治疗退化性及缺血性疾病的方法和组合物与流程

分案申请及优先权申明本申请是申请号为201080032121.4，申请日为2010年5月14日，名称为“治疗退化性及缺血性疾病的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。本申请案主张2009年5月14日递交的美国临时专利申请案no.61/178,191和2009年8月18日递交的no.61/234,788之权益和优先权，两个申请案之整体揭示内容全文以引用的方式并入本文中。本发明是关于能量代谢调节。已经使用化学筛选方式鉴定能量代谢调节剂，可以鉴别出线粒体代谢的小分子抑制剂(例如，抑制氧化磷酸化反应的)。例如，这种线粒体代谢抑制剂可以用于预防或治疗神经退化性或缺血性疾病，糖尿病，及寄生虫感染。例如，氯苯甲嗪(meclizine，敏克静，美克洛嗪，敏克嗪)已被发现为一种线粒体呼吸作用的抑制剂(例如，线粒体氧化磷酸化中的一种高sglu/gal抑制剂)及抵制神经退化性疾病诱导的细胞死亡、缺血性损伤、及糖尿病，如2型糖尿病。也提供了在个体中治疗寄生虫病的方法，例如那些仅依赖于肯尼迪途径来合成磷脂酰乙醇胺的原生动物寄生虫，包括的物种有锥虫和疟原虫。技术背景几乎所有的细胞都有能力基于营养有效性，环境条件，或生长及分化的阶段将相关依赖性转移到糖酵解以应对氧化磷酸化作用(oxphos)。另外，有现象表明能量代谢的转移促进疾病的发生。例如，很早就发现在糖酵解中癌细胞占更高的比例(warburg，science123：309(1956)，可能会促进缺氧条件下的生存或维持快速的细胞增殖。最近的研究表明使用二氯乙酸将代谢向oxphos转换的确能阻止肿瘤的生长(bonnetetai.，cancercell11：37(2007)).相反地，细胞及模式动物中的基因组学及药物学最新研究表明oxphos的局部抑制意味着可以抑制与神经退化性疾病有关的疾病等位基因的毒性(buttneretai.，jbiolchem283：7554(2008)；fukuietal，procnatlacadsciusa104：14163(2007)；及vannaetai.，procnatlacadsciusa104：14525(2007))，也能抑制中风模式动物中的细胞死亡(huberetal.，jnellroscires75：441(20040)和心脏缺血再灌注损伤(chenetal，amjphysiolcellphysiol292：c137(2007))。其潜在的保护机制还不清楚，但已经表明通过一个受损或缺乏抵抗力的线粒体呼吸链的通量会促进发病，通过将能量代谢转向糖酵解，可能将氧化损伤最小化并抑制细胞凋亡(jeongetal.，biochembiophysrescommun313：984(2004)；andhunteretai.，intjradiatbiol83：105(2007)).能将细胞依赖性从oxphos转移到糖酵解的临床有用药物目前还没有发现。例如，传统的oxphos毒素，比如鱼藤酮，抗霉素，氰化物及寡霉素有许多缺点诸如：i)快速，直接，高效作用并阻碍呼吸作用；ii)氧化组织剧烈消耗atp，因此终止许多与呼吸链偶联的生化途径；iii)导致迅速的细胞中毒；iv)导致人死亡，即使使用低剂量。发明摘要本发明是基于，至少部分是基于发现线粒体代谢的小分子抑制剂，此处鉴定的线粒体代谢抑制剂可以用于预防或治疗神经退化性或缺血性疾病。例如，氯苯甲嗪已经被鉴定为一种线粒体代谢干扰物，并用于抵制神经退化性疾病和诱导性细胞死亡，缺血性损伤，及糖尿病，例如2型糖尿病。这样，一方面，本发明提供了对患有与伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症的个体进行治疗的方法。本发明包括选择一个个体，其具有伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症(例如，基于他们具有的状况来进行选择)；并让选择的个体摄入一种组合物，包括有效治疗剂量的一种已经过鉴定为此处描述的oxphos抑制剂的化合物，例如表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一种s-对映体。一般而言，本文中提到氯苯甲嗪的地方，都可以推及使用s-氯苯甲嗪，除了s-氯苯甲嗪被明确指明排除在外的地方。因此本文中描述的方法中，可使用s-氯苯甲嗪或氯苯甲嗪(外消旋体)，虽然有些情况下由于本文中讨论的一些原因而倾向于选择两种中的一种。第二方面，本发明的特色方法是降低个体中与伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症的发病风险，本方法包括选择一个个体，其患有与伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症或有患此病风险(例如，基于其患病或具有患病风险进行选择)；让此个体摄入有效治疗剂量的一种已经过鉴定为此处描述的oxphos抑制剂的化合物，例如，表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一种s-对映体。进一方面，本发明提供了治疗个体中糖尿病的方法。本方法包括选择一个患有2型糖尿病或有患此病风险的个体，例如，一个有代谢综合症的个体，其肥胖，或胰岛素抗性，或任何其它已知的患2型糖尿病的风险因素，让此个体摄入有效治疗剂量的一种已经鉴定为此处描述的oxphos抑制剂的化合物，例如，表1或表3所列的化合物，例如氯苯甲嗪或它的一种s-对映体。此处也描述了氯苯甲嗪及其s-对映体用于治疗或预防伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症，和使用氯苯甲嗪及其s-对映体用于治疗或预防2型糖尿病。另外，本发明包括摄入s-氯苯甲嗪用于治疗或预防由晕动病引起的恶心、呕吐、和头晕，或由特定的内耳疾病引起的眩晕的方法，例如，治疗那些目前正使用氯苯甲嗪外消旋体治疗的病症。此处提到的“个体”，是指哺乳类个体，例如人类个体。在有些实施方案中此处描述的方法包括摄入有效治疗剂量的s-氯苯甲嗪，例如，实质上、大体上由s-氯苯甲嗪组成的组合物。在有些实施方案中，此处描述的方法包括摄入一种组合物，其基本上不含氯苯甲嗪的r-对映体，例如，其纯度至少达到92％，95％，97％，99％；例如s-对映体∶r-对映体的比例为99∶1，98∶2，97∶3，95∶5，96∶4，94∶6，93∶7，92∶8，91∶9，90∶10，85∶15，80∶20。