一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法与流程

本发明采用天然澄清剂的澄清工艺和现代分析检测仪器检测中药制剂技术领域，涉及一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺质量控制方法。

背景技术：

身体皮肤以眼周部分最薄，且黑色素活动非常旺盛，加上年龄增长、外来刺激等因素作祟，很容易出现各种问题，黑眼圈的出现就在所难免！所谓黑眼圈，即为当眼部静脉血管血流速度过于缓慢，眼部皮肤红血球细胞供养不足，静脉血管中二氧化碳及代谢废物积累过多，形成慢性缺氧，血液较暗并形成滞留以及眼部色素沉着在眼部形成的青蓝色或深褐色的阴影。黑眼圈常表现为下睑皮肤颜色灰暗，包括过多的色素沉着、皮肤松弛和泪槽形成的阴影、下睑皮肤的菲薄和透明化，影响面部美观。医学界对黑眼圈越来越多的重视主要源于美容界近些年来对它越来越多的关注，尽管它既不会威胁健康，也不会造成疾病而引起任何病理性改变，但是它会严重影响个人的情绪和自我感受。尤其很多女性被其严重困扰，甚至影响到她们的生活质量。黑眼圈会使人看起来疲倦、悲伤、无精打采，这使得很多人在工作和社交时要对黑眼圈进行掩饰。中医认为，眼圈发黑是肾亏所致，黑乃肾之本色，眼晴靠五脏精气的滋养，如房事过度，肾精亏少则两目缺少精气的滋润，而肾之黑色浮于上所以两目无神，眼圈发黑。中医称“睑黡”。临床表现：男女都可发病，女多于男；可见于任何年龄，少数自青春期开始发病；患者大多无自觉症状；皮损特点为上下眼睑的皮肤呈现青黑色，界限清楚；可伴有精神紧张、面无光泽、神情憔悴、用眼疲劳、月经不调、甲亢等病史；睡眠不足，夜生活频繁，吸烟喝酒可致本病加重。开发治疗黑眼圈效果更好的天然药物已经成为药物学家和皮肤学家普遍关心的科学问题。如专利申请号201110400186.6，该申请中公开了一种具有祛除黑眼圈功效的中药组合物、制剂及其制备方法，所述组合物由下述重量份配比的原料药组成：黄芪40-60份、葛根10-30份、枳实10-30份、姜黄10-30份。再如专利申请号201210245706.5，该专利公开了一种抗黑眼圈眼霜，其配方按重量份包括如下组分：茉莉纯露50-60：貂油8-12：葛根油7-9：橄榄油1-3：小烛蜜蜡1-2：植物美白剂1-2：植物胶原蛋白1-2：防腐剂0.8-1.2。再如专利申请号201210295087.4，该专利公开了一种抗黑眼圈脂质纳米粒乳液及其制备方法，所述乳液包括以下组分，乳香树脂提取物、欧洲七叶树籽提取物、四氢胡椒碱的混合物0.5-7.3％，硬脂酸单甘酯或植物油脂或硬脂酸单甘酯与植物油脂的混合物1.0-19.6％乳化剂0.5-11.8％，防腐剂0.006-1.3％，余量为水。再如专利申请号201010563016.5，该专利公开了一种黑眼圈增白抗皱霜。由70-80％的水、5-10％丁二醇、1-3％的硬脂醇、1-3％的聚山梨醇酯-60、1-3％的甘油硬脂酸、1-3％的山梨坦硬脂酸酯、2-6％的霍霍巴油、0.5-2％的维生素e、0.5-2％的辅酶q10、0.5-2％的二棕榈酰羟脯氨酸、0.1-1％的薰衣草油、0.1-1％的极大螺旋藻提取物、0.1-1％麦饭石和0.1-1％的双(羟甲基)咪唑烷基脲组成。由于不少化学品会对皮肤造成不可逆转的伤害，而天然植物化妆品不使用化学药品，对皮肤无刺激性，并能够帮助皮肤逐渐恢复正常功能，因此天然植物化妆品备受消费者青睐。

