本发明涉及生物领域中保护受损肝细胞的产品及其应用。
背景技术：
：伴随着人们饮食结构的重大改变，过多的酒精和高热量食物的摄入直接导致肝脏损伤，主要体现在脂肪肝、酒精性肝中毒的高发，肝功指标的失衡等现象。流行病学调查发现由于不良生活习惯造成的肝脏损伤情况日益高发并逐步趋于年轻化，是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。肝脏是人体内的一个重要器官，参与代谢和免疫系统的多种生理活动，发挥着解毒、代谢、分泌胆汁、调节循环血量、免疫防御的功能，其中体内和体外的许多营养和非营养物质都是需要通过肝脏进行生物转化，将其彻底分解成无毒或毒性较小的物质排出体外。肝细胞受多种因素的影响，如酒精刺激、甘油三酯堆积都会引发肝脏的代谢平衡失调，造成肝损伤。当肝脏细胞发生损伤后，促使细胞发生破裂，直接导致血液中转氨酶的升高；伴随着细胞受损的进程，肝脏内会聚集大量的细胞活性氧，在氧化应激的刺激下，细胞的抗氧化活性下降，加速损伤进程，引发脂肪代谢失衡，因此肝脏受损后极易发生脂肪肝的病症。同时损伤的肝组织在体内游离脂肪酸的氧化应激作用下会发生炎症反应，逐步演变为肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至是肝癌。研发保护受损肝细胞的产品对护肝药物的开发具有重要作用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何保护受损肝细胞。为了解决以上技术问题，本发明提供了保护受损肝细胞的产品。本发明所提供的保护受损肝细胞的产品(食品、保健品或/药物)的活性成分为组合物，所述产品的活性成分为组合物，所述组合物由毛木耳提取物和灰树花提取物组成；所述毛木耳提取物由包括下述步骤的方法制备：用乙醇沉淀去除蛋白的毛木耳子实体水提液，收集沉淀，得到所述毛木耳提取物；所述去除蛋白的毛木耳子实体水提液是去除毛木耳子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述毛木耳子实体水提液是用水从毛木耳子实体中提取出来的水溶性物质；所述灰树花提取物由包括下述步骤的方法制备：用乙醇沉淀去除蛋白的灰树花子实体水提液，收集沉淀，得到所述灰树花提取物；所述去除蛋白的灰树花子实体水提液是去除灰树花子实体水提液中的蛋白后得到的液体；所述灰树花子实体水提液是用水从灰树花子实体中提取出来的水溶性物质。上述产品中，所述组合物中，所述灰树花提取物和所述毛木耳提取物以所含的多糖质量计的质量比为2:3。上述产品中，所述毛木耳子实体水提液按照包括如下步骤的方法制备：用水浸泡粉碎后的毛木耳子实体8-12小时(如8小时)，加热至90-100℃(如90℃)保持3-4小时(如4小时)，收集水溶性物质，该水溶性物质即为毛木耳子实体水提液；所述灰树花子实体水提液按照包括如下步骤的方法制备：用水浸泡粉碎后的灰树花子实体8-12小时(如8小时)，加热至90-100℃(如90℃)保持3-4小时(如4小时)，收集水溶性物质，该水溶性物质即为灰树花子实体水提液。上述产品中，所述水可为去离子水。上述产品中，所述毛木耳子实体和所述灰树花子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。上述干燥的子实体是将新鲜的毛木耳子实体在常温(如20-25℃)下干燥得到的。上述产品中，所述收集水溶性物质可采用离心的方法进行，所述离心采用的离心力可为6000g-15000g(如6000g)，离心时间可为20-30分钟(如30分钟)。上述产品中，所述产品还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。上述产品中，所述保护受损肝细胞为下述1)-5)中的5种、4种、3种、2种或1种：1)提高受损肝细胞的存活率；2)提高受损肝细胞的sod酶活性；3)降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；4)降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；5)降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。上述产品中，所述提高受损肝细胞的存活率为a1和/或b1，所述a1为在含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率高于在不含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的存活率；含所述组合物的培养基与不含所述组合物的培养基的区别仅在于含所述组合物的培养基中含有所述组合物，不含所述组合物的培养基中不含所述组合物，其它完全相同；所述b1为所述组合物与所述毛木耳提取物相比提高受损肝细胞的存活率，并且所述组合物与所述灰树花提取物相比也提高受损肝细胞的存活率；所述提高受损肝细胞的sod酶活性为a2和/或b2，所述a2为在含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的sod酶活性高于在不含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的sod酶活性；含所述组合物的培养基与不含所述组合物的培养基的区别仅在于含所述组合物的培养基中含有所述组合物，不含所述组合物的培养基中不含所述组合物，其它完全相同；所述b2为所述组合物与所述毛木耳提取物相比提高受损肝细胞的sod酶活性，并且所述组合物与所述灰树花提取物相比也提高受损肝细胞的sod酶活性；所述降低受损肝细胞内的甘油三酯含量为a3和/或b3，所述a3为在含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量低于在不含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的细胞内甘油三酯含量；含所述组合物的培养基与不含所述组合物的培养基的区别仅在于含所述组合物的培养基中含有所述组合物，不含所述组合物的培养基中不含所述组合物，其它完全相同；所述b3为所述组合物与所述毛木耳提取物相比降低受损肝细胞内的甘油三酯含量，并且所述组合物与所述灰树花提取物相比也降低受损肝细胞内的甘油三酯含量；所述降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量为a4和/或b4，所述a4为在含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量低于在不含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；含所述组合物的培养基与不含所述组合物的培养基的区别仅在于含所述组合物的培养基中含有所述组合物，不含所述组合物的培养基