一种肺基质水凝胶的制备方法及应用及药物与流程

本发明涉及组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种肺基质水凝胶的制备方法及应用及药物。

背景技术：

急性胰腺炎(acutepancreatitis，ap)是临床常见的急腹症之一，病死率高。ap发生时，胰酶在腺泡细胞内异常激活并释放炎性介质，进而激活大量的炎性细胞，引起体内炎症“瀑布样反应”，导致多器官功能衰竭。在炎性介质的作用下，肺泡上皮-内皮细胞屏障功能受损，循环中的蛋白、液体、中性粒细胞等成分进入肺泡腔，肺泡结构破坏，换气功能受损，发生胰腺炎相关肺损伤(pancreatitisassociatedlunginjury,apali)。apali是ap早期严重的并发症，也是导致ap早期死亡的重要原因。

既往研究证实，肺泡上皮细胞过度凋亡在apali的病情发生、进展中扮演着至关重要的角色。生理情况下，细胞适度凋亡对于维持内环境稳定具有重要的意义。然而，在炎性环境等病理状态下，肺泡上皮细胞周围微环境失衡，细胞发生过度凋亡。肺泡上皮细胞的大量凋亡导致肺组织结构和功能的破坏加重。因此，如果能够抑制apali中肺泡上皮细胞的过度凋亡，可以减轻肺损伤，保护肺功能。

目前，已有使用药物调控apali中肺泡上皮细胞的凋亡成功治疗apali的动物实验研究报道。但是，由于动物实验中采用的凋亡抑制药物副作用大，选择性差，无法直接在患者中使用，目前临床上尚无针对肺泡上皮细胞过度凋亡切实有效的治疗药物。因此，寻找一种安全、有效、简便的调控肺泡上皮细胞过度凋亡功能策略，恢复受损的肺组织功能，已成为临床上亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明提供了一种肺基质水凝胶的制备方法及应用及药物，旨在解决现有技术中采用药物等调控apali中肺泡上皮细胞的凋亡过程副作用大、选择性差的问题。

为了解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种肺基质水凝胶的制备方法，将大鼠脱细胞肺组织粉碎，然后按照8mg/ml-12mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，进行溶解。向溶解后的溶液中加入0.05m-0.15m氢氧化钠和8×pbs-12×pbs调至生理状态，然后置于30℃-40℃条件下直至形成胶状的肺基质水凝胶。

进一步，大鼠脱细胞肺组织的制备方法如下：

1)将大鼠全麻后，向全身灌注肝素，取大鼠完整的心肺组织。

2)将套管针经右心室插入肺动脉并固定，设置蠕动泵速度为4-6ml/分钟，使用0.1％十二烷基硫酸钠预充整个灌注管道。

3)依次采用0.1％十二烷基硫酸钠灌注1.8-2.2h，采用去离子水灌注14-16分钟，采用1％tritonx-100溶液灌注8-12分钟，采用添加双抗的pbs灌注70-74小时，直至心肺组织透明，并去除残余的洗涤剂，得到大鼠脱细胞肺组织。

进一步，将大鼠全麻后，采用腹主动脉插管并使用50单位/毫升的肝素向全身灌注。

进一步，蠕动泵采用卡片式蠕动泵，蠕动泵以5ml/分钟的速度将0.1％十二烷基硫酸钠预充整个灌注管道。

进一步，依次采用0.1％十二烷基硫酸钠灌注2h，去离子水灌注15分钟，1％tritonx-100溶液灌注10分钟，添加双抗的pbs灌注72小时，直至组织透明。

进一步，去除残余的洗涤剂步骤为：采用dnase溶液灌洗1次后，用生理盐水漂洗3-5次。

进一步，大鼠脱细胞肺组织粉碎步骤为：将大鼠脱细胞肺组织低温冻干后，再用粉碎机磨成粉末。

进一步，大鼠脱细胞肺组织粉末按照10mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，通过加入0.1m氢氧化钠和10×pbs调至ph7.4，并置于37℃直至形成胶状的肺基质水凝胶。

一种采用上述肺基质水凝胶的制备方法制作的肺基质水凝胶在治疗重症急性胰腺炎肺损伤中的应用。

一种治疗重症急性胰腺炎肺损伤药物，包括上述肺基质水凝胶的制备方法制作的肺基质水凝胶。

与现有技术相比本发明的优点是：

本发明制备的肺基质水凝胶不但具有温敏性、便于使用、低免疫原性及能提供最天然的细胞外微环境等优点，而且操作工艺简单、实施条件温和，为肺组织工程提供了一种新型水凝胶材料。该材料适宜于肺泡上皮细胞的恢复，可抑制肺泡上皮细胞在病理情况下的过度凋亡，进而促进重症胰腺炎相关肺损伤的内源性修复，采用本发明方法制备的肺基质水凝胶在用于治疗重症急性胰腺炎相关肺损伤的药物时，对调控apali中肺泡上皮细胞的凋亡过程基本无副作用。