中药复方制剂的制备经常包括提取过程，而得到的中药提取物是一个复杂的混合体系，包括活性成分和杂质，其中含有大量的微细粒子、淀粉、鞣质、蛋白质、多糖等物质(偶有药材残渣，泥沙等杂质)，共同形成1-100knm是胶体分散体系，属于动力学及热力学不稳定体系，具有自发沉降的趋势。为保留活性成分，除去这些杂质，使固液迅速而完全地分离，就要设法破坏混合体系的稳定性。中药复方制剂多采用水提醇沉工艺，该工艺具有澄清药液、减少服用量等优点。但该工艺在澄清药液同时将中药中的一些醇不溶性的大分子如蛋白质及部分多糖作为杂质除去，而这些成分具有广泛的生理活性和药用价值。絮凝澄清法是在混悬的中药提取液中加入一种澄清剂以吸附架桥和电中和方式除去溶液中的粗粒子，以达到分离纯化目的的一种高效技术，ztcl+1天然澄清剂是一种从食品中提取，以天然多糖等为原料制成的天然高分子物质，由a、b2种组分组成，其澄清原理是采用“l+1”澄清技术，其中1组分起主絮凝作用，另1组分起辅助絮凝作用，具有较好的澄清效果。

随着科学的发展，分析仪器的普及应用，使中药复方检测分析和质量控制不断提高和完善。薄层色谱法(tlc)，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。高效液相色谱检测分析技术在中药质量控制中发挥越来越重要的作用。它是通过光谱色谱等分析手段对中药或复方进行成分检测，利用不同成分特有的化学图谱，反映中药或复方所含的内在化学成分的种类和含量。

本发明的具有治疗黑眼圈由白花败酱、六月青、毛冬青、透骨草、积雪草、天山雪莲、金挖耳和飞机草8味药材组成，其活性成分较多，依据2015版中国药典，各组分药材的色谱条件与系统适用性试验方法各不相同，逐一测定复方中各药材的目标成分含量，不利于评价和控制复方中药的质量，且保证其药效成分的稳定性和数量。

本发明根据文献记载和大量实验筛选，从大量的天然植物中，选用了白花败酱、六月青、毛冬青、透骨草、积雪草、天山雪莲、金挖耳和飞机草为原料，制备获得了所述的具有治疗黑眼圈作用的药物组合物，其中，所述的白花败酱选用败酱科植物patriniavillosajuss.的干燥全草；六月青选用爵床科植物肖鸡笼taraphochlamysaffinis(griff)bremekhu[strobilanthesaffinis(griff)y.c.tang]的干燥地上部分；毛冬青选用冬青科冬青属植物毛冬青(ilxpubescenshook.etam.)的干燥根；透骨草选用紫葳科角蒿属草植物incarrilleasinensislam.的干燥全草；积雪草选用积雪草属伞形科植物centellaasialica(l.)的干燥全草；天山雪莲选用菊科风毛菊属雪莲亚属草本植物saussureainvolucrate(kar.etkir.)sch.bip的干燥花；金挖耳为菊科天名精属植物carpesiumdivaricatumsieb.etzucc.的干燥全草；飞机草选用菊科泽兰属多年生草本植物eupatoriumodoratuml.的干燥全草。

根据文献记载：

六月青为爵床科植物肖鸡笼taraphochlamysaffinis(griff)bremekhu[strobilanthesaffinis(griff)y.c.tang]的干燥地上部分，是一种广西民间草药，《本草拾遗》记载其根能活血、凉血、疏肝泻湿、消肿止痛，目前临床主要用于急慢性肝炎、黄疸等病的治疗。

白花败酱(phylanthusurinarial.)是败酱草的来源之一，为败酱科多年生草本植物白花败酱patriniavillosajuss.的干燥带根全草，又名苦菜、苦斋、鹿肠，广泛分布于我国南方各省，因含有多种氨基酸、维生素和矿物质等有益成分而被广泛食用。败酱始载于《神农本草经》，具有清热解毒，利湿排脓，活血化瘀，镇心安神的功效，临床上常用于治疗阑尾炎，肺脓痈，结核瘰疬，痈肿疮毒，肠炎，痢疾，肝炎，扁桃体炎，眼结膜炎，产后瘀血腹痛，咯血，衄血，神经衰弱，心脏神经官能症等。药理学研究表明，败酱草具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、镇静和升高白细胞等作用，毒副作用极小。

毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青(ilxpubescenshook.etam.)的干燥根或叶，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒的功效，是我国南方常用的中药材。毛冬青的化学成分研究表明其主要含有三萜及其苷、木脂素、环烯醚萜等类型化合物，其中三萜及其苷类是毛冬青的主要成分。药理学研究显示毛冬青具有抗动、静脉血栓、扩张外周血管、抑制血小板聚集、调节机体免疫状态等作用，临床上，毛冬青各类制剂广泛用于治疗冠心病、脑血栓、血栓性脉管炎、糖尿病足等多种疾病。

