一种用层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性微/纳米纤维膜的方法与流程

本发明属于材料技术领域，具体涉及一种用层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性微/纳米纤维膜的方法。

背景技术：

数十年来，骨组织工程的发展已使世界各地数百万患有骨缺损和骨创伤的的患者免受病魔的摧残。骨组织工程支架的研究也因此获得了大量的关注。理想的骨组织工程支架应满足两个基本要求。首先，支架应具有一定的机械强度，能够抵抗外力，并保持其物理结构稳定，从而保证稳定的细胞生长和组织发育。此外，适宜的表面性质和优异的生物相容性对于其促进成骨细胞的粘附，增殖和分化至关重要。

微/纳米纤维膜作为一种具有特殊三维结构的微/纳米材料，在药物缓释、吸附过滤、等领域应用广泛，此外，由于其具有与细胞外基质相似的三维立体结构，能够模拟细胞外基质结构并提供细胞生长与粘附的支架，因此它也是一种重要的组织工程材料。大多微/纳米纤维的机械强度弱，表面光滑，不利于细胞的稳定生长，因此在应用于组织工程前，需要对其进行必要的改性。壳聚糖作为唯一带正电荷的天然碱性多糖，具有优异的生物相容性和抗菌活性，可在引入抗菌性能的同时保证材料的生物相容性不被破坏。层状硅酸盐可增强材料的机械强度，可调控微/纳米纤维膜表面的粗糙度，同时可促进壳聚糖的抑菌性能，这两种材料是理想的可用于微/纳米纤维膜改性的材料。

中国专利“一种排列有序的改性微/纳米纤维膜及其制备和应用”(公开号cn106283399a)公开了一种排列有序的改性微/纳米纤维膜及其制备方法和应用前景。具体方法为：将胶原蛋白、丝素蛋白、聚己内酯以一定的比例共混，制成纺丝液，并进行静电纺丝，干燥，交联等步骤。通过共混和改变静电纺的收集器来制备有序微/纳米纤维，并达到改性目的。该专利中的改性虽然是在微/纳米纤维膜上进行，但其是通过共混和改变收集器来进行改性。在组织工程领域，由于涉及细胞的粘附、生长，材料的表面特性对于其性能有着重要的影响，共混的改性手段不仅会改变材料的表面，更会改变材料的主体，使材料主体的结构和性能带来未知的变化。而层层自组装的改性方法仅是在微/纳米纤维的表面进行修饰，不改变该微/纳米纤维的原有组分。

层层自组装技术作为一种多功能有潜力的改性技术，具有操作简单，成本低，适用性强，对基底的大小及形状无要求等优点，可完成对基底微/纳米尺度上的可控改性，且改性材料的选择十分广泛。在层层自组装的过程中，具有相反电荷的聚电解质逐步、交替地吸附，该过程操作简便且不会产生其他副产物。此外，与在平板上的进行的层层自组装工艺相比，在微/纳米纤维膜上进行层层自组装改性的研究较为少见，它包含两个层面的改性：(1)在每根微/纳米纤维的表面进行改性；(2)在微/纳米纤维膜的宏观表面进行改性。在层层自组装过程之后，将得到微/纳米纤维膜多层级结构的多层次修饰。

基于上述考虑，选择微/纳米纤维作为底板，壳聚糖作为正电层组分和层状硅酸盐作为负电层组分，采用层层自组装的方法对微/纳米纤维膜进行改性，获得了拥有更强机械性能，抑菌性能和良好生物相容性的微/纳米纤维膜，在组织工程领域有非常广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种采用壳聚糖和层状硅酸盐对微/纳米纤维膜进行层层自组装改性的方法。该方法可以对微/纳米纤维膜进行改性，提高其物理和生物性能，制备出更适用于骨组织工程的微/纳米纤维膜。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性微/纳米纤维膜的方法，以带电荷的微/纳米纤维膜作为基板，当基板所带电荷为正时，依次在基板上组装层状硅酸盐和壳聚糖，直至达到所需双层数；当基板所带电荷为负时，依次在基板上组装壳聚糖和层状硅酸盐，直至达到所需双层数，将组装后的微/纳米纤维膜干燥，得到改性的微/纳米纤维膜。

