一种明胶海绵支架的制备方法与流程

本发明涉及一种明胶海绵支架的制备方法。

背景技术：

明胶是胶原的部分水解产物，由于其无毒、无致癌、以及良好的生物相容性和生物降解性，明胶被广泛应用于医药和医疗领域，例如作为伤口敷料材料、组织工程支架和药物载体。组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料。适合于细胞和组织工程应用的修复支架，应具备以下特点：(1)无细胞毒性；(2)生物组织相容性好；(3)生物可降解，无任何残留；(4)原料来源丰富，成本低；(5)良好的机械性能；(6)良好的三维结构、空隙均匀、合适的空隙率；(6)制备工艺简单，可大规模生产。

明胶的主要缺点是它的机械强度弱，耐水解性差。为了提高其强度和抗水解性，以及保持在植入期间的稳定性，明胶支架需要通过交联来增加稳定性。目前已有一些技术可用于明胶材料的交联，包括：物理方法如高温脱水和紫外线照射；化学剂如戊二醛(gta)，1-乙基-3-(3-氨基丙基)碳二亚胺(edc)和京尼平(gp)；蛋白酶如转谷氨酰胺酶(mtg)和辣根过氧化物酶。其中，化学交联剂或多或少都存在着细胞毒性，随着被交联材料在体内的降解，参与或者残余在材料中的交联剂会被释放出来，导致对宿主造成伤害。物理交联虽然无毒无害，但是却有交联度小，稳定性差，单纯的物理交联无法实现快速交联的缺点。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于转谷氨酰胺酶为交联剂的明胶海绵支架及其制备方法。

本发明明胶海绵支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备明胶溶液：取明胶，溶于水，制备浓度为2-10％w/v的明胶溶液，灭菌；

(2)制备转谷氨酰胺酶溶液：取转谷氨酰胺酶，溶于磷酸盐缓冲液，制备得到浓度为5～15％w/v的转谷氨酰胺酶的磷酸盐溶液；

(3)将步骤(1)制备的明胶溶液与步骤(2)制备的转谷氨酰胺酶溶液混合，孵育，形成水凝胶，冷冻，冻干，即得海绵支架。

本发明中，w/v的比例为g/ml。

步骤(1)中，所述明胶溶液的浓度为4％w/v。

步骤(1)中，所述明胶溶液的制备方法为将明胶溶解在50℃去离子水中。

步骤(1)中，所述灭菌方法为0.22μm针式过滤器过滤灭菌。

步骤(2)中，转谷氨酰胺酶溶液的浓度为10％w/v。

步骤(2)中，所述转谷氨酰胺酶的酶活性大于100u/克。

步骤(3)中，明胶溶液与转谷氨酰胺酶溶液的体积比为1000：(20～80)，优选为1000：40。

步骤(3)中，所述孵育的方法是37℃恒温培养箱中放置。

步骤(3)中，所述冻干的条件是：在-10℃～-20℃下冷冻8h，然后在15～25℃下干燥48h。

本发明还提供了前述方法制备得到的明胶海绵支架。

本发明海绵支架无细胞毒性，物理特性综合性能优良，具有较好的孔隙率、抗压模量和抗降解能力，并且实验发现，只有采用水制备明胶溶液才能得到空隙均匀的海绵支架，而采用常规的磷酸缓冲液则无法制备得到空隙均匀的海绵支架；另外，生物相容性良好，细胞能在支架中很好的生长；将支架植入体内，形成的材料包裹层薄，外包裹层上有毛细血管的形成，有利于新生组织的生长。可作为组织工程支架、临床止血海绵、药物缓释载体等材料，用于细胞和组织工程应用中，具有广阔的前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1mtg交联方式制备的明胶海绵支架的外观图示。上图为干燥状态，下图为湿润状态。

图2mtg交联方式制备的明胶海绵支架的水解性能研究结果。

图3mtg交联方式制备的明胶海绵支架的酶解性能研究结果。

图4皮下种植植入1月后明胶海绵的变化。(a)经皮下注射1个月后皮下注射明胶的明胶海绵；(b)无附皮明胶海绵；(c)通过体视显微镜观察收获明胶海绵的横截面。标尺＝1mm。