透骨草是紫葳科角蒿属草植物incarrilleasinensislam.的干燥全草，别名疥草、毒蛆草、接生草。主要分布在辽宁、吉林、河北、河南、山东、陕西等地，性味甘、辛，温，入肺、肝二经，具有祛风、除湿、舒筋活血、止痛等功效，临床上用于治疗风湿痹痛、寒湿脚气、阴囊湿疹，疮疡肿毒等症。

积雪草是积雪草属伞形科植物centellaasialica(l.)的干燥全草，又名连线草、地线草、老公根等。积雪草为多年生匍匐草本植物，常卷缩成团状，其茎细长，结节生根。原产于印度，现广泛分布于世界热带、亚热带区，在我国主要分布于长江以南各省。积雪草喜生于湿润的河岸、沼泽、草地中。陶弘景曰：此草以寒凉得名，其性大寒，故名积雪草。积雪草始载于《神农本草经》，具有清热解毒、消肿利湿之功效。用于湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤。药理研究表明：积雪草提取物具有出色的愈合伤口和疤痕修复作用，其原因在于积雪草苷有促进体内胶原合成和新血管生成、刺激肉芽生长等重要作用，故而有利于伤口愈合。如在皮肤创面上连续施用含积雪草苷的制剂，可防止伤口感染化脓，缩短伤口愈合时间，可降低皮肤硬度和改善皮肤营养，促进新陈代谢作用。

天山雪莲是菊科风毛菊属雪莲亚属草本植物saussureainvolucrate(kar.etkir.)sch.bip的干燥花，又名新疆雪莲、大苞雪莲。天山雪莲是新疆特有的名贵中草药，当地人奉雪莲为“百草之王”、“药中极品”。天山雪莲生长于雪线以上海拔在2600-4000米的高山砾石及石缝里。在天山南北坡均有分布，特别是在新疆的伊犁地区有着丰富的资源。早在清代《本草纲目拾遗》中已有对天山雪莲的记载，称雪莲“性大热，能补精益阳”。《新疆中草药》称：“雪莲性温、微苦，功能祛风除湿”。目前对天山雪莲的研究结果表明，其有效成分主要为黄酮类化合物和多糖。天山雪莲具有祛风湿、通经活血、暖宫散瘀、壮阳补血等功效，临床用于治疗风湿痹痛、月经不调、宫冷小腹冷疼、肾虚腰痛、麻疹不透等症。近年来，雪莲作为民族药在抗早孕、抗衰老及抑制肿瘤细胞增殖方面的作用倍受关注。

金挖耳为菊科天名精属植物carpesiumdivaricatumsieb.etzucc.，生长于山野草丛中，主要分布于四川、贵州、湖南、福建以及东北等地。其根及茎基部均可供药用。其味辛苦涩，性凉无毒常用作清热解毒剂，治疗感冒、头风、泄泻、咽喉肿痛、赤眼、痈肿疮毒、痔核出血等症。

飞机草为菊科泽兰属多年生草本植物eupatoriumodoratuml.，在我国主要分布于广东、海南、广西、云南、贵州(西南部)等地。飞机草全草入药，在我国亦是民间常用草药，具有散瘀消肿、解毒、止血和杀虫功效，主要用于跌打肿痛、疮疡肿毒、皮炎和外伤出血。现代药理学研究表明飞机草叶的提取物具有抑制绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌的活性，并可促进伤口的愈合。

综上所述，黑眼圈的形成主要与色素沉着和血管改变有关，其原因主要与一些不良生活习惯如熬夜、吸烟、饮酒、情绪困扰及使用化妆品情况有关。目前黑眼圈缺乏有效的外用护肤品，本发明的有益效果在于根据黑眼圈的病因和病理机制，查阅了大量专著和文献，先后筛选多种天然植物，终于筛选并澄清得到能够有效治疗黑眼圈的药物组合物。目前，国内外尚未见将白花败酱、六月青、毛冬青、透骨草、积雪草、天山雪莲、金挖耳和飞机草的组合物用于治疗黑眼圈的相关报道。本发明的药物组合物原料获取简单，制备方法便捷。临床试验结果证实：本发明的药物组合物治疗黑眼圈效果具有良好的效果，对皮肤无刺激性和致敏性，易于被广大消费者接受，具有良好的应用前景和市场前景。