本发明的肺基质水凝胶可以用于制备修复重症急性胰腺炎肺组织或使其再生的药物。所述肺基质水凝胶为大鼠肺来源的脱细胞化细胞外基质，其中肺基质水凝胶具有温敏性，常温下为液态，可通过气管注射的方式输送到肺组织受损部位，在体内温度条件下即可转变为水凝胶形式，其不但可为受损的肺泡上皮细胞提供接近天然的肺组织微环境，而且可以调节炎症状态下出现的肺泡上皮细胞过度凋亡，因此肺基质水凝胶可以降低肺泡上皮的细胞过度凋亡，减轻肺损伤，进而保护肺功能。

附图说明

图1为he染色检测脱细胞肺基质图。

图2为扫描电镜检测肺基质水凝胶图。

图3为he染色检测皮下注射的肺ecm水凝胶图。左侧为正常皮肤对照组，中间为ecm水凝胶组，右侧为胶原水凝胶对照组。

图4为大鼠sap模型的制备图。

图5为免疫荧光染色观察水凝胶移植后肺泡上皮细胞凋亡情况图。

图6为肺基质水凝胶移植减轻sap大鼠肺功能损伤图。

图7为肺基质水凝胶移植减轻sap大鼠肺组织mpo水平图。

具体实施方式

实施例一：

一种肺基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

将大鼠脱细胞肺组织粉碎，然后按照8mg/ml-12mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，进行溶解。

向溶解后的溶液中加入0.05m-0.15m氢氧化钠和8×pbs-12×pbs调至生理状态(生理状态时，ph约为7.4，水凝胶浓度约为8mg/ml)；然后置于37℃条件下直至形成胶状的肺基质水凝胶。

其中，大鼠脱细胞肺组织的制备方法如下：

1)将大鼠全麻后，向全身灌注肝素，取大鼠完整的心肺组织。

2)将套管针经右心室插入肺动脉并固定，设置蠕动泵速度为4-6ml/分钟，将0.1％十二烷基硫酸钠预充至整个灌注管道。

3)依次采用0.1％十二烷基硫酸钠灌注1.8-2.2h，采用去离子水灌注14-16分钟，采用1％tritonx-100溶液灌注8-12分钟，采用添加双抗的pbs灌注70-74小时，直至心肺组织透明，并去除残余的洗涤剂，得到大鼠脱细胞肺组织。

去除残余的洗涤剂步骤为：采用dnase溶液灌洗1次后，用生理盐水漂洗3-5次。

实施例二：

在实施例一的基础上，进一步，将大鼠全麻后，采用腹主动脉插管并使用50单位/毫升的肝素向全身灌注，取大鼠完整的心肺组织。将套管针经右心室插入肺动脉并固定，蠕动泵采用卡片式蠕动泵，蠕动泵依5ml/分钟的速度，将0.1％十二烷基硫酸钠预充至整个灌注管道。依次采用0.1％十二烷基硫酸钠灌注2h，去离子水灌注15分钟，1％tritonx-100溶液灌注10分钟，添加双抗的pbs灌注72小时，直至组织透明。

实施例三：

在实施例一的基础上，进一步，大鼠脱细胞肺组织粉碎步骤为：将大鼠脱细胞肺组织在低温冻干机内低温冻干后，再用粉碎机磨成粉末，用环氧乙烷消毒备用。按照10mg：10ml的比例配置盐酸-胃蛋白酶溶液，大鼠脱细胞肺组织粉末按照10mg/ml比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌48小时至溶解状态，在4℃且10000rpm/min离心去除未溶解物质；通过加入0.1m氢氧化钠和10×pbs调至生理状态(ph＝7.4)，并置于37℃直至形成胶状的肺基质水凝胶。

实施例四：

一种采用上述任一实施例制备方法制作的肺基质水凝胶在治疗重症急性胰腺炎肺损伤药物中的应用。重症急性胰腺炎为急性坏死性胰腺炎。重症急性胰腺炎肺损伤是与重症急性胰腺炎相关的肺损伤。