图5mtg明胶海绵支架材料植入大鼠皮下一个月后观察。免疫组织化学染色(he)分析材料的生物相容性。

图6mtg交联方式制备的明胶海绵支架的消化效率评价结果。

图7mtg交联方式制备的明胶海绵支架的细胞增殖能力评估。

图8细胞活/死荧光染色。作图为活细胞与calcein-am染色(绿色)，中间图为死细胞染色和碘化丙啶(红色)，右图为合并的荧光图像的细胞死活染色。

图9扫描电镜分析细胞的粘附状态。

具体实施方式

实施例1本发明海绵支架的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备：定量称取明胶(a型，300bloom；sigma，美国)溶解在50℃去离子水中，得到4％(w/v)溶液，0.22μm针式过滤器过滤灭菌。mtg(博美生物，中国，酶活性＞100u/克)溶于磷酸盐缓冲液(pbs)获得10％(w/v)溶液，过滤灭菌。按照每毫升明胶溶液加入40μlmtg溶液的比例制备混合溶液，在37℃恒温培养箱中放置直至成胶。

(2)海绵支架的制备：将水凝胶冷冻干燥，具体是在-10℃～-20℃下冷冻8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海绵支架。

实施例2本发明海绵支架的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备：定量称取明胶(a型，300bloom；sigma，美国)溶解在50℃去离子水中，得到2％(w/v)溶液，0.22μm针式过滤器过滤灭菌。mtg(博美生物，中国，酶活性＞100u/克)溶于磷酸盐缓冲液(pbs)获得5％(w/v)溶液，过滤灭菌。按照每毫升明胶溶液加入40μlmtg溶液的比例制备混合溶液，在37℃恒温培养箱中放置直至成胶。

(2)海绵支架的制备：将水凝胶冷冻干燥，具体是在-10℃～-20℃下冷冻8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海绵支架。

实施例3本发明海绵支架的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备：定量称取明胶(a型，300bloom；sigma，美国)溶解在50℃去离子水中，得到10％(w/v)溶液，0.22μm针式过滤器过滤灭菌。mtg(博美生物，中国，酶活性＞100u/克)溶于磷酸盐缓冲液(pbs)获得15％(w/v)溶液，过滤灭菌。按照每毫升明胶溶液加入66.7μlmtg溶液的比例制备混合溶液，在37℃恒温培养箱中放置直至成胶。

(2)海绵支架的制备：将水凝胶冷冻干燥，具体是在-10℃～-20℃下冷冻8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海绵支架。

以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：

采用统计软件spss进行分析，数据结果以平均数±标准差表示。统计显著性分析采用单因素方差分析(one-wayanova)，组间差异比较采用最小显著性差异法(leastsignificantdifference,lsd)检验。p＜0.05为统计具有显著意义。

实验例1本发明海绵支架的物理特征检测

取实施例1制备的海绵支架，按照如下方法检测：

一、试验方法

1、孔隙率测量

明胶海绵的孔隙率测定采用液体置换法。用无水乙醇作为置换液，因为它不会引起材料的溶胀或收缩。将预先称重的冻干海绵浸入已知体积(v1)的乙醇溶液，真空脱气5分钟。记录二者的总体积为v2。将乙醇浸渍的海绵取走，测量剩余的乙醇体积为v3。按照以下公式计算该海绵的孔隙率(ε1)：

ε1(％)＝(v1-v3)/(v2-v3)×100(1)

2、力学特征测试

采用单轴20n的力学测试装置(艾得堡hpb、福建、中国)，对干态和湿态的明胶海绵进行测试，获得其压缩模量参数。将冻干的海绵在pbs中浸泡1h获得湿态海绵。将干态和湿态的明胶海绵制备成直径为10mm、高度为5mm的柱状样品，选择表面平坦的样品作为测试试样。试样被放置在一个恒温铝板(新宝db-h，浙江，中国)上面，在37℃恒温条件下以固体压缩板模式进行测试。在开始记录前施加一个微小的初始力(设定为0.01n)，确保每个样品受到相同的初始荷载。压缩推进速度为1mm/分钟，实时记录应力-应变曲线，一旦测试到达压力上限值则停止测量，计算该曲线线性区直线斜率获得压缩模量测量值。

3、溶胀率测试

溶胀率测试:将已称重的冻干海绵(w0)浸入去离子水，在室温下浸泡1h，取出，将其表面多余的水分用滤纸轻轻除去，然后再次称重(w1)。膨胀比(ε2)计算如下：

ε2(％)＝(w1-w0)/w0×100(2)

二、试验结果

采用mtg交联制备的明胶水凝胶经过冻干后形成了多孔的海绵状结构，呈半透明白色。如图1所示。

1、孔隙率分析：从支架的孔隙来看，mtg孔径均匀，孔隙率为53.51±3.45％。

2、力学特征测试：在材料的干操状态，mtg交联后的材料弹性模量为716.2±94.5kpa。材料吸水后，弹性模量显著下降，mtg材料的湿态弹性模量为67.4±6.8kpa。