在有些实施方案中，细胞退化性疾病是一种神经退化性疾病，例如帕金森氏症，阿兹海默氏症，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)，弗里德希氏共济失调，或亨廷顿氏舞蹈病。在有些实施方案中，是缺血再灌注损伤病症，例如心肌梗死缺血性损伤，肾缺血性损伤，或中风。在有些实施方案中，此方法包括摄入一剂氯苯甲嗪足以产生约100nm到1μm的血清水平，例如，最高浓度至少是100nm，500nm，750nm，1μm。在有些实施方案中，氯苯甲嗪经注射给药。在有些实施方案中，摄入氯苯甲嗪的日服剂量是25mg/天或更多。进一步方面，本发明提供的方法用于治疗患有寄生虫感染或有患此病风险的个体，例如一种寄生虫体内磷脂酰乙醇胺合成要求功能性pcyt2酶活性，例如，其体内磷脂酰乙醇胺的合成主要通过肯尼迪途径。本方法包括选择携带寄生虫或者有接触寄生虫风险的个体；让此个体摄入一种包含有效治疗剂量的氯苯甲嗪或其s-对映体的组合物。在有些实施方案中，此方法包括摄入有效治疗剂量的s-氯苯甲嗪，例如一种本质上由s-氯苯甲嗪组成的组合物，包括药学上可接受的载体或辅料。在有些实施方案中，本方法包括摄入一种基本上不含r-对映体的氯苯甲嗪组合物，例如，其纯度至少达到92％，95％，97％，99％；例如s-对映体∶r-对映体的比例为99∶1，98∶2，97∶3，95∶5，96∶4，94∶6，93∶7，92∶8，91∶9，90∶10，85∶15，80∶20。也提供了使用氯苯甲嗪或s-氯苯甲嗪治疗寄生虫感染的方法。在有些实施方案中，所述寄生虫选自包括布氏锥虫，克氏锥虫和恶性疟原虫在内的群组。另一方面，本发明提供方法用于鉴定治疗与伴随缺血性损伤或细胞退化性疾病的细胞死亡相关病症的组合物，例如，像此处描述的。本方法包括提供包含具有酶活性的ctp：磷酸乙醇胺胞苷酸转移酶2(pcyt2)的样本；用一种待测化合物接触样本，判定待测化合物存在和不存在的情况下样本中pcyt2的活性。降低样本中pcyt2活性的待测化合物是治疗此类病症的候选化合物。在有些实施方案中，这个样本是活细胞，这种方法进一步包括判定待测化合物存在时细胞中磷酸乙醇胺(pea)的水平，当一种待测化合物可以增加细胞中磷酸乙醇胺(pea)的水平时，可以将其选作治疗此病症的候选化合物。在有些实施方案中，此处描述的方法和组合物包含或使用具有二苯甲胺基本结构的化合物。在有些实施方案中二苯甲胺基本结构包括一个a1(diphenylpiperazine)或a2亚结构。在有些实施方案中，此处描述的方法和组合物包括或使用一种具有三环环状基本结构的化合物，在有些实施方案中，这种三环环状基本结构包括ei，e2，fi，f2，g1或g2亚结构。在有些实施方案中，此三环环状基本结构包括硫乙哌丙嗪(thiethylperazine)。在有些实施方案中，这种三环环状基本结构包含一种化合物，包括但不限于图32所列种类。一方面，本发明涉及一种治疗组合物，包括一种氯苯甲嗪对映体，例如s-对映体，和一种药学上可接受的载体。在有些实施方案中，本发明涉及一种方法，包括：a)提供i)一种候选化合物，其中所述化合物疑似可以调节线粒体能量产生；ii)一种能够在大多数碳源上生长的细胞培养；b)通过将细胞培养从第一种碳源上转移到第二种碳源上来筛选化合物；c)测定第一个细胞培养的生长速率和第二个细胞培养的生长速率。在有些实施方案中，第一个细胞生长速率是由第一种碳源来测定的，在有些实施方案中，第二个细胞生长速率是由第二种碳源来测定的。在有些实施方案中，第一个的细胞生长速率低于第二个的细胞生长速率，由此鉴定这种化合物为一种糖酵解抑制剂。在有些实施方案中，第二个的细胞生长速率低于第一个的细胞生长速率，由此鉴定这种化合物为一种氧化磷酸化抑制剂。在有些实施方案中，第一种碳源包含葡萄糖。在有些实施方案中，第二种碳源包含半乳糖。在有些实施方案中，此方法甚至包含判定第一个细胞生长速率与第二个细胞生长速率的比值。在有些实施方案中，这个比值包括一个第二个细胞生长速率的log10转换。在有些实施方案中，这个比值包括一个第一个细胞生长速率和第二个细胞生长速率的log10转换。在有些实施方案中，这个比值包括一个大约从1.00到(-)1.00之间的数值。在有些实施方案中，这个化合物是从由一种有机小分子，一种药物，一种营养制剂，一种核酸和一种蛋白质组成的群组中选择的。在有些实施方案中，本发明专注于一种方法，包括：a)提供i)一种候选化合物，其中所述化合物疑似是oxphos的选择性抑制剂；ii)在富含葡萄糖的培养基上进行第一个细胞培养；iii)在富含半乳糖的培养基上进行第二个细胞培养；b)在所述候选化合物存在的情况下孵育所述第一个细胞培养；c)在所述候选化合物存在的情况下孵育所述第二个细胞培养，判定其中的半乳糖生长值；及d)通过计算葡萄糖/半乳糖生长值的比值来鉴定所述化合物作为一种oxphos选择性抑制剂，其中所述比值大约位于0.01-1.0之间。在有些实施方案中，这种化合物是从由一种有机小分子，一种药物，一种营养制剂，一种核酸和一种蛋白质组成的群组中选择的。在有些实施方案中，这种化合物包括一种抗肿瘤化合物。在有些实施方案中，本发明专注于一种方法，包括：a)提供i)一种化合物，其中所述化合物包含一个大约位于1.00到(-)1.00之间的葡萄糖/半乳糖生长值的比值；ii)一个患者至少表现一种疾病的一种症状；b)让所述患者摄入所述化合物，使所述患者的至少一种症状得到缓解。在有些实施方案中，这种化合物是从由一种有机小分子，一种药物，一种营养制剂，一种核酸和一种蛋白质组成的群组中选择的。在有些实施方案中，这种疾病是从由退化性疾病，过度增生疾病(例如，肿瘤或癌症)，糖尿病，缺血性疾病或寄生虫感染疾病组成的群组中选择的。在有些实施方案中，本发明专注于一种方法，包括：a)提供i)一种化合物，其中所述化合物包含一个大约位于0.01到1.00之间的葡萄糖/半乳糖生长值的比值；ii)一个患者至少表现一种疾病的一种症状；b)让所述患者摄入所述化合物，使所述患者的至少一种症状得到缓解。在有些实施方案中，这种疾病是从由退化性疾病，缺血性疾病，糖尿病和寄生虫感染疾病组成的群组中选择的。在有些实施方案中，这种化合物包括氯苯甲嗪。在有些实施方案中，这种化合物是从由一种有机小分子，一种药物，一种营养制剂，一种核酸和一种蛋白质组成的群组中选择的。在有些实施方案中，本发明专注于一种方法，包括：a)提供i)一种化合物，其中所述化合物包含一个大约位于(-)0.01到(-)1.00之间的葡萄糖/半乳糖生长值的比值；ii)一个患者表现一种过度增生疾病(例如，肿瘤或癌症)的至少一种症状；b)让所述患者摄入所述化合物，使所述患者的至少一种症状得到缓解。