中不含所述组合物，其它完全相同；所述b4为所述组合物与所述毛木耳提取物相比降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量，并且所述组合物与所述灰树花提取物相比也降低受损肝细胞的谷丙转氨酶的释放量；所述降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量为a5和/或b5，所述a5为在含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量低于在不含所述组合物的培养基中培养的所述受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量；含所述组合物的培养基与不含所述组合物的培养基的区别仅在于含所述组合物的培养基中含有所述组合物，不含所述组合物的培养基中不含所述组合物，其它完全相同；所述b5为所述组合物与所述毛木耳提取物相比降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量，并且所述组合物与所述灰树花提取物相比也降低受损肝细胞的谷草转氨酶的释放量。本发明中，所述组合物与所述毛木耳提取物以及所述组合物与所述灰树花提取物在肝细胞的存活率方面的比较、肝细胞的sod酶活性方面的比较、肝细胞内的甘油三酯含量方面的比较、肝细胞的谷丙转氨酶的释放量方面的比较、肝细胞的谷草转氨酶的释放量方面的比较均是基于相同的用量(如相同的多糖作用浓度)的所述组合物、所述毛木耳提取物和所述灰树花提取物进行的。上述组合物在制备上述保护受损肝细胞产品(食品、保健品或/药物)中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物在提高受损肝细胞的存活率方面、在降低胞内甘油三酯方面、在提高细胞内sod酶活性方面、在降低胞外谷丙转氨酶含量方面和降低谷草转氨酶含量方面均产生了协同作用：灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物对人受损肝细胞的存活率的提高率为128.39％，显著高于毛木耳提取物组对受损肝细胞存活率的提高率(10.31％)和灰树花提取物组受损肝细胞的存活率的提高率(41.56％)之和；灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物对甘油三酯降低率为40.93％，高于毛木耳提取物组对胞内甘油三酯降低率(15.40％)和灰树花提取物组对胞内甘油三酯降低率(23.94％)之和；灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物对人受损肝细胞内sod酶活性的提高比率为122.60％，显著高于毛木耳提取物组对细胞内sod酶活性的提高比率(13.45％)和灰树花提取物组细胞内sod酶活性的提高比率(50.96％)之和；灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物对人受损肝细胞的胞外alt的降低率为60.87％，胞外ast的降低率为61.03％，显著高于毛木耳提取物组的胞外alt的降低率(36.12％)和灰树花提取物组的胞外alt的降低率(52.53％)，显著高于毛木耳提取物组的胞外ast的降低率(31.06％)和灰树花提取物组的胞外ast的降低率(45.53％)。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的毛木耳为毛木耳(auriculariapolytricha(mont.)sacc.)3号(赵爽等.毛木耳菌丝体产多糖发酵条件的优化.食品科技.2012年第37卷第4期)公众可从北京市农林科学院获得该菌种，以重复本申请实验。下述实施例中的灰树花为灰树花(grifolafrondosa)l号(又称灰树花-1(grifolafrondosa(dicks.)gray)已于2013年4月9日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，chinaforestryculturecollectioncenter，英文缩写cfcc，简称林业微生物中心)，保藏号为cfcc89544，自该收藏日起公众可从cfcc获得该菌株。下述实施例中的红灵芝为红灵芝(ganodermasp.)已于2013年4月9日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，chinaforestryculturecollectioncenter，英文缩写cfcc，简称林业微生物中心)，保藏号为cfcc89543，自该收藏日起公众可从cfcc获得该菌株。下述实施例中的l-o2细胞株(人肝细胞)为中国医学科学院肿瘤细胞库的产品。下述实施例中的rpmi1640培养液为invitrogen公司产品，产品目录号为11875-093。实施例1、保护受损肝细胞1、毛木耳提取物、灰树花提取物和红灵芝提取物的制备1.1毛木耳提取物的制备将干燥(在20-25℃下进行干燥)的毛木耳子实体放入高速万能破碎机。反复破碎4次，每次20秒，制成100目的均一毛木耳子实体粉。向毛木耳子实体粉中加入是毛木耳子实体粉干重的60倍质量的去离子水，得到毛木耳子实体混合液。将该毛木耳子实体混合液在4℃的冰箱放置8小时后进行水浴。水浴前摇匀，封口，用水浴摇床对毛木耳子实体混合液进行90℃、4h的高温水浴。水浴后，对毛木耳子实体混合液进行6000g离心30min收集上清液(水溶性物质)，该上清液即为毛木耳子实体水提液。用seveage法去除毛木耳子实体水提液中的蛋白质得到去除蛋白的毛木耳子实体水提液，具体方法如下：将是毛木耳子实体水提液1/3体积的sevag试剂(由三氯甲烷和正丁醇按照4:1的体积比混合而成)加入毛木耳子实体水提液中，涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，去除游离蛋白产生的凝胶状沉淀。向上清液中加入是上清液体积1/3的sevag试剂涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，如此重复多次直至获得无蛋白质层出现的上清液，该上清液即为去除蛋白的毛木耳子实体水提液。向该去除蛋白的毛木耳子实体水提液中加入是该去除蛋白的毛木耳子实体水提液4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后盖上锡箔纸，静置12小时待固液分离，6000g离心20分钟收集沉淀，将沉淀放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状,该粉末即为毛木耳提取物。用硫酸-苯酚法测定该毛木耳提取物的多糖含量，结果表明该毛木耳提取物的多糖质量百分含量为39.97％。