3、溶胀率测试：mtg材料的溶胀率为1209.31±57.77％，表明本发明的明胶海绵支架吸水率较好。

实验结果说明，本发明孔隙率、抗压模量和抗降解能力良好。

实验例2本发明海绵支架的酶解性能测试

取实施例1制备的海绵支架，按照如下方法检测：

1、水解性能测试

将交联的海绵支架材料浸泡在去离子水中一段时间，然后评估它们的降解率。预称重冻干明胶海绵，用75％酒精消毒灭菌20min，以避免细菌污染造成材料降解，然后用灭菌的去离子水洗涤几次。将海绵和水溶液放置在37℃.细胞培养箱中，于指定时间点(1-12周以内)，将未降解的海绵支架材料取出，冻干后称重。通过计算剩余重量与原重量的百分比确定生物材料的降解率。

2、体外酶降解测试

通过暴露明胶海绵于各种酶，评估它们的的生物稳定性和降解率。将冻干海绵在pbs中浸润1h后，取出海绵，用过滤纸除去多余的水分，然后称重。将已称重的湿海绵被浸入0.1％ⅰ型胶原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司，美国)，0.1％ⅱ型胶原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司)，0.1％ⅳ型胶原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司)，和0.25％胰蛋白酶(250nfu/mg，invitrogen公司)，0.1％胃蛋白酶(800-2500u/mg,sigma)溶液中6h。以上酶容液均采用pbs配制。所有酶降解试验都是在37℃恒温水浴振荡箱中完成。在指定的时间点：0.5h,1h,1.5h,2h,3h,4h,5h,6h,，收集残余的海绵,小心去除材料表面多余的水分，然后再次称重。通过计算剩余重量与原始重量的比值确定材料降解率。

二、试验结果

1、水解性能测试：未交联的明胶海绵抗水解能力很差，例如100mg未交联的明胶海绵浸入到37度温水以后，大约在2分钟内完全溶解。与未交联的明胶海绵相比，交联后的明胶海绵，其抗水解能力显著增强。mtg材料的抗水解能力非常高，在37度温水中浸泡一个月以后，未见质量减少，继续浸泡4-5个月，材料的质量保持在94％以上。如图2所示。

2、体外酶降解测试：分别采用多种酶对这些材料进行测试，以便了解这些材料的酶解性能。所采用的蛋白酶中，除了木瓜蛋白酶以外，胶原酶i型，ii型和iv型，胰酶和胃蛋白酶都是哺乳动物体内普遍存在的蛋白酶，同时也是细胞培养中常用的蛋白酶，在细胞培养扩增和消化过程当中经常使用的。通过了解这些蛋白酶对材料的降解作用，这样可以在细胞培养过程当中有效地利用这些蛋白酶对材料进行操作，同时也了解这一材料在植入体内后可能受到的蛋白酶作用。

0.1％胶原酶i型，ii型和iv型是细胞在消化过程中常用的消化酶浓度，这三种胶原酶，尽管亚型不同，但它们对四种不同的交联方式的明胶海绵材料来说，其材料酶解曲线走向基本上相似。不过对于不同的材料而言，在不同时间点的胶原酶酶解程度是有区别的，胶原酶对mtg材料的酶解作用较为缓慢，胶原酶作用一小时后，仍然还有50％以上的残余质量，大约要四个小时残余质量才会小于20％。

0.25％的胰酶常用于细胞培养中，作为消化液消化细胞。了解这个酶对细胞的作用，有助于了解从细胞-明胶海绵材料中消化细胞所需要的时间，同时也有助于防止过度消化，避免对材料造成降解。0.25％的胰酶对mtg材料的消化作用曲线与胶原酶相似，但降解度要高一些。