优选地，所述基板的zeta电位绝对值不小于10mv。

优选地，所述的所需双层数为1-50层。

优选地，所述的带电荷的微/纳米纤维膜基板是由丝素蛋白、胶原蛋白、醋酸纤维素、壳聚糖及其衍生物、聚左旋乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种制备得到的。

优选地，所述的微/纳米纤维膜基板由静电纺丝法、湿法纺丝法、干法纺丝法、离心纺丝法、相分离法或者复合纺丝法中的任一种制备得到。

优选地，所述的壳聚糖按照下述方法组装：配置壳聚糖醋酸溶液，将基板浸泡于带正电荷的壳聚糖醋酸溶液中，一定时间后，将膜取出，用清洗液清洗去除膜表面未组装成功的壳聚糖。

优选地，所述的层状硅酸盐按照下述方法组装：配置层状硅酸盐悬浮液，将基板浸泡于带负电荷的层状硅酸盐悬浮液中，一定时间后，将膜取出，用清洗液清洗去除膜表面未组装成功的层状硅酸盐。

优选地，所述的壳聚糖醋酸溶液浓度为0.1-10mg/ml。

优选地，所述的层状硅酸盐为蒙脱土或累托石。

优选地，所述的层状硅酸盐组装悬浮液浓度为0.1-10mg/ml。

优选地，所述的清洗液为去离子水或0.01-1mol/l的氯化钠溶液。

优选地，所述的浸泡组装时间为10-60分钟。

优选地，所述的干燥方法为自然干燥、真空冷冻干燥或于真空干燥箱中烘干，所述干燥为完全干燥。

一种用层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性的微/纳米纤维膜，通过上述的方法制备得到。

本发明以微/纳米纤维膜作为组装基底，通过静电力作用，交替在其多级结构表面组装壳聚糖和层状硅酸盐。壳聚糖的引入使纳米纤维膜具有了抑菌特性且保持了其良好的生物相容性。而层状硅酸盐单独作为带负电荷的组装材料被引入到复合纳米纤维膜中，大大增强了纤维膜的机械性能和表面特性。本发明具有诸多优点，包括条件温和，工艺简单，对底板材料的尺寸和形状没有任何限制，改性过程不引入其他杂质和不产生其他副产物等。

附图说明

图1是实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜的形貌图。图中左侧是丝素蛋白纳米纤维膜表面扫描电镜图，右侧是双层数为15.5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜表面扫描电镜图。

图2是实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜的纤维直径分布图。a是丝素蛋白纳米纤维膜的纤维直径分布图，b是双层数为15.5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜的纤维直径分布图。

图3是实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜的接触角随时间变化曲线。a是丝素蛋白纳米纤维膜的接触角随时间变化曲线，b是双层数为15.5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜的接触角随时间变化曲线。

图4是实施例1制备的丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜的拉伸强度和断裂伸长率对比图。图中，a表示丝素蛋白纳米纤维膜，b表示双层数为5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜，c表示双层数为10的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜，d表示双层数为15的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜表面扫描电镜图，e表示双层数为15.5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜。

图5是成骨细胞在实施例1中制备的丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜表面培养72h后生长情况的扫描电镜图。a表示丝素蛋白纳米纤维膜，b表示双层数为15.5的层状硅酸盐/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。

1，制备带电荷的微/纳米纤维膜

以丝素蛋白为例：

将丝素蛋白溶解于六氟异丙醇溶剂中，磁力搅拌24h，得到7wt％的丝素蛋白纺丝液。然后通过静电纺丝技术制备丝素蛋白纳米纤维膜，静电纺丝相关参数为：电压为16kv，纺丝液推进速度为1ml/h，纺丝针与接收器之间距离为12cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和40％。随后将所得的电纺丝素蛋白纳米纤维膜在55℃下真空干燥，使得残留溶剂充分挥发。