技术实现要素：

本发明目的在于根据现代技术，提供一种具有治疗黑眼圈作用的中药药物组合物的快速澄清、高效质量控制方法，从整体上评价和控制药物组合物质量，保证治疗黑眼圈中药的疗效更加稳定、可靠。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺，取治疗黑眼圈作用的中药制剂常规乙醇浸泡提取，浸泡液减压浓缩，浓缩液用大孔树脂吸附，5％-95％的乙醇洗脱，洗脱液浓缩，即为所述的治疗黑眼圈作用的药物组合物，置于60℃水浴，先加入4％洗脱液体积的ii型ztcl+1天然澄清剂b组分，1h后加入2％体积的ii型ztcl+1天然澄清剂a组分，期间每半小时搅拌1分钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液；所述的ii型ztcl+1天然澄清剂：它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由a、b两个组分组成，a组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶，配成1％的水溶液使用；b组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1％醋酸配成1％浓度的溶液使用。

a组分，精密量取1.0gii型ztcl+1天然澄清剂加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100ml的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤；

b组分，精密量取1.0gii型ztcl+1天然澄清剂加入少量体积分数为1％的醋酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1％的醋酸溶液配制成100ml的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤。

一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的质量控制方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)用薄层色谱法鉴别该药物中药材六月青，包括：

a.供试样品的制备：取本品药物组合物10ml，加乙醇10ml，振摇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液；

b.对照品溶液的制备：取桦木醇对照品2mg，加乙醇10ml，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为六月青对照品溶液；

c.六月青薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，分别吸取对照药材溶液和样品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯(6∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，白光下检视；

(2)用薄层色谱法鉴别该药物中药材透骨草，包括：

a.供试样品的制备：取本品药物组合物10ml，加乙醇40ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

b.对照药材溶液的制备：取透骨草对照药材1mg，加乙醇40ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

c.透骨草薄层色谱鉴别：依照薄层色谱法试验，分别吸取透骨草对照药材溶液和供试样品2种溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；

(3)用薄层色谱法鉴别该药物中药材天山雪莲，包括：

a.供试样品的制备：取本品药物组合物2ml，放入分液漏斗，加甲醇20ml，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

b.对照药材溶液的制备：取天山雪莲对照药材1g，加甲醇20ml，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作成对照品溶液；

c.天山雪莲薄层色谱鉴别：依照薄层色谱法试验，分别吸取天山雪莲对照药材溶液和供试样品各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％亚硝酸钠的1％甲醇溶液显色，加热至斑点显色清晰，置白光下检视；

(4)用高效液相色谱法测定药物中白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮和芹菜素的含量，包括：

a.高效液相色谱条件：inertsilods-3色谱柱，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈a水，梯度洗脱为0～10min30％a→35％a、10～45min35％a→45％a、45～60min45％a→75％a，平衡时间15min，流速0.8ml/min，进样量10μl，柱温24℃，pda检测器采集范围：190～400nm；检测波长360nm和210nm；

b.供试品溶液的配制：取治疗黑眼圈作用的中药制剂，常规乙醇浸泡提取24小时，用纱布过滤，减压浓缩为原重量的2％-5％，浓缩液上大孔树脂吸附，5％-95％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，加甲醇定容至即每毫升药液含1g原药，用甲醇稀释5、10、15倍备用；

c.对照品溶液的制备：精密称取白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮和芹菜素5种对照品各2mg，分别加甲醇配制不同倍数质量浓度的对照品溶液；

d.线性关系考察：分别精密吸取上述不同浓度的5种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10μl，以测得的响应信号和浓度进行线性回归，得到5种标准品的回归方程；

e.测定法：分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定。

作为优选的，具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法的供试品溶液为醇提液，具体方法为：取治疗黑眼圈作用的中药制剂，常规乙醇浸泡提取24小时，用纱布过滤，减压浓缩为原重量的2％-5％，浓缩液上大孔树脂吸附，5％-95％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，加甲醇定容至即每毫升药液含1g原药，用甲醇稀释5、10、15倍备用。

优选的，所述的具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法，，其特征在于：用于提取方法相同的治疗黑眼圈片剂，颗粒剂或药物组成含有白花败酱、六月青、毛冬青、透骨草、积雪草、天山雪莲、金挖耳和飞机草药材的复方。