1.2灰树花提取物的制备与1.1的区别仅在于将干燥的毛木耳子实体替换为干燥的灰树花子实体，其它操作均与1.1相同，得到灰树花提取物。用硫酸-苯酚法测定该灰树花提取物的多糖含量，结果表明该灰树花提取物的多糖质量百分含量为92.81％。1.3红灵芝提取物的制备与1.1的区别仅在于将干燥的毛木耳子实体替换为干燥的红灵芝子实体，其它操作均与1.1相同，得到红灵芝提取物。用硫酸-苯酚法测定该红灵芝提取物的多糖含量，结果表明该红灵芝提取物的多糖质量百分含量为42.36％。2、各种配比的灰树花提取物与毛木耳提取物组合物的制备2.1名称为3:7灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.2的灰树花提取物和1.1的毛木耳提取物按照3:7的多糖质量比(即灰树花提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为3:7灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物。2.2名称为2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.2的灰树花提取物和1.1的毛木耳提取物按照2:3的多糖质量比(即灰树花提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物。2.3名称为1:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.2的灰树花提取物和1.1的毛木耳提取物按照1:1的多糖质量比(即灰树花提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为1:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物。2.4名称为4:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.2的灰树花提取物和1.1的毛木耳提取物按照4:1的多糖质量比(即灰树花提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为4:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物。3、各种配比的红灵芝提取物与毛木耳提取物组合物的制备3.1名称为1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.1的毛木耳提取物按照1:9的多糖质量比(即红灵芝提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物。3.2名称为1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.1的毛木耳提取物按照1:4的多糖质量比(即红灵芝提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物。3.3名称为3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.1的毛木耳提取物按照3:7的多糖质量比(即红灵芝提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物。3.4名称为2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.1的毛木耳提取物按照2:3的多糖质量比(即红灵芝提取物和毛木耳提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的组合物。4、各种配比的红灵芝提取物与灰树花提取物组合物的制备4.1名称为1:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.2的灰树花提取物按照1:1的多糖质量比(即红灵芝提取物和灰树花提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为1:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物。4.2名称为3:2红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.2的灰树花提取物按照3:2的多糖质量比(即红灵芝提取物和灰树花提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为3:2红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物。4.3名称为4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.2的灰树花提取物按照4:1的多糖质量比(即红灵芝提取物和灰树花提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物。4.4名称为9:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物的制备将1.3的红灵芝提取物和1.2的灰树花提取物按照9:1的多糖质量比(即红灵芝提取物和灰树花提取物的质量均以所含的多糖质量计)混合得到名称为9:1红灵芝提取物+灰树花提取物的组合物。5、利用受损肝细胞存活率筛选复配5.1人受损肝细胞模型的建立5.1.1、细胞培养：在rpmi1640培养液中加入青霉素、链霉素混合液和胎牛血清(fbs)，使得青霉素和链霉素混合液在培养液中的最终体积百分含量均为1％，fbs在培养液中的最终体积百分比含量为10％，即配制成含10％fbs的rpmi1640培养液。将对数生长期的l-o2细胞采用0.25％的胰蛋白酶进行消化并用含10％fbs的rpmi1640培养液收集重悬细胞，接种于96孔培养板中(每孔100μl，细胞密度为8×103个/孔)，置于温度为37℃，相对湿度为95％，co2浓度为5％的培养箱中培养24h。5.1.2、建模诱导因子配置：向含10％fbs的rpmi1640培养液中加入无水乙醇和脂肪酸(该脂肪酸由油酸和棕榈酸组成)，配置成乙醇体积百分含量为1.8％、油酸含量为0.33mmol/l和棕榈酸的含量为0.17mmol/l培养液，将其称为含诱导因子培养液。5.1.3、诱导因子孵育：细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，加入200μl的5.1.2中的含诱导因子培养液，置于温度为37℃，相对湿度为95％，co2浓度为5％的培养箱中继续培养48h后，作为实验组，实验组中的细胞为人受损肝细胞模型。