在有些实施方案中，这种化合物是从由一种有机小分子，一种药物，一种营养制剂，一种核酸和一种蛋白质组成的群组中选择的。在有些实施方案中，本发明专注于一个试剂盒，包括：a)一个包含细胞培养基的固体基质；b)包含第一种碳源的容器一；c)包含第二种碳源的容器二；d)一系列说明，解释如何鉴定一种候选化合物作为无毒性的线粒体能量代谢调节剂。在有些实施方案中，这种固体基质包括许多检测孔。在有些实施方案中，这些检测孔包括一个细胞培养。在有些实施方案中，这种固体基质是冷冻的。在有些实施方案中，第一种碳源包括葡萄糖。在有些实施方案中，第二种碳源包括半乳糖。在有些实施方案中，提供一系列说明来检查细胞生长率，比较第一种碳源和第二种碳源。定义此处用到的“候选化合物”这个术语，是指可以被筛查用于调节线粒体能量产生的任何化合物(例如，有机小分子，肽，激素，核酸)此处用到的术语“碳源”，是指能被细胞用于产能生化途径的化合物(例如，产生三磷酸腺苷或二磷酸腺嘌呤)。碳源通常是糖类化合物(例如，葡萄糖，半乳糖，果糖，己糖)。此处用到的术语“生长速率”，是指一个组织，器官，有机体的细胞增殖。例如，一个细胞培养的生长速率可以通过比较第一个样本中的细胞数目与第二个样本的细胞数目来测定，其中的样本是暂时区分的。也可以选择，通过估计尺寸变化(例如，形状，宽度，密度等)检测组织、组织培养或器官的生长。此处用到的术语“糖酵解抑制剂”，是指任何能够干扰糖酵解的化合物。此处用到的术语“氧化磷酸化抑制剂”，是指任何能够干扰电子传递链的化合物(例如，一种oxphos抑制剂)“sglu/gal值”这个术语，是指任何一个比较葡萄糖(glu)作为唯一的糖源(例如，一种富含葡萄糖的培养基)时的细胞生长与半乳糖(gal)作为唯一的糖源(例如，一种富含半乳糖的培养基)时的细胞生长得到的比值。例如，sglu/gal值可以以log10的转换方式表示为大约位于1.00to(-)1.00的数值。一个高sglu/gal值会大于0，可用于鉴定oxphos抑制剂。一个低sglu/gal值会小于0，可以用于鉴定细胞细胞快速增值的抑制剂。此处用到的术语“半乳糖生长值”，是指当半乳糖作为唯一糖源时细胞任何定量的细胞增值此处用到的术语“葡萄糖生长值”，是指当葡萄糖作为唯一糖源时细胞任何定量的细胞增值此处用到的术语“有风险”，是指病人表现出的一种医疗状况或一系列医疗状况可能会使患者倾向于发展为一种特殊的疾病或病痛。例如这些状况可能是由于一些影响造成的包括，但是不限于，行为上的，情绪上的，化学的，遗传的，生化的或环境上的影响。当提及任何症状在一个未接受治疗的个体和一个相应的接受治疗的个体上的表现时，使用的这些术语“减少”，“抑制”，“缩小”，“禁止”，“减小”，“预防”及其他语法上同义的词(包括“更低”，“更小”等)，意味着接受治疗的个体上的这种症状的数量或级别低于未接受治疗的个体，这个数量或级别是通过任何医务人员验证的任何可以作为临床相关性的数量。在有些实施方案中，接受治疗的个体上的这种症状的数量或级别至少比未接受治疗的个体低至少10％，25％，50％，75％或90％。此处用到的术语“抑制性化合物”或“抑制剂”，是指任何化合物能够在特定条件下与已结合配体(例如，糖酵解或氧化磷酸化途径中的酶类)相互作用(例如，附着或结合)，以至于其结合配体对其自然配体无反应。抑制性化合物可以包括，但不限于，有机小分子，抗体，寡核苷酸，及蛋白或多肽。此处用到的术语“附着”，是指药物和中间体(或载体)的任何相互作用。附着作用可以是可逆的也可以是不可逆的。附着作用包括，但不限于，共价键，离子键，范德华力或摩擦力，其类似作用。一个药物被附着到一个中间体(或载体)上，比如是被浸渍、被合成，被包裹，被悬浮、被溶解或被混合在中间体中。此处用到的术语“药物”或“化合物”，是指任何药学上的活性物质，能够被摄入并到达预期效果。“药物”或“化合物”可以是合成的也可以是自然形成的，非肽、蛋白或多肽，寡核苷酸或核酸，多糖或糖类。此处用到的术语“被摄入”或“摄入”药物或化合物，是指任何一种为患者提供药物或化合物的方法以使药物或化合物对患者有预期效果。例如，一种摄入方法是通过使用一种医疗设备的间接途径，例如，但不限于，导管，涂药器，或注射器。第二种典型的摄入方法是通过直接途径，例如局部组织摄入(例如，血管外放置)，口服吞食，皮肤药贴，局部，吸入剂或栓剂。此处用到的术语“患者”，是人或动物个体而且不需要住院就医。例如，门诊病人，疗养院里的人都是“患者”。一个“患者”可以是任何年龄的人或动物，因此包括成年的和未成年的(例如，儿童)。并不是说“患者”这个词就意味着需要治疗，因此，患者可以是自愿的或非自愿的加入到临床试验或支持基础科学研究。此处用到的术语“亲和力”，是指物质或微粒之间的任何相互吸引力，并使其进入并保持化学作用。例如，与亲和力较低的抑制剂相比，一种与受体有高的亲和力的抑制剂化合物会有更大的功效来防止这种受体与其天然配体相互作用。此处用到的术语“有效剂量”，是指特定量的药物组合物，包括一种可以达到临床良效的治疗药剂(例如，一种oxphos抑制剂)。此处用到的术语“蛋白质”，是指任何众多的自然形成的非常复杂的物质(例如一种酶或抗体)，其由氨基酸残基通过肽键连接而成，包括的元素有碳，氢，氮，氧，通常也有硫。一般而言，蛋白质包括百级数量级的有序的氨基酸。此处用到的术语“肽”，是指任何各种氨基化合物，他们由两个或多个氨基酸通过一个氨基酸的氨基与另一个的羧基相互结合而形成，并且通常由蛋白质的部分水解而获得。一般而言，一个肽段包含一个有序的十级数量级的氨基酸。此处用到的术语“药学上”，或“药理学上可接受的”，是指当被动物或人摄入时，分子实体或组合物不会产生不利的，过敏的或其他不良反应。此处用到的术语“药学上可接受的载体”，包括任何所有溶剂，或分散介质，包括但是不限于，水，酒精，多羟基化合物(例如，甘油，丙二醇，及液体聚乙二醇，及其他类似物)，它们的适当混合物，及植物油，涂料，等渗或吸收延缓剂，脂质体，商业化有效清洁剂，及其他类似物。补充性生物活性成分也可以归为这类载体。此处用到的术语“纯化”或“分离”，可以是指一种肽类组合物已经经过处理(例如，分馏)去除各种其他组分，这种组合物大幅保持了其表达的生物活性。使用术语“大幅度纯化”的地方，是指一种组合物中的主要成分是蛋白或肽，例如构成组合物的大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％，大约95％或更多(例如，重量/重量，或重量/体积)。