优选的，在具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法中：供试品稀释5倍，过0.22μm滤膜，10μl进液相色谱仪、白花败酱醇的含量为：15.21μg/ml、毛冬青苷b的含量为：10.26μg/ml、积雪草苷的含量为：28.45μg/ml、天名精内酯酮的含量为：37.07μg/ml、芹菜素的含量为：41.42μg/ml。

优选的，所述的薄层色谱法鉴别六月青、透骨草和天山雪莲中，六月青以正丁醇-乙酸乙酯(6∶1)作为展开剂，喷5％香草醛溶液显色、透骨草以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂，天山雪莲以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)作为展开剂，喷以1％亚硝酸钠的1％甲醇溶液显色。

本发明以白花败酱药材的鉴定成分白花败酱醇，毛冬青的鉴定成分毛冬青苷b，积雪草的鉴定成分积雪草苷，金挖耳的鉴定成分天名精内酯酮和飞机草的鉴定成分天芹菜素含量测定为指标，该方法避免了药物组成药材中药物成分在同一色谱条件下响应(峰)的重叠，以5种活性成分的含量测定为控制标准，更加合理、真实地反映一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的质量。

说明书附图

图1是六月青对照药材图。

图2是透骨草对照药材图。

图3是天山雪莲对照药材图。

图4是210nm波长下白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮4种对照品的色谱图。

图5是360nm波长下芹菜素的色谱图。

图6是治疗黑眼圈的药物组合物360nm波长下hplc色谱图。

图7是治疗黑眼圈的药物组合物210nm波长下hplc色谱图。

图8是阴性样品360nm波长下的hplc色谱图。

图9是阴性样品210nm波长下的hplc色谱图。

具体实施方式

本发明一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法，该澄清工艺按如下步骤进行：

澄清工艺及各成分含量

(1)澄清剂的配制：ii型ztcl+1天然澄清剂由a，b两组分组成。a组分：精密量取1.0ga组分中加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100ml的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤即得。b组分：精密量取1.0gb组分中加入少量体积分数为1％的醋酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1％的醋酸溶液配制成100ml的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤，即得。

(2)澄清剂a、b加入顺序：根据说明书，ztc天然澄清剂主要是根据溶液的性质选择不同的添加顺序，一般中药复方相对于蛋白质等电点(ph＝4.8)为酸性环境，添加顺序为先b后a组分，b组分用量为a组分2倍。

(3)评价指标：分别选取白花败酱醇含量保留率(x1)、毛冬青苷b含量保留率(x2)、积雪草苷含量保留率(x3)、天名精内酯酮含量保留率(x4)、芹菜素含量保留率(x5)、固形物去除率(x6)作为评价指标进行综合评分，将化合物保留率权重定为0.7，固形物去除率x2权重定为0.3，即od％＝(0.7x1+0.7x2+0.7x3+0.7x4+0.7x5)/5+0.3x6。计算公式如下：

化合物保留率＝澄清后提取液化合物的含量/提取液中化合物的含量×100％

固形物去除率＝(澄清前固形物含量-澄清后固形物含量)/澄清前固形物含量×100％

(4)工艺考察：以澄清剂加入量，料液比，温度，时间为考察因素，各选取最佳的3水平，以l9(3¹)正交表进行试验，以化合物保留率和固形物去除率计算综合评分，进行方差分析，结果见表2。由正交试验的方差分析可以看出，澄清剂加入量及提取液料液比对综合评分有显著影响，温度和时间对提取液的澄清效果无统计学意义。试验中发现，澄清剂b组分为4％时治疗黑眼圈的澄清效果好，确定ii型ztcl+1天然澄清剂澄清治疗黑眼圈提取液的最佳工艺条件为澄清剂加入量b组分4％，b组分为2％料液比为1∶5，温度为60℃，反应时间1h。

表2l9(3⁴)正交试验结果

(5)各成分含量：以ii型ztcl+1天然澄清剂澄清治疗黑眼圈提取液的最佳工艺条件：澄清剂加入量b组分4％，b组分为2％料液比为1∶5，温度为60℃，反应时间1h，制备样品。高效液相色谱条件：inertsilods-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流速0.8ml/min，柱温24℃，pda检测器采集范围：190～400nm；检测波长360nm和210nm，进样10μl。选择210nm和360nm双波长分别测定白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮和芹菜素含量。样品连续进针3次，取平均值。按本发明质量控制方法测得每克生药，白花败酱醇的含量为：15.21μg/ml、毛冬青苷b的含量为：10.26μg/ml、积雪草苷的含量为：28.45μg/ml、天名精内酯酮的含量为：37.07μg/ml、芹菜素的含量为：41.42μg/ml。