本领域技术人员根据实际情况还可以选用胶原蛋白、醋酸纤维素、壳聚糖及其衍生物、壳寡糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、甲基丙烯酸酯化聚乙烯亚胺、聚丙烯腈、聚氨酯、聚异丁烯中的一种或几种作为微/纳米纤维膜的原材料，并根据选用的原材料选用适当的溶剂和制备方法进行制备。

可选用的溶剂包括六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙酸、四氢呋喃、苯、甲苯、苯乙醚、氯苯、n,n二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、甲酸乙酯、乙酸乙酯、醋酸、磷酸、甲醇、甲酸、戊醇、水中的一种或多种作为溶剂，配置浓度为3-30wt％的纺丝液。

可选用的制备方法包括静电纺丝法、湿法纺丝法、干法纺丝法、离心纺丝法、相分离法以及复合纺丝法。

需要指出的是，本领域技术人员结合本领域公知常识对于这些原料、溶剂、制备方法的选择，并不影响本发明对微/纳米纤维膜的改性方法和最终得到的产品，采用本发明所述的方法对这些原料、溶剂和制备方法得到的微/纳米纤维膜进行改性，均属于本发明的保护范围。

此外，当选用的微/纳米纤维膜本身不带电荷或所带电荷较少(zeta电位绝对值小于10mv)，可通过溶胶-凝胶技术、液相沉积、气相沉积、湿化学法、等离子体处理、接枝共聚、原位聚合使其表面电荷增强。

以聚己内酯为例：

将聚己内酯溶解于六氟异丙醇中，磁力搅拌24h，得到10wt％的聚己内酯纺丝液。然后通过静电纺丝技术制备得到聚己内酯纳米纤维膜，静电纺丝相关参数为：电压为15kv，纺丝液推进速度为2ml/h，纺丝针与接收器之间距离为10cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和40％。随后将所得的电纺聚已内酯纳米纤维膜在55℃下真空干燥，使得残留溶剂充分挥发。随后采用湿化学法，将聚己内酯于50％的乙醇溶液中浸泡2小时，再将其置于1.0mg/ml的聚乙烯胺的0.15mol/l的氯化钠溶液中，10分钟后取出，用去离子水冲洗三次，即得到带正电荷的聚己内酯纳米纤维膜。

以醋酸纤维素为例：

将丙酮和n，n-二甲基乙酰胺以2:1(w/w)的比例混合，并将醋酸纤维素溶于该混合溶液中，得到16wt％的醋酸纤维素纺丝液。然后通过静电纺丝技术制备得到醋酸纤维素纳米纤维膜，静电纺丝相关参数为：电压为16kv，纺丝液推进速度为1ml/h，纺丝针与接收器之间距离为15cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和45％。随后将所得的电纺聚已内酯纳米纤维膜在55℃下真空干燥，使得残留溶剂充分挥发。随后将所得醋酸纤维素纳米纤维膜浸泡于0.05mol/l氢氧化钠溶液中7天，取出后用去离子水漂洗，得到带负电荷的纤维素纳米纤维膜。

以丝素蛋白为例：

将磷酸与甲酸以不同的比例进行混合，将丝素蛋白溶解在该混合溶液中，对该混合溶液进行过滤和消泡处理，得到浓度为15％的丝素蛋白纺丝液；以甲酸为凝固液，采用湿法纺丝技术制备微/纳米纤维膜。湿法纺丝相关参数为：纺丝液推进速度为30ml/h，相对温度和相对湿度分别为25℃和40％。随后将所得的湿法纺丝素蛋白微/纳米纤维膜在甲醇中浸泡24h，使其完全固化和结晶，并除去残留甲酸。然后再将丝素蛋白微/纳米纤维浸入60℃蒸馏水中15分钟，随后进行5倍牵伸。最后进行张力干燥，防止干燥过程中收缩。

2，对得到的微/纳米纤维膜进行层层自组装改性

实施例1

(1)得到zeta电位小于-10mv的丝素蛋白微/纳米纤维膜；

(2)将壳聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力搅拌3-5h至溶液澄清透明，使壳聚糖充分溶解，配制得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液。将丝素蛋白微/纳米纤维膜浸泡于所得的壳聚糖溶液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的壳聚糖；