此处用到的术语“提纯以均质”是指组合物已经被纯化成“明显的均质性”以至于只有一种蛋白(例如，基于sds-page或hplc分析)。一种纯化的组合物并不是想要达到一些微量杂质存在的纯度。此处提到的术语“大幅度纯化”，是指分子，核酸或者氨基酸序列，从其天然环境中移除，分离或区分，并且至少从它们天然结合其他组分中释放出60％，75％，最好是90％。“分离多核苷酸”因此实际上是纯化多核苷酸。此处用到的术语“核酸序列”或“核苷酸序列”，是指一种寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或一部分，及基因组的或起始合成的dna或rna，其可能是单链的或双链的，并表现为正义链或反义链。此处用到的术语“一种分离的核酸”，是指任何从天然状态中分离的核酸分子(例如，从细胞中分离，并且以一种优先的实验方案从其他基因组核酸中释放出来)。此处用到的术语“氨基酸序列”和“多肽序列”，两者是可以互换的，是指一段氨基酸序列。此处用到的术语“一部分”，当用在一种蛋白上时(例如在“一种给定的蛋白的一部分”)是指那种蛋白的片段。这个片段的大小可能是从四个氨基酸残基到整个氨基酸片段减去一个氨基酸残基的片段长度。当提到核酸序列时用到的术语“一部分”，是指那条核酸序列的片段，这个片段的大小可能是从5个核苷酸残基到整条核酸序列减去一个核苷酸残基的片段长度。当说到一个小分子与一种蛋白质或肽相互作用时用到的术语“特异性的结合”或“特异性结合”，意味着这种相互作用是基于蛋白质特殊结构的存在(例如，一种二维或三维空间结构)，换而言之，一个小分子识别并结合到一个特殊的蛋白质上，而不是通常的蛋白质类。例如，一个分子对“a”结构是特异的，包括“a”结构的一种化合物存在于(或游离的，未标记“a”)一个包含标记“a”的反应中，这个分子就会通过结合的方式减少标记“a”的数量。此处用到的术语“有机小分子”，是指任何一种分子，其大小可以比得上那些通常用于药物上有机分子。这个术语包括生物大分子(例如，蛋白，核苷酸等)。提到的有机小分子是指大小大约从10da到5000da，更好地达到2000da，最好地达到1000da.此处用到的术语“结合”，是指任何控制组合物和表面之间的相互作用。例如，表面被定义为“结合表面”。结合可以是可逆的或非可逆的。这种结合可以是，但是不限于，非共价结合，共价键结合，离子键结合，范德华力结合或摩擦力，或其他。一种感染控制组合物如果被浸渍，合并，包裹，重悬，溶解或混合等，就会结合到表面上。除非另有鉴定，此处用到的所有的技术上的和科学上的术语与平常的本领域内的一个具有普通技能的人员的理解有相同的意思。此处描述的方法和材料是用于本发明，另外本项工艺中所知的适当的方法和材料也可以被使用。材料，方法和例子只是用作说明的，并非要限制于此。此处提到的所有的出版物，专利申请，专利，序列，数据库条目及参考文献，都以全部引用的方式并入。如果有冲突，本说明书，包括定义，将控制。本发明的其他特点及优势通过以下的详细描述，图形及声明中展现出来。附图概述图1a说明了在葡萄糖丰富的培养液中通过糖酵解和有氧代谢产生atp的细胞生长。图1b说明了在葡萄糖丰富的培养液中通过有氧代谢产生多数atp的细胞生长。图1c提供了在10mm葡萄糖或10mm半乳糖生长3天的纤维细胞检测细胞外酸化率(ecar)和氧耗率(ocr)的代表性数据。数据表示为平均±sd(n＝5)图1d展示了暴露在0.5μm寡霉素(复合物v)和0.1μm抗霉素(复合物iii)氧耗抑制剂后，检测生长在葡萄糖和半乳糖的纤维细胞ocr的代表性数据。数据表示为±sd，其表明p＜0.05；p值计算通过双面t检验(n＝5)。图1e的代表性数据展示了在各种浓度鱼藤酮中，生长在葡萄糖或半乳糖丰富培养液中的纤维细胞的总细胞atp水平数据表示为平均±sd(n＝5)。图1f的代表性数据展示了在各种浓度抗霉素中，生长在葡萄糖(10mm)或半乳糖(10mm)丰富培养液中的纤维细胞的总细胞atp水平数据表示为平均±sd(n＝5)。图1g的代表性数据展示了在各种浓度寡霉素中，生长在葡萄糖(10mm)或半乳糖(10mm)丰富培养液中的纤维细胞的总细胞atp水平数据表示为平均±sd(n＝5)。图1h的代表性数据展示了在各种浓度解偶联剂cccp中，生长在葡萄糖(10mm)或半乳糖(10mm)丰富培养液中的纤维细胞的总细胞atp水平数据表示为平均±sd(n＝5)。图2a展示了基于图像的高通量细胞计数技术的标准曲线的实施方案。首先通过血球计数器计数细胞，然后种植在96孔板再通过自动成像法计数。实线代表了最适值的线性回归。数据表示为平均±sd(n＝10)。图2b展示了使用自动种植仪，抽吸器，液体剂量分配器，和成像法得到的筛选前数据，这些典型数据证明了对细胞数差别具有高敏感性。在0天，细胞种植在含有25mm葡萄糖培养液的96孔板。在1天，pbs洗脱细胞，用10mm葡萄糖或10mm半乳糖更换培养液，之后添加药物或二甲亚砜(dmso)。数据表示为±sd(n＝3)。图2c展示了简要插图，其描述了在含有暴露化学库测试化合物的葡萄糖或半乳糖培养液96孔板细胞生长的筛选概念。每个孔的细胞生存能力的分析需考虑到每种化合物作为无毒的(没有变化)，有毒的(在两种情况下的低细胞数)，oxphos抑制剂(细胞数仅在半乳糖培养液低，如高s葡萄糖/半乳糖)，或快速增值抑制剂(细胞数仅在葡萄糖培养液低，如低s葡萄糖/半乳糖)的分类。图2d展示了潜在线粒体代谢抑制剂和快速增长抑制剂的高通量文库筛选的典型数据。对于所有划分在起降低作用组的药物，在葡萄糖的倍数变化log10除以在半乳糖的倍数变化。分布曲线包含了最有效的oxphos抑制剂(s葡萄糖/半乳糖＞0.0)和快速细胞增殖抑制剂(s葡萄糖/半乳糖＜0.0)。图3a的代表性数据展示了3天孵育后，mch58细胞在氯苯甲嗪浓度变化的细胞生存能力(钙黄绿素燃料)。实线：葡萄糖丰富培养液。洗脱线：半乳糖丰富培养液。数据描述为平均+/-sd(n＝5)。图3b的代表性数据展示了3天孵育后在氯苯甲嗪浓度变化时，mch58细胞的atp水平实线：葡萄糖丰富培养液。洗脱线：半乳糖丰富培养液。数据描述为平均+/-sd(n＝5)。图3c的代表性数据展示了在3小时内，暴露在不同浓度氯苯甲嗪的mch58细胞，其在ocr从dmso基线的变化。每7分钟检测一次。5个重复的平均值如图中所示。图3d提供了在3小时内，暴露在不同浓度氯苯甲嗪的mch58细胞，其在ecar从dmso基线的变化的典型数据。每7分钟检测一次。5个重复的平均值如图所示。