本发明一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法，该质量控制方法按如下步骤进行：

(1)供试品溶液的配制：取治疗黑眼圈处方剂量，常规醇提取(前2次，每次1h，第3次45min)，合并提取液，用纱布过滤，减压回收得粗提液，加甲醇定容至每毫升药液含1g原药。同时，用甲醇稀释至5、10、15倍备用。

(2)对照品溶液的制备精密称取白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮和芹菜素5种对照品各2mg，分别加甲醇配制不同倍数质量浓度对照品溶液。

(3)线性关系考察：分别精密吸取上述不同浓度的5种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10μl，以测得的响应信号(峰面积)和浓度进行线性回归，得到5种标准品的回归方程。白花败酱醇y＝28901x+7698.6(r²＝0.9993)，浓度在2.79～45μg/ml范围线性良好；毛冬青苷by＝14381x+16236(r²＝0.9997)，浓度在4.34～65μg/ml范围线性良好；积雪草苷y＝25394x+24497(r²＝0.9997)，浓度在1.54～57.5μg/ml范围线性良好；天名精内酯酮y＝4272.8x+60438(r²＝0.9994)，浓度在5.81～64μg/ml范围线性良好；芹菜素y＝6236.4x+25074(r²＝0.9995)，浓度在2.91～58.3μg/ml范围线性良好。

(4)测定方法：照高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性和inertsilods-3色谱柱，流动相见表1，平衡时间15min，流速0.8ml/min，进样10μl，柱温24℃，pda检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm。

表1流动相梯度洗脱表

(5)对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括精密度、重复性、稳定性等。

2.具有治疗黑眼圈作用的药物组合物中六月青，透骨草和天山雪莲用薄层色谱法鉴别：

(1)六月青薄层色谱法鉴别

供试样品的制备：取本品药物组合物10ml，加乙醇10ml，振摇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：取桦木醇对照品2mg，加乙醇10ml，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为六月青对照品溶液；

六月青薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，分别吸取对照药材溶液和样品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯(6∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，白光下检视；

(2)透骨草薄层色谱法鉴别

供试样品的制备：取本品药物组合物10ml，加乙醇40ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照药材溶液的制备：取透骨草对照药材1mg，加乙醇40ml，超声提取30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；

透骨草薄层色谱鉴别：依照薄层色谱法试验，分别吸取透骨草对照药材溶液和供试样品2种溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；

(3)天山雪莲薄层色谱法鉴别

供试样品的制备：取本品药物组合物2ml，放入分液漏斗，加甲醇20ml，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

对照药材溶液的制备：取天山雪莲对照药材1g，加甲醇20ml，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作成对照品溶液；

天山雪莲薄层色谱鉴别：依照薄层色谱法试验，分别吸取天山雪莲对照药材溶液和供试样品各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％亚硝酸钠的1％甲醇溶液显色，加热至斑点显色清晰，置白光下检视；

本发明一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法，优选的供试品溶液的制备：该方法公示品溶液的制备：取治疗黑眼圈作用的中药制剂，常规乙醇浸泡提取24小时，用纱布过滤，减压浓缩为原重量的2％-5％，浓缩液上大孔树脂吸附，5％-95％乙醇洗脱，浓缩洗脱液，加甲醇定容至即每毫升药液含1g原药。

本发明一种具有治疗黑眼圈作用的药物组合物的澄清工艺和质量控制方法中，优选的测定方法：高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性试验：inertsilods-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流速0.8ml/min，柱温24℃，pda检测器采集范围：190～400nm；检测波长360nm和210nm，进样10μl。

本发明所述的质量控制方法，由于白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮的最大吸收波长分别为210nm，229nm，204nm，211nm，飞机草最大吸收波长为360nm，故选择210nm和360nm双波长分别测定白花败酱醇、毛冬青苷b、积雪草苷、天名精内酯酮种芹菜素含量。

本申请发明人经考察获知，当采用乙腈-水，乙腈-甲酸水，甲醇-水体系作为流动相梯度洗脱时，药物成分分离不理想，运用乙腈-甲酸水体系洗脱，药物各成分没有重叠，且峰形优异。本实验方案通过对药物活性成分含量的质量控制，从整体上评价和控制药物组合物质量，更加合理、真实地反映一种治疗黑眼圈的中药药物组合物的药品质量。