(3)累托石加入到去离子水中，采用超声仪进行分散，制备得到浓度为1mg/ml的累托石悬浮液，将组装了壳聚糖的丝素蛋白纳米纤维膜浸入到所得的累托石悬浮液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的累托石，至此组装成功了一个双层；

(4)依次重复步骤(2)和步骤(3)若干次，将所得微/纳米纤维膜干燥，分别得到双层数为5、10、15、15.5的复合微/纳米纤维膜。

所得丝素蛋白纳米纤维膜和改性纳米纤维膜的形貌见图1，图1左侧是丝素蛋白纳米纤维膜表面扫描电镜图，图1右侧是双层数为15.5的累托石/壳聚糖层层自组装改性纳米纤维膜表面扫描电镜图。可以看出，改性过后的纳米纤维的微观形貌发生了明显的改变，表面变粗糙。而且，改性后纤维平均直径为594±112nm增加为886±143nm(图2)。同时，改性后的纳米纤维膜机械性能增强至5.64mpa(图4)，水接触角降低至60.3°(图3)，且水接触角在与膜接触后6.4s内将为0，亲水性增加。与改性前丝素蛋白纳米纤维膜相比，改性后的纳米纤维膜生物相容性增加，更适宜成骨细胞的黏附、生长和迁移(图5)。

实施例2

(1)得到zeta电位大于+10mv的聚己内酯微/纳米纤维膜；

(2)蒙脱土加入到去离子水中，采用超声仪进行分散，制备得到浓度为1mg/ml的蒙脱土悬浮液，将带正电荷的聚己内酯纳米纤维膜浸入到所得的蒙脱土悬浮液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的蒙脱土；

(3)将壳聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力搅拌3-5h至溶液澄清透明，使壳聚糖充分溶解，配制得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液。将组装了累托石的聚己内酯纳米纤维膜浸泡于所得的壳聚糖溶液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的壳聚糖，至此组装成功了一个双层；

(4)依次重复步骤(2)和步骤(3)若干次，将所得微/纳米纤维膜干燥，即可获得双层数为所需层数的复合纳米纤维膜。

实施例3

(1)得到zeta电位小于-10mv的醋酸纤维素微/纳米纤维膜；

(2)将壳聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力搅拌3-5h至溶液澄清透明，使壳聚糖充分溶解，配制得到浓度为10mg/ml的壳聚糖溶液。将纤维素纳米纤维膜浸泡于所得的壳聚糖溶液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的壳聚糖；

(3)累托石加入到去离子水中，采用超声仪进行分散，制备得到浓度为10mg/ml的累托石悬浮液，将组装了壳聚糖的纤维素纳米纤维膜浸入到所得的累托石悬浮液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的累托石，至此组装成功了一个双层；

(4)依次重复步骤(2)和步骤(3)若干次，将所得微/纳米纤维膜干燥，即可获得双层数为所需层数的复合纳米纤维膜。

实施例4

(1)得到zeta电位小于-10mv的丝素蛋白微/纳米纤维膜；

(2)将壳聚糖粉末加入到0.5wt％的醋酸溶液中，磁力搅拌3-5h至溶液澄清透明，使壳聚糖充分溶解，配制得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液。将丝素蛋白微/纳米纤维膜浸泡于所得的壳聚糖溶液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的壳聚糖；

(3)蒙脱土加入到去离子水中，采用超声仪进行分散，制备得到浓度为1mg/ml的蒙脱土悬浮液，将组装了壳聚糖的丝素蛋白纳米纤维膜浸入到所得的蒙脱土悬浮液中，使膜与溶液充分接触，20分钟后将膜取出，采用去离子水清洗三次去除膜表面未组装成功的蒙脱土，至此组装成功了一个双层；

(4)依次重复步骤(2)和步骤(3)若干次，将所得微/纳米纤维膜干燥，即可获得双层数为所需层数的复合纳米纤维膜。