3e-i的线性图表展示了氯苯甲嗪对包括氧耗的独立线粒体生物能量参数的急性影响，该反应是以谷氨酸/苹果酸(3e)，琥珀酸(3f)或丙酮酸/苹果酸(3g)作为底物。5个独立检测有代表性。(图3h)用四甲基罗丹明甲酯(tmrm)检测氯苯甲嗪在独立线粒体膜的潜在急性影响。5个独立检测有代表性。(图3i)氯苯甲嗪在独立线粒体nadh的急性影响。5个独立检测有代表性。在指明时间点加入线粒体(mito)，谷氨酸和苹果酸(g/m)，琥珀酸(s)，丙酮酸/苹果酸(p/m)，氯苯甲嗪(mec)或dmso，adp和羰基氰化物氯苯胺(cccp)。图3j的代表性数据展示了在葡萄糖或半乳糖丰富的培养液中，氯苯甲嗪在一段时间对细胞生存能力的影响。mch58纤维细胞生长在10mm葡萄糖或10mm半乳糖中，用50μm氯苯甲嗪处理至3天。在每个时间点，用celltiter-glo相对荧光试验(rlu)计算细胞内atp水平。数据表示为超过dmso对照±sd(n＝5)的平均倍数变化。图3k的线性图表展示了氯苯甲嗪在从老鼠心脏分离的最初心肌细胞抑制呼吸。心肌细胞暴露在氯苯甲嗪指示浓度后，在呼吸代谢箱测定氧耗。典型的呼吸影响如图所示。图3l的线性图表展示了氯苯甲嗪在从老鼠胚胎分离的最初皮层神经细胞抑制呼吸.在时间为0(分钟)时，在e14-15天胚胎获得的最初老鼠皮层神经细胞加入氯苯甲嗪(5和10μm)或抗霉素(1μm)测定氧耗率(ocr)。数据表示为平均+/-sd(n≥3)。图3m-n的柱状图展示了氯苯甲嗪不能改变线粒体dna拷贝数(3m)或线粒体mrna表达(3n).*p＜0.001；双面t检验(每个n＝3)。图4a说明了具有代表性的全基因组rna数据概况，该数据展示了在细胞生长中对于i)谷氨酰胺酶(gls)；ii)己糖激酶(hk2)；andiii)硫氧还蛋白(txnip)的mrna水平，该细胞生长在50μm氯苯甲嗪或dmso处理过的葡萄糖中。数据描述为平均±se；通过双面检验p＜0.05(n＝3)。图4b的典型数据展示了细胞的生存能力该细胞生长经过dmso或50μm氯苯甲嗪，20mm谷氨酸和2.5mm谷氨酸二甲酯盐酸盐处理后的葡萄糖培养液。dmso-实心柱状图。氯苯甲嗪-空心柱状图。图4c的典型数据展示了细胞的生存能力该细胞生长经在dmso或50μm氯苯甲嗪，20mm谷氨酸和2.5mm谷氨酸二甲酯盐酸盐处理后的半乳糖培养液。dmso-实心柱状图氯苯甲嗪-空心柱状图。图5a的典型数据展示了突变sthdhq111/111鼠科纹状体细胞的atp水平，该细胞描述了去除血清与不去除血清，暴露50μm氯苯甲嗪与不暴露50μm氯苯甲嗪的变异亨廷顿蛋白。数据表示为平均±sd，双面t检验表明p＜0.01(n＝3)。图5b的典型数据展示了在对照sthdhq7/7鼠科纹状体细胞的atp水平，该细胞描述了去除血清与不去除血清，暴露50μm氯苯甲嗪与不暴露50μm氯苯甲嗪的野生型亨廷顿蛋白。数据表示为平均±sd，双面t检验表明p＜0.01(n＝3)。图5c的典型数据展示了突变hd细胞生存能力对氯苯甲嗪的剂量反应。试验确定细胞生存能力，以相对于dmso处理细胞的倍数变化来表示。实线代表了非线形回归。数据描述为平均±sd(每个数据点n＝3)。图5d的典型数据展示了移去血清和暴露dmso或50μm氯苯甲嗪后的3个时间点，westernblot分析从突变hd细胞提取的蛋白。图5e的典型数据展示了16种药物和dmso孵育后的细胞生存能力通过药物靶组织化合物。血清处理作为阳性对照。数据表示为平均±sd(n＝3每种药物).图5f的典型数据展示了在昆虫中氯苯甲嗪的剂量反应曲线，对照19q或128q描述了该曲线。24h同时以血清和50μm氯苯甲嗪处理与不处理，sthdhq111/111纹状体细胞的明视场典型显微图片(20x)如图5g所示。暴露在不同浓度氯苯甲嗪200分钟，mch58纤维细胞氧耗率(ocr)的典型变化数据如图6a所示。数据表示为平均+/-sd(n＝3)。暴露在50μm氯苯甲嗪6小时后，mch58纤维细胞乳酸生产率典型变化数据如图6b所示。n＝6；意味着p＜0.01。图7a和图7b的柱状图展示了暴露在50μm氯苯甲嗪或dmso200分钟后，多种细胞类型的ocr和ecar典型变化数据。数据描述为平均+/-sd(n≥3)。在含有培养液的葡萄糖中，暴露在50μm氯苯甲嗪或dmso对照200分钟后，多种类型细胞的氧耗率变化(ocr)如7a所示，细胞外酸化率(ecar)如7b所示。数据描述为平均+/-sd(n≥3)。意味着p＜0.05；两面t检验法计算d值。在hela细胞(图.a和b)，hek293细胞(图.8c和8d)，老鼠永生化纹状体细胞sthdhq7/7(图8e和8f)，50μm氯苯甲嗪对氧耗率(ocr)和细胞外酸化率(ecar)的影响的典型数据如图8a-f所示。数据标准化为dmso对照；数据描述为平均+/-sd(n≥3).。图9的线性图表展示了在293个细胞中，与传统的oxphos抑制剂相比，超过dmso基线以氯苯甲嗪介导的氧耗率(ocr)减少的时间进程。数据描述为+/-sd(n≥3)。图10a-10b的典型数据展示了氯苯甲嗪对hif-1α稳定性的影响。在图10a中，在6h以0.1％dmso，100μm去铁胺(dfo)或50μm氯苯甲嗪治疗后，通过提取hela细胞蛋白westernblot分析检测hif-1α和hif-2α。6小时以dmso，100μmdfo或50μmmec处理，图10b的柱形图展示了短暂地转染hela细胞测量hif受体活性。ntc指的是没有转染的对照。数据代表了2个各3次重复的独立实验。(*p＜0.05；双面t-检验).在葡萄糖丰富的培养液中暴露在50μm氯苯甲嗪6小时(n＝3)后，图11a的代表性数据鉴别了mch58细胞的不同表达基因(fdr＜0.175)，通过affymetrixu133plus2.0基因表达试验测定其mrna水平。图11b的代表性数据展示了通过qrt-pcr测量gls的表达(n＝3，*p＜0.005)。图12a的代表性数据展示了shrna靶向gls减少了gls的表达。图12b的代表性数据展示了在稳定转导shgls细胞中，shrna靶向gls减少了细胞内ocr(n＝5，*p＜10-4)。图13的代表性数据展示了westernblot分析了氯苯甲嗪在gls蛋白水平的影响。图14a的代表性数据展示了来自于cmv启动子的gls-gfp融合蛋白组成性表达。用抗gls抗体做westernblot分析。0分钟(n＝4)加入dmso或50μm氯苯甲嗪后，图14b的代表性数据展示了在分类对照(lacz)facs或gls表达细胞的ocr检测。