胃蛋白酶虽然也是体内常见的消化酶，但它对明胶海绵材料的消化作用比较弱，对于mtg材料而言，6小时消化后有40％以上的材料未被消化。

木瓜蛋白酶对mtg材料的消化作用与胶原酶相似，如图3所示。

实验结果说明，本发明降解速度合适。

试验例3本发明海绵支架材料的生物相容性测试

取实施例1制备的海绵支架，按照如下方法检测：

1、体内相容性测试

采用动物皮下植入的方法检验海绵支架材料的体内相容性，详细方法可参见文章(yangg,etal.enzymaticallycrosslinkedgelatinhydrogelpromotestheproliferationofadiposetissue-derivedstromalcells.peerj,2016.4:p.e2497)。简言之，先用75％酒精浸泡20min，对四种明胶海绵进行消毒，然后用pbs清洗三次，dmem培养液中浸泡12h，取出，切割成7mm×7mm×4mm大小，在无菌室内用手术刀在成体sd大鼠(7-8周龄)背侧切～1cm的切口，在大鼠皮下拓展材料大小的空间。然后植入材料。总共12只大鼠随机接受两次皮下埋植，最终每组材料有五个重复样本。另外有四个切口直接缝合，不作植入，留作阴性对照。材料植入一个月后，处死大鼠，用手术剪取出植入的海绵以及附带的结缔组织和皮肤。观察拍照后，剪除附带的皮肤，保留材料及其包裹组织，用游标卡尺测量包裹物的长宽高，估算包裹物的体积。接下来对材料的降解程度进行测试。将材料包裹物用锋利的手术刀沿水平面居中切开，暴露横截面，放置在体视显微镜下观察拍照。使用ipp(imageproplus6.0，美国)软件提供的直线测量工具测量包裹组织的厚度，估算整个包裹组织的体积，求出剩余海绵的体积以及材料的降解程度。

2、细胞接种效率:所有动物实验均按照四川大学动物保护和使用委员会指南进行。原代adscs的分离方法，参见文章(liz,etal.[biphasicpulsedelectricalstimulationpromotesthedifferentiationofadipose-derivedstemcellsintocardiomyocyte-likecells].xibaoyufenzimianyixuezazhi,2015.31(9):p.1200-4,1210；yangg,etal.enzymaticallycrosslinkedgelatinhydrogelpromotestheproliferationofadiposetissue-derivedstromalcells.peerj,2016.4:p.e2497)。按照上一节的方法，准备dmem浸泡的明胶海绵。吸干多余水分，在超净台中中晾干1h。将海绵转移到24孔细胞培养板。消化细胞，制备细胞悬液，每个海绵接种200μl的细胞悬液(包含大约1×10⁶个细胞)。将接种后的海绵小心移到另外一快新的24孔板。收集原先24孔板中残留的细胞(在接种过程中从支架上渗漏下来的细胞)，用血球计数板计数，确定残留的细胞数量，计算接种细胞的总数与残留细胞之差，可以认为是粘附在海绵材料中的细胞树目，将此数目除以细胞接种总数获得接种效率。

3、消化时间测定:如上面所述，将细胞接种到四种明胶海绵上，加入细胞培养液，在细胞培养箱中放置8小时使细胞完全附着在材料上，孵育后，弃培养液，pbs冲洗3次，加入0.1％ⅰ型胶原酶进行细胞消化。在不同的时间点(10min,20min,30min,40min和1h)，搜集消化液，使用血球计数板计数细胞。消化下来的细胞数目除以材料中粘附的细胞总数可计算出细胞消化效率。

4、体外细胞增殖测试：细胞增殖通过噻唑蓝(mtt)法测定。明胶海绵的细胞接种方法如上所述。每个海绵接种1.5×10⁶个细胞，然后放置的37℃细胞培养箱中孵育。每天用倒置显微镜(olympusckx41，日本)观察细胞的生长情况。在设定的时间点(0d，3d，6d，9d，12d，15d)，取出含有细胞的海绵材料，pbs洗三倍。加0.1％胶原酶ⅰ，在37℃细胞培养箱中消化细胞30分钟，收集消化液，低速离心后用pbs清洗，然后再次离心。细胞沉淀用800μl高糖dmem加80μlmtt溶液(5mg/ml溶解于pbs)重新悬浮，并转移到24孔板，在37℃细胞培养箱中孵育4h。弃孵育液，每孔添加400μldmso，溶解紫色结晶后用用酶标仪(biotekelx800,，美国)测量该溶液的吸光度。检测波长490nm，参比波长630nm。

5、细胞活死状态检测：adscs在不同的明胶海绵支架材料中的活死状态采用live/dead染色法的检测。如上所述制备含有细胞/海绵复合物。经过两周的培养，将含细胞的海绵在无菌pbs中冲洗，并在无菌超净台中用手术刀沿着海绵的横切面，以大约1mm间隔切割，制成细胞/支架薄片。将切片浸泡在含有4μm钙黄绿素-am(sigma)和4μm碘化丙啶(sigma)的溶液中.，于37℃孵育半个小时。孵育后，样品清洗两次，在倒置荧光显微镜下观察(xds30，舜宇，中国)和拍照。

