样缓冲液，用westernblot检测分析。另一个以浓度梯度作曲线，以dmso，50，100，200，400，600，800μm山奈酚与a549细胞裂解液于上同样的孵育过程以及处理方法。结果如图3所示，山奈酚组灰度值下降比dmso组缓慢，具有统计学差异，说明山奈酚与set7/9有很好的结合能力。

实验例4：激光共聚焦显微技术分析山奈酚与set7/9结合能力情况

取对数生长的肿瘤细胞，种于共聚焦小皿中，于co2培养箱中孵育6小时。用pbs清洗细胞1-2次，加预冷甲醇，固定细胞30分钟。弃去甲醇，用pbs清洗细胞3次，加0.5％triton-100处理细胞30分钟。弃去0.5％triton-100，用pbs清洗细胞3次，加2％bsa封闭1小时。弃去封闭液，用pbs清洗细胞3次，加一抗于4℃过夜。回收一抗，用pbs清洗细胞3次，加二抗，于室温孵育1小时。回收二抗，用pbs清洗细胞3次，于488nm激发光，发射光515–535nm，直接捕获图像。用徕卡tcssp8共聚焦显微镜进行图像的捕获和分析。所有样本的所有图像在相同的参数下采集。结果如图4所示，随着山奈酚的浓度上升，与set7/9结合能力逐渐增强。

实验例5：药物制剂的制备例

例1(片剂)

取山奈酚10g和β-环糊精10g加入研钵，研磨搅拌20min，等量递加法加入处方量的羧甲基淀粉钠与淀粉，混合均匀，加入质量分数为10％的淀粉浆适量制软材，2200μm筛制粒，60℃干燥，控制干颗粒水的质量分数在1％～2％，停止干燥，2200μm筛整粒，加入干颗粒的滑石粉质量分数为1％为润滑剂，混合均匀，调节压片机，压制片重为200mg环糊精山奈酚片剂，每片含山奈酚50mg。

例2(亚微乳注射剂)

称取山奈酚30mg加入5g注射用大豆油中，加热搅拌使溶解制得油相；将2g磷脂经高速剪切分散于20ml注射用水中，加1.2g甘油制得水相。将油相和水相预热至60℃，将油相加入水相中，高速剪切得初乳。高压均质，一定压力下均质数次，调节ph至6.5，补加注射用水至100ml，以0.22μm微孔滤膜挤出过滤，灌装熔封，100℃流通蒸汽灭菌30min，即得。

技术特征：

技术总结
本发明涉及山奈酚在制备抗肺癌药物中的应用。本发明所述应用中的山奈酚与SET7/9甲基转移酶具有较好的亲和力，在体外对肺癌细胞有很强的生长抑制作用。

技术研发人员：刘中秋;卢琳琳;何书贵;姬利延;冯潜;王莹;戚笑笑;吴鹏;朱丽君
受保护的技术使用者：广州中医药大学
技术研发日：2017.06.02
技术公布日：2017.08.11