图15a的代表性数据展示了6小时暴露在50μm氯苯甲嗪后，mch58纤维细胞中124种代谢物的倍数变化。数据表示为在dmso处理细胞的倍数变化(n＝6).图15b的代表性数据展示了质谱检测的磷酸乙醇胺相对量。通过三重四极质谱仪检测dmso或50μm氯苯甲嗪处理后的mch58纤维细胞或老鼠纹状体细胞的磷酸乙醇胺(pea)的相对量。hilic分离细胞提取的代谢物，通过跑pea标准(sigmap0503)确定hplc柱和pea峰。(纤维细胞n＝6；纹状体细胞n＝3).图16a的代表性数据证明了在独立线粒体的剂量依赖性方式中，pea抑制解偶联呼吸作用。给药cccp的前后检测了独立线粒体氧耗的急性影响，如箭头所示。3个独立测量有代表性。图16b的代表性数据证明了对解偶联剂cccp的反应中，氯苯甲嗪抑制了呼吸作用的增加。cccp处理后，293个细胞以25μm氯苯甲嗪进行前处理6个小时，但未能激发氧耗，未能达到以dmso对照处理的同等程度。图16c-d的线性图表展示了pcyt2(ctp：磷酸乙醇胺腺苷酸转移酶2)是氯苯甲嗪(16c)和s-氯苯甲嗪(16d)的靶标。在50-1000μm氯苯甲嗪或50-600μms-氯苯甲嗪存在下，纯化的重组体pcyt2在体外进行pcyt2酶试验。图17a的代表性数据展示了氯苯甲嗪解救的sthdhq111/111的生存能力和其对oxphos的影响有关。图中描绘了由于(0，5，10，12.5，25，37.5and50μm)不断增加的氯苯甲嗪浓度，sthdhq111/111细胞的生存能力的倍数变化和与之相应的ocr的减少。数据表示为平均+/-sd(n≥3)。图17b-c的线性图表展示了加入50μm氯苯甲嗪，50μm阿托品，或50μm茛菪碱(17b)和50μm氯苯甲嗪，50μm美吡拉敏，50μm苯吡胺(17c)后，293个细胞检测的氧耗率(ocr)的结果。数据表示为平均+/-sd(n≥3)。图18a-b的代表性数据展示了在erk和akt信号通路中的氯苯甲嗪的影响。移去血清和暴露在dmso，50μm氯苯甲嗪或33μm鱼藤酮后，在12小时提取sthdhq111/111纹状体细胞的蛋白做westernblot分析。从细胞信号通路能获得市场上能买到的抗体，其能特异性检测磷酸化erk或akt。图18-a为p-erk；thr202ortyr204的磷酸化检测。图18b为p-akt；thr308的磷酸化检测。图18c的柱形图展示了撤销血清，药物处理后sthdhq111/111细胞生存能力的百分变化。使用20μm的r-氯苯甲嗪(r-mec)，s-氯苯甲嗪(s-mec)和外消旋混合物(rac-mec)。血清处理作为阳性对照。数据表示为平均+/-sd(每种药物n＝4)。图19a-b的代表性药物展示了在两种亨斯顿疾病模型中氯苯甲嗪(33μm)对htt-q128蛋白表达的影响。用鼠源抗人hd抗体检测htt-q128。对照为dmso。图19a为从htt-q128表达的线虫提取蛋白进行westernblot分析。图19b为从elav-gal4＞uas-htt-q128成年d.黑腹果蝇(十天饲养期).提取的溶菌产物进行westernblot分析。图20的代表性数据展示了在q128表达的线虫plm神经细胞氯苯甲嗪对其蛋白聚集体的影响。33μm氯苯甲嗪处理后通过光学显微镜检测htt-q128聚集体的形成。在80个昆虫中至少180plm神经细胞被计算在内(n＝3)。图21a的代表性数据展示了dmso或33μm氯苯甲嗪对128q线虫轴突障碍性疾病的影响的荧光图片。柱形图大小意味着5μm。图21b的代表性数据展示了在128q表达的线虫plm神经细胞氯苯甲嗪对轴突肿胀的影响。在htt-q128表达的昆虫plm神经细胞，dmso或33μm氯苯甲嗪处理后光学显微镜观察轴突肿胀。至少计算80个昆虫的180个plm神经细胞(n＝3，*p＜0.01)。图22的代表性数据展示了突变htt(q128/128)在黑腹果蝇光感受器的表达。用伪瞳孔技术光学显微镜成像。图22a展示了表达突变htt-q128(elav-gal4＞uas-htt-q128)的果蝇在羽化时每个小眼有7个可见光收集单位(视杆细胞)的正常互补区。图22b展示了表达突变htt-q128(elav-gal4＞uas-htt-q128)的果蝇在羽化后视杆细胞数量在减少，退化加快。图23的代表性数据展示了在黑腹果蝇体内hd模型中，氯苯甲嗪解救的神经元亏损。转基因人类hd-q128中的神经细胞使用了elav-gal4，其导致了时间依赖性神经退行性疾病，这可作为对可见视杆细胞的数量估计。果蝇以dmso赋形剂或33μm氯苯甲嗪处理10天，计算每个小眼的视杆细胞的平均数量，其分布如图所示。数据表示为±sd(n＝2，*p＜0.05).图24a-b的代表性数据展示了在人类胚胎的293个肾细胞中，(r)和(s)氯苯甲嗪对细胞氧耗的影响。在c2c12肌小管中，氯苯甲嗪，s-氯苯甲嗪，r-氯苯甲嗪激活ampk的westernblot如图24c所示。图24d的线性图表展示了不是s-mec，是r-mec结合h1受体。图24e-f的线性图表展示了r-氯苯甲嗪(24e)比s-氯苯甲嗪(24f)对组胺受体更有效。图25a-b的代表性数据展示了在缺血再灌注的体内纹状体细胞中，氯苯甲嗪的保护作用。数据表示为+/-sd，n≥3。意味着双面t检验p＜0.01。在pbs中将氯苯甲嗪溶入10％cremaphorel溶液(sigmano.c5135)，用naoh调ph为中性。图25a为葡萄糖和氧气的对照ir数据。图25b：保护性ir数据代表了氯苯甲嗪，葡萄糖和氧气的功能。图26展示了subclassi中二甲亚砜派生物结构的代表性化合物。图27a展示了subclassii中三环结构的代表性化合物。图27b展示了subclassiii中硫代二苯胺的代表性化合物。图28a-f展示了抗组胺剂的代表性化合物。图29展示了diphenylpiperazine结构的代表性化合物。图30a-b展示了烷氧基联二苯结构的代表性化合物。图31a-b展示了联二苯(烷氧基)结构的代表性化合物。图32a-b展示了三环结构的代表性化合物。氯苯甲嗪对暴露在局部缺血-再灌注(i/r)的独立心肌细胞的影响如图33a-33c所示。图33a简要展示了实验设计。图33b的直方图展示了心肌细胞i/r后在对照，未处理和药物处理(mec，氯苯甲嗪；atrop，阿托品；phenir，苯比胺；pyril，美吡拉敏；scopo，莨菪碱)的生存能力。图33c的直方图展示了在对照，未处理和氯苯甲嗪处理中的心肌细胞i/r后的vo2。