6、扫描电镜形态学评价：为了研究细胞在支架上的粘附状态，对于培养两周后的细胞支架用镊子和手术刀进行切片，取材料中间具有代表性的样本进行扫描电镜观察。样品用pbs洗涤，在室温下用2.5％戊二醛固定2小时。梯度酒精脱水(10-100％)，真空干燥过夜。在观察前，所有标本均喷涂金粉，扫描电镜(日立s3400+edx、日本)观察，加速电压设置为15kv。

二、试验结果

1、mtg材料接种后，伤口无炎症反应。伤口愈合良好，将大鼠处死，在植入位点周围剪开皮肤，发现材料位于皮下和肌肉层之间的结缔组织当中，mtg材料形成的结缔组织包裹层。囊状的植入材料与结缔组织形成紧密的连接结构，剪取囊状的植入材料及其附着的皮肤，在体视显微镜下观察到一些包裹层上还有毛细血管生成。如图4所示。原先切割为长方体的植入材料，在体内植入1个月后已经出现体积缩小，少了棱角，变得圆润。这是体内材料出现了一定程度的降解造成的。一个月后，mtg材料剩余体积为27.73±2.68％。mtg材料的包裹层厚度小，包裹层厚度为0.19±0.16mm。植入物的剖面观察：将植入的材料沿着横截面切开后观察材料的形貌。mtg材料呈现肉色。血管网络的生成：mtg材料的包裹层中有一些毛细血管，有些毛细血管还深入到材料边缘，显示了这个材料的非常好的相容性。能够形成毛细血管血供。细胞浸润分析(he染色)：mtg材料的周围发生了降解，并出现了一些细胞，说明这些包裹层上的细胞开始渗入到这个材料中，形成了细胞层，但是在材料内部并没有出现细胞，说明植入的时间还未足以达到形成新的组织。如图5所示。

2、细胞接种效率：细胞在材料表面粘附以后，会根据材料表面的形状和特征攀爬和迁徙，并通过细胞增殖形成不同的聚落。所以经过两周的培养以后，细胞在材料上的分布和生长情况会发生变化，对于孔隙大的材料，细胞能够侵入到材料内部生长，对于比较致密的材料则只能在表面生长，而随着时间的推移，逐渐渗透到材料内部生长。mtg材料的细胞接种效率分别为84.08±2.79％。

3、细胞消化效率：将细胞从支架材料中消化下来,有利于做进一步的细胞操作和分析，包括细胞传代、细胞生长测试、细胞的基因表型测试。在二维培养皿表面上消化细胞常使用0.25％胰蛋白酶消化液，消化时间一般在2-5分钟，但是，生长在三维支架材料中的细胞往往需要更长的消化时间才能从材料表面脱落，而胰蛋白酶消化液作用时间过长会降低细胞成活率。这里我们采用0.1％的胶原酶对支架材料中的细胞进行消化，对消化下来的细胞进行计数，计算各个时间点的细胞消化效率。消化时间在半个小时的时候，mtg材料细胞存活效率基本在90％以上，如果再增加消化时间，消化效率不再有明显的变化。因此半个小时的消化时间被后续实验所采用。如图6所示。

4、通过mtt细胞增殖实验了解这些材料对细胞生长的影响。随着培养时间的推移，mtg材料中细胞生长较快，在各个测试时间点都有较高的生长率。这些实验总体来说，这些材料都有比较好的细胞相容性，因为是死亡的细胞非常少，我们认为如果随着时间的推移，细胞可能还会有一个继续上升的趋势，如图7所示。

5、从细胞活死染色结果表明，mtg海绵支架有比较好的细胞相容性。活细胞多，死亡的细胞比较少。mtg材料上面细胞的分布比较均匀，细胞存活率较高，数量也较多。mtg材料着色呈现出暗绿色，如图8所示。

6、我们对细胞在mtg明胶海绵材料上的生长状态做了扫描电镜检测，经初步观察，可以看到细胞能够比较好的粘附在材料表面，在有些地方还形成了细胞聚落，细胞之间相互连接。表明了这个材料有良好的细胞相容性。细胞为伪足完全贴在材料表面。如图9所示。

实验结果说明，本发明具有良好的细胞相容性和体内生物相容性。

综上，本发明海绵支架具有如下性能：1)无细胞毒性；2)物理特性综合性能优良，具有较好的孔隙率、抗压模量和抗降解能力；3)良好的细胞相容性，细胞能在支架中很好的生长；4)良好的体内生物相容性，将支架植入体内，形成的材料包裹层薄，外包裹层上有毛细血管的形成，有利于新生组织的生长。可作为组织工程支架、临床止血海绵、药物缓释载体等材料，用于细胞和组织工程应用中，具有广阔的前景。