实施例五：

一种治疗重症急性胰腺炎肺损伤药物，包括上述任一实施例肺基质水凝胶的制备方法制作的肺基质水凝胶。

本发明的肺基质水凝胶可以用于制备修复重症急性胰腺炎肺组织或使其再生的药物。所述肺基质水凝胶为大鼠肺来源的脱细胞化细胞外基质，其中肺基质水凝胶具有温敏性，可通过注射的方式输送到肺组织受损部位，在体温即可转变为水凝胶形式，其不但可为受损的肺泡上皮细胞提供接近天然的肺组织微环境，而且可以抑制炎症状态下出现的肺泡上皮细胞过度凋亡，因此肺基质水凝胶降低了细胞的过度凋亡，进而保护了肺功能。

下面结合具体实验对本发明做进一步说明：

(一)肺基质水凝胶的制备：

(1)取大鼠新鲜心、肺，剪去表面的脂肪组织和外膜。用22g套管针经右心室插入肺动脉并固定。用22g套管针经右心室插入肺动脉并固定，设置卡片式蠕动泵速度为5ml/分钟，将0.1％十二烷基硫酸钠预充至整个灌注管道，分别采用0.1％十二烷基硫酸钠灌注2h，去离子水灌注15分钟，1％tritonx-100溶液灌注10分钟，添加双抗的pbs灌注72小时，直至组织透明，最后采用dnase溶液灌洗1次后，用生理盐水漂洗3-5次，去除残余的洗涤剂。脱细胞化的肺储存于-80℃。

(2)肺脱细胞鉴定：将脱细胞化的肺组织切片直接用otc包埋，做冰冻切片后，一方面用苏木素和伊红染色观察细胞残留情况，如图1，可见没有细胞核残留；另一方面，用免疫荧光染色观察胞外基质成分保留情况，所制备的肺脱细胞基质保留了i型胶原、iv型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等主要细胞外基质成分。

(3)将脱细胞的大鼠肺组织置于低温冻干机上进行干燥，用粉碎机将其磨成粉末，并在使用前通过暴露于环氧乙烷中16小时进行灭菌。

(4)按照10mg/ml浓度将上述肺脱细胞粉末溶解于盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，超速离心除去未消化的大颗粒物，取上清液低温储存待用。

(5)通过加入0.1m氢氧化钠和10xpbs调至生理状态(ph＝7.4)，使水凝胶终浓度为8mg/ml，置于37℃数分钟即可成肺基质水凝胶。扫描电镜检测显示ecm水凝胶(肺基质水凝胶)呈现为多孔状结构，不同粗细ecm纤维呈网状分布，如图2。

(二)肺基质水凝胶生物相容性检测：

通过皮下注射肺基质水凝胶(以商业化的胶原水凝胶作对照)于大鼠腋窝皮下，观察其生物相容性，he染色结果显示胶原水凝胶组可见较多的炎性细胞浸润，ecm水凝胶材料可均匀分布于皮肤组织，如图3，没有明显的炎性细胞浸润，这表明肺ecm水凝胶具有良好的组织相容性。

(三)动物的选择和sap模型制备：

实验用sd大鼠(250-300g左右)，用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，行开腹术，充分暴露胰腺，使用微量输液泵以12ml/h速度逆行向胰胆管注入5％牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g大鼠体重)，维持10min后关腹。3小时后可以看到腹腔内胰腺坏死、肺脏出血和血氧分压下降，如图4。

(四)肺基质水凝胶保护肺组织：

(1)肺基质水凝胶移植sap大鼠肺：通过环甲膜穿刺气管注射配合体位变化，内注射于成功造模的sap大鼠肺组织，24后取材观察其对肺损伤的修复情况，气管注射后ecm水凝胶在局部肺组织内均匀分布。

(2)肺基质水凝胶可调控肺泡上皮细胞过度凋亡：通过tunel凋亡荧光测试试剂盒检测肺泡上皮细胞凋亡情况，结果显示该水凝胶局部注射sap模型后，注射水凝胶的损伤部位肺泡上皮细胞过度凋亡受到明显抑制，这表明肺基质水凝胶可通过提供天然肺组织微环境进而调控肺泡上皮细胞过度凋亡，如图5所示。

(3)肺基质水凝胶可改善肺组织功能：肺基质水凝胶移植后，可见大鼠动脉血气分析检测，结果显示与sap组比较，ecm组血清氧分压水平显著升高，如图6；肺组织白细胞浸润标志物mpo降低，如图7；这表明肺ecm水凝胶降低了肺的炎性浸润程度，改善了肺功能。

以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。