图34a-b包含的数据展示了在独立心脏中氯苯甲嗪的保护作用。图34a的线性图表展示了在细胞赋形剂(开放的环)和氯苯甲嗪处理(闭合的环)的心脏中增压前和i/r后的百分率。图34b的线性图表展示了在细胞赋形剂(开放的循环)和氯苯甲嗪处理(封闭的循环)的心脏中检测的梗死区大小。图35a-35c包含的数据展示了在中风动物模型中氯苯甲嗪的保护性作用。35a是哺乳动物中风模型的方案。在大脑动脉短暂闭塞中间前1h，分别在17h和3h以100mg/kg的氯苯甲嗪，20mg/kg美吡拉敏和0.5mg/kg莨菪碱或赋形剂对雄性c57bl/6小鼠进行两次腹腔注射，然后24h再灌注。图35b表示以氯苯甲嗪，莨菪碱，美吡拉敏或赋形剂处理的小鼠，从该小鼠内获得的以ttc着色的1mm后的冠状切片，以此计算梗死体积。数据点指的是相对独立的实验，实线代表了他们的平均值(赋形剂和莨菪碱*p＜0.05，和美吡拉敏*p＜0.01一步anova后是tukey的多重比较实验)。以氯苯甲嗪，莨菪碱，美吡拉敏或赋形剂处理，在共同颈动脉(cca)和中部大脑动脉(mca)闭塞后，在基线处检测的大脑血流量(cbf)如图35c所示。数据表示为平均±s.d.图35d的线性图表展示了以氯苯甲嗪，莨菪碱，美吡拉敏或赋形剂处理，在大脑(切片1-10)的梗塞范围变化。数据点代表了在个体切片水平差异中(赋形剂n＝14，氯苯甲嗪n＝8，美吡拉敏n＝8，莨菪碱n＝5*p＜0.05).梗塞±s.d.mm2的平均范围。图36的柱形图展示了在赋形剂，s-氯苯甲嗪和二甲双胍处理的c2c12肌小管中以分钟为单位检测的本底葡萄糖摄取量。发明详述正如本文所述，通过化合物筛选策略来筛选能量代谢调节剂，鉴定线粒体代谢(如氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)和或糖酵解(glycolysis))的小分子抑制物。氯苯甲嗪(meclizine)被确定为线粒体代谢的干扰剂，可以用于防止细胞死亡，例如，与细胞死亡相关的缺血性损伤(ischemicinsult)或细胞退化性疾病，如神经退化性疾病或糖尿病。化合物筛选策略旨在鉴别从线粒体呼吸到有氧糖酵解(aerobicglycolysis)的小分子诱导代谢转换开关，反之亦然。氯苯甲嗪，一种通过此筛选方法确定的小分子化合物，可以抑制线粒体呼吸和激活有氧糖酵解，显然是通过一种新的代谢机制即抑制pcyt2来完成。这种代表性药物也抑制在细胞和动物模型中的神经退化性疾病的表型。在一些实施例中，本发明可利用细胞代谢的可塑性来开发用于治疗很多与能量平衡相关的疾病的药物。虽然此项发明的作用机理并不重要，我们认为上述筛选策略包括代谢状态依赖性的致死率并利用哺乳动物细胞的代谢可塑性。大多数细胞在提供营养物质的前提下有能力进行有氧糖酵解或氧化磷酸化。在分化和发育阶段，存在长期的、适应性的氧化磷酸化(oxphos)和糖酵解之间的转换，并且可以由转录和转录后调控机制来进行驱动，例如：moyesetal.，j.expbiol.208：1601(2005)。在葡萄糖作为唯一糖源下生长的细胞都通过糖酵解以及线粒体谷氨酰胺氧化途径来获取三磷酸腺苷(atp)，只有一小部分葡萄糖碳骨架(skeleton)进入柠檬酸循环(tcacycle)。(reitzeretal.，jbiolchem254：2669(1979)；deberardinisetal.，pnasusa104：19345(2007))然而，当细胞在半乳糖存在下生长时，几乎所有的atp都是通过线粒体谷氨酰胺氧化得来，且半乳糖碳骨架用来还原生物合成(biosynthesis)。代谢状态依赖致死率筛选可以通过选用类似哺乳动物版的经典酵母在发酵和非发酵培养基中生长的生长实验来得到功能性验证。该方法被来用诊断人类的线粒体呼吸链缺陷疾病。(robinsonetal.，biochemmedmetabbiol.，48：122(1992))。这里公开的筛选试验可用于鉴别化合物，例如可以将细胞代谢向氧化磷酸化转换并减缓快速繁殖细胞的生长率和存活的小分子(这种化合物可以起到治疗癌症的效用)，以及新的氧化磷酸化抑制剂小分子。这种筛选机制可以在完整的细胞中进行，例如，经过72小时的药物治疗，从而确定能够通过新的机制降低氧化磷酸化的试剂，包括在葡萄糖作为唯一糖源的情况下不影响细胞生长或存活的相对无毒的试剂。细胞能量代谢和疾病线粒体是细胞能量的加工厂，它能够将我们吃的食物转换为细胞能量流通货币atp。越来越多的证据表明，抑制线粒体呼吸实际上可以在一系列的疾病中起保护作用，包括糖尿病、阿尔茨海默氏病(alzheimer’sdisease，ad)、帕金森病(parkinson’sdisease，pd)、亨廷顿病(huntington’sdisease，hd)，以及缺血性疾病像中风(stroke)和心肌梗塞。oxphos到糖酵解途径是如何转换的？现有研究表明，基因突变导致的hd，ad，pd和肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，als)通过与电子传递链的不同组分相互作用，从而导致改变线粒体的钙运输，氧化损伤(oxidativedamage)，坏死或凋亡细胞死亡。(knottetal.，natrevneurosci9：505(2008))。一个功能性的线粒体呼吸链可能加剧突变蛋白的毒性。就像在细胞和动物模型中进行的遗传和化学修饰研究所证明，通过调控电子传递链的活力，从而提供一种减少疾病病理发生途径的潜在手段。例如buttneretal.，jbiolchem283，7554(2008)；fukuietal.，procnatlacadsciusa104，14163(2007)；和varmaetal.，procnatlacadsciusa104：14525(2007)。在ad、pd、hd的动物模型研究中发现，遗传或药理抑制线粒体呼吸链可以抑制疾病的病理发生途径。神经元特异性细胞色素c氧化酶缺陷型小鼠(杂合iv型)实验证实，当表达淀粉样蛋白(amyloid)前体或早老素1(presenilin1)时，形成的一些淀粉样蛋白斑块会减少，氧化损伤也降低。fukuietal.，pnasusa104：14163(2007)。在表达α-突触核蛋白(synuclein)的酵母中，通过消耗线粒体dna来去除线粒体呼吸，可以减少活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)的形成和细胞凋亡。因此，抑制线粒体功能可以抑制由等位基因疾病引起的毒性。(buttneretal.