细胞培养结束后，吸除培养孔中的细胞培养液，加入200μl含10％fbs的rpmi1640培养液(乙醇的体积百分含量为0，油酸含量为0.0mmol/l和棕榈酸的含量为0.0mmol/l)，置于温度为37℃，相对湿度为95％，co2浓度为5％的培养箱中继续培养48h后，作为对照组。实验设置三个复孔。5.1.4、mtt检测：诱导因子孵育结束后，将培养液吸除，每孔加入200μlmtt稀释液(mtt浓度为0.5mg/ml)，置于37℃,相对湿度为95％，co2浓度为5％的培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸除每孔中的液体，每孔加入200μldmso溶液，混合均匀，在荧光全波长酶标仪测定每孔的od562值。细胞存活率公式：细胞存活率(％)＝实验组的od562值/对照组的od562值×100％。将对照组的细胞存活率设定为100％。实验结果表明，实验组的细胞存活率为58.78％，显微镜下观察发现细胞大量浮起。5.2药物实验5.2.1利用受损肝细胞存活率筛选药物实验设置对照组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养l-o2细胞)、模型组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用含灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用含毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、3:7灰树花提取物+毛木耳提取物组(用含3:7灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(用含2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、1:1灰树花提取物+毛木耳提取物组(用含1:1灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、4:1灰树花提取物+毛木耳提取物组(用含4:1灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用含红灵芝提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用含1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用含1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用含3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用含2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、1:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用含1:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、3:2红灵芝提取物+灰树花提取物组(用含3:2红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、4:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用含4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、9:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用含9:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，利用mtt法检测细胞的存活率，设定对照组的细胞活性为100％。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。其中，含灰树花提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入1.2的灰树花提取物得到的灰树花提取物含量以多糖含量计为100μg/ml的液体；含毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入1.1的毛木耳提取物得到的毛木耳提取物含量以多糖含量计为100μg/ml的液体；含3:7灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入2.1的名称为3:7灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物，得到的灰树花提取物含量以多糖含量计为30μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为70μg/ml的液体；含2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入2.2的名称为2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物，得到的灰树花提取物含量以多糖含量计为40μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为60μg/ml的液体；含1:1灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入2.3的名称为1:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物，得到的灰树花提取物含量以多糖含量计为50μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为50μg/ml的液体；含4:1灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入2.4的名称为4:1灰树花提取物+毛木耳提取物的组合物，得到的灰树花提取物含量以多糖含量计为80μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为20μg/ml的液体；含红灵芝提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入1.3的红灵芝提取物得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为100μg/ml的液体；含1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入3.1的名称为1:9红灵芝提取物+毛木耳提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为10μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为90μg/ml的液体；含1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入3.2的名称为1:4红灵芝提取物+毛木耳提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为20μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为80μg/ml的液体；含3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入3.3的名称为3:7红灵芝提取物+毛木耳提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为30μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为70μg/ml的液体；含2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入3.4的名称为2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为40μg/ml、毛木耳提取物含量以多糖含量计为60μg/ml的液体；含1:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入4.1的名称为1:1红灵芝提取物+灰树花提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为50μg/ml、灰树花提取物含量以多糖含量计为50μg/ml的液体；含3:2红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入4.2的名称为3:2红灵芝提取物+灰树花提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为60μg/ml、灰树花提取物含量以多糖含量计为40μg/ml的液体；含4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入4.3的名称为4:1红灵芝提取物+灰树花提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为80μg/ml、灰树花提取物含量以多糖含量计为20μg/ml的液体；含9:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液是向5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液中加入4.4的名称为9:1红灵芝提取物+灰树花提取物，得到的红灵芝提取物含量以多糖含量计为90μg/ml、灰树花提取物含量以多糖含量计为10μg/ml的液体。结果如表1-3所示，灰树花提取物、毛木耳提取物和红灵芝提取物均可以增加人受损肝细胞的存活率，在设定对照组细胞存活率为100％的条件下，与模型组相比较分别可以提高41.56％、10.31％和52.33％；这三种提取物两两复配后，以不同配比浓度作用于人受损肝细胞，灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配时，人受损肝细胞的存活率较高，与模型组相比较可提高128.39％；红灵芝提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配时，人受损肝细胞的存活率较高，与模型组相比较可提高75.54％；红灵芝提取物和灰树花提取以4:1的多糖质量比复配时，人受损肝细胞的存活率较高，与模型组相比较可提高69.67％。经过不同组分和不同配比筛选发现，灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配是所有检测复方中提高损伤细胞存活率最优配方。灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比混合得到的组合物的人受损肝细胞的存活率的提高率显著高于毛木耳提取物组受损肝细胞的存活率的提高率(10.31％)和灰树花提取物组受损肝细胞的存活率的提高率(41.56％)之和，说明毛木耳提取物和灰树花提取物在提高受损肝细胞的存活率方面产生了协同作用。表1、灰树花提取物、毛木耳提取物的各处理组的细胞存活率注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。表2、红灵芝提取物、毛木耳提取物的各处理组的细胞存活率处理组细胞存活率(％)细胞存活率提高率(％)对照组100.00±7.89*70.13模型组58.78±4.660红灵芝提取物组89.54±5.5*52.33毛木耳提取物组64.84±5.8110.311:9红灵芝提取物+毛木耳提取物组92.36±6.32*57.131:4红灵芝提取物+毛木耳提取物组94.45±6.4*60.683:7红灵芝提取物+毛木耳提取物组87.98±9.68*49.682:3红灵芝提取物+毛木耳提取物组103.18±3.88*75.54注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。表3、红灵芝提取物、灰树花提取物的各处理组的细胞存活率处理组细胞存活率(％)细胞存活率提高率(％)对照组100.00±7.89*70.13模型组58.78±4.660红灵芝提取物组89.54±5.5*52.33灰树花提取物组83.21±2.79*41.561:1红灵芝提取物+灰树花提取物组84.17±11.45*43.193:2红灵芝提取物+灰树花提取物组95.02±9.94*61.654:1红灵芝提取物+灰树花提取物组99.73±2.86*69.679:1红灵芝提取物+灰树花提取物组92.91±5.57*58.06注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。