，jbc283：7554-7560(2008))由鱼藤酮(rotenone)和寡霉素(oligomycin)介导的药理性抑制呼吸链可以在细胞培养过程以及hd体内模型实验过程中防止细胞凋亡发生。(varmaetal.，pnasusa104：14525(2007))。二甲双胍(metformin)，糖尿病的一种有效治疗药物，被认为参与了抑制线粒体呼吸链，从而激活了一些自适应途径包括提高腺苷酸激酶(ampkinase，ampk)活性，促进外围对葡萄糖的摄取，并抑制肝脏糖异生(gluconeogenesis)。(leverveetal.，diab.metab.29：6s88-94(2003))。二甲双胍是目前最广泛应用的ii型糖尿病的治疗药物之一。按照本文描述方法确认的抑制oxphos的其它化合物，像氯苯甲嗪(meclizine)或s-氯苯甲嗪，也是治疗糖尿病的候选治疗药物。此外，其他研究者已经提出，那些阻断线粒体呼吸的试剂可以在心脏或大脑缺血再灌注(reperfusion)后，预防细胞损伤和死亡发生。(chenetal.，amjphysiolcellphysiol292：c137(2007)，andhuberetal.，neuropharmacology48：558(2005))。用于二级预防中风(stroke)的的他汀类药物和其他药物的神经保护作用可能是由于这些药物引起轻度抑制线粒体呼吸链。见huberetal.，neuropharmacol48：558(2005))。用ii型复合物抑制剂3-硝基丙酸(3-nitropropionic，3-npa)预处理，可以在局部和全脑缺血的小鼠中诱导耐受性。将之前报告的这些关于oxphos抑制剂的治疗效果的研究结果转化存在一个很大的限制，那就是缺乏临床上可接受的用于转变病人体内细胞对线粒体呼吸的依赖性的策略。目前所知的oxphos抑制剂直接阻断呼吸链，表现出不佳的治疗指数(therapeuticindex)，并且有毒性。由于其作用迅速，oxphos抑制剂往往能够快速中断呼吸链，产生自由基损伤和迅速消耗细胞三磷酸腺苷，尤其在氧化的细胞中。见图9所示。虽然激活组织缺氧诱导因子途径可以将能量代谢调向糖酵解来提供另一种潜在治疗途径，但是很少有临床上可以接受的激活这种途径的策略。(luetal.，jbiolchem283：28106(2008)；aragonesetal.，natgenet40：170(2008)；andgiacciaetal.，natrevdrugdiscov2：803(2003))。在一些实施例中，本发明提供通过对oxphos减少的数量或水平来滴定，即oxphos的部分衰减，而不是完全抑制线粒体的oxphos，使得伴随完全抑制oxphos的毒副作用不出现或降到最低的方法。(滴定的能力，可以使用剂量反应分析检测；或全有或全无反应的化合物(例如，一个阶跃函数(step-function)响应)是不合适的，因为他们是不可滴定的，而那些有一个平滑的剂量反应曲线的药物则是可滴定的)。这些可滴定的药物将有望提高治疗指数。相反，快速增长的细胞(如肿瘤细胞)主要依靠糖酵解的能量。因此，确定化合物具有低sglu/gal(例如，化合物sglu/gal低于零，例如sglu/gal在-0.33到-0.75之间)可以作为治疗癌症的药物或作为其他癌症治疗药物的佐剂。lampidisetal.，u.s.pat.no.7,338,940专利公开的用于治疗癌症的组合物和方法旨在单独抑制厌氧增长的肿瘤细胞(即，这些细胞在肿瘤核心)的糖酵解和或结合抑制来源于同一肿瘤的有氧生长的肿瘤细胞(即，这些细胞在肿瘤边缘)的氧化磷酸化。文献侧重于六类糖酵解抑制剂：i)2脱氧-d-葡萄糖类似物；ii)d-己糖吡喃糖(hexopyranose)类似物；iii)c-2葡萄糖异构物；iv)c-3，c-4葡萄糖异构物；v)甘油类似物；和vi)乳酸脱氢酶抑制剂。然而，如文献公开所述，由于细胞从有氧到厌氧代谢转换，氧化磷酸化抑制剂(即，罗丹明(rhodamine)123)导致乳酸增加。这种状况增加了他们对糖酵解抑制剂的敏感性。此外，该文献提到了传统上使用的抗癌药物(即，阿霉素(doxorubicin)，长春新碱(vincristine)，紫杉醇(paclitaxel))在有氧且无乳酸积聚的环境下是有效的(即，没有反映抑制氧化磷酸化)。因此，文献建议通过使用一种方法测量乳酸积聚可用于广泛筛选结构不同的化合物库，以确定抑制氧化磷酸化的化合物，从而使肿瘤对糖酵解酶抑制剂敏感。然而，文献没有提到通过比较细胞在葡萄糖和半乳糖培养基中生长来确认非毒性的糖酵解抑制剂，即有效的抗癌药物。(dated3/4/2008；seealsou.s.patentno.7,160,865(dated1/9/2007)；u.s.patentapplicationno.us2006/0025351，2005/0043250and2003/0181393；andwipopublicationno.wo/2001/082926selectedparts.)。rossignoletal.，cancerresearch，64：985-993，2004报道研究癌细胞或者适应糖酵解或者适应氧化磷酸化，取决于提供能量来源的葡萄糖和半乳糖的使用。进一步文献揭示，当葡萄糖不可用而癌细胞只能靠糖酵解产生能量时，癌细胞能够利用谷氨酰胺酶解，谷氨酰胺氧化产物。文献没有提到通过比较细胞在葡萄糖和半乳糖培养基中生长来确认非毒性的或者氧化磷酸化或者糖酵解抑制剂。治疗方法通过本发明的方法确认的组合物，例如文中提到的化合物，由于他们具有调控线粒体氧化磷酸化的能力，所以可以用来治疗人类疾病或延缓疾病发展，其中oxphos活力可能有助于疾病形成，或者抑制oxphos可以激活细胞的自适应程序从而帮助预防疾病发生。例如，线粒体oxphos活性有助于形成的疾病，包括但并不局限于，糖尿病例如ii型糖尿病、神经退化性疾病、以及缺血再灌注损伤例如中风、肾缺血性损伤、缺血性心脏病。另外，如下面描述的与寄生虫(parasitic)如某些原生动物(protozoan)寄生虫感染相关的疾病也可以治疗。所有这些疾病都可以用经确认为oxphos抑制剂的化合物来治疗，比如说一种具有高sglu/gal评分的化合物，例如氯苯甲嗪。例如，筛选出来的药物sglu/gal评分大于零则可以作为一种非毒性的oxphos抑制剂，可以用于治疗神经退化性疾病或缺血性疾病，糖尿病，或寄生虫感染。已经确认的化合物，例如这里提到的氯苯甲嗪，可以作为药物或继续开发用于治疗文中提到的由线粒体oxphos活力引发的疾病。另外，