5.2.2药物保护受损肝细胞特征性指标检测5.2.2.1对细胞内甘油三酯(tg)含量的影响实验设置对照组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养l-o2细胞)、模型组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用5.2.1的含灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用5.2.1的含毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用5.2.1的含红灵芝提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、4:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用5.2.1的含4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)说明书检测胞内tg含量，同时采用bca蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。结果如表4所示，与模型组相比较，除了红灵芝提取物组外的各处理组都可以显著降低细胞内甘油三酯的含量，其中2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配)效果最为明显的，能够降低胞内甘油三酯的比率为40.93％，高于毛木耳提取物组胞内甘油三酯降低率(15.40％)和灰树花提取物组胞内甘油三酯降低率(23.94％)之和，说明毛木耳提取物和灰树花提取物在降低胞内甘油三酯方面产生了协同作用。表4、各处理组的细胞内的甘油三酯含量注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。5.2.2.3对细胞内sod酶活性的影响实验设置对照组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养l-o2细胞)、模型组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用5.2.1的含灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用5.2.1的含毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用5.2.1的含红灵芝提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、4:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用5.2.1的含4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，反复冻融法裂解细胞，按照总超氧化物歧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测胞内sod活性，同时采用bca蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。结果如表5所示，与模型组相比较，除毛木耳提取物组外的各处理组都可以显著提高细胞内sod酶活性，其中2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配)效果最为明显的，细胞内sod酶活性的提高比率为122.60％，显著高于毛木耳提取物组细胞内sod酶活性的提高比率(13.45％)和灰树花提取物组细胞内sod酶活性的提高比率(50.96％)之和，说明毛木耳提取物和灰树花提取物在提高细胞内sod酶活性方面产生了协同作用。表5、各处理组的细胞内sod酶活性注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。5.2.2.4对胞外谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量的影响实验设置对照组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养l-o2细胞)、模型组(用5.1.1的含10％fbs的rpmi1640培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、灰树花提取物组(用5.2.1的含灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、毛木耳提取物组(用5.2.1的含毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、红灵芝提取物组(用5.2.1的含红灵芝提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3灰树花提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物组(用5.2.1的含2:3红灵芝提取物+毛木耳提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)、4:1红灵芝提取物+灰树花提取物组(用5.2.1的含4:1红灵芝提取物+灰树花提取物的培养液培养5.1.3的人受损肝细胞模型)。培养细胞24h后，收集细胞培养液，按照谷草转氨酶和谷丙转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所，产品目录号为c009-2和c010-2)说明书检测胞外转氨酶的含量，同时采用bca蛋白定量试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司产品)测定样品中的蛋白含量，具体操作参见说明书。实验设三次重复，每次重复设置三个复孔。结果如表6所示，与模型组相比较，各个药物处理都可以显著降低胞外谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量，其中2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组(灰树花提取物和毛木耳提取物以2:3的多糖质量比复配)效果最为明显的：2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组人受损肝细胞的胞外alt的降低率为60.87％，显著高于毛木耳提取物组的胞外alt的降低率(36.12％)和灰树花提取物组的胞外alt的降低率(52.53％)；2:3灰树花提取物+毛木耳提取物组人受损肝细胞的胞外ast的降低率为61.03％，显著高于毛木耳提取物组的胞外ast的降低率(31.06％)和灰树花提取物组的胞外ast的降低率(45.53％)，说明毛木耳提取物和灰树花提取物在降低胞外谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量方面产生了协同作用。表6、各处理组的胞外谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量注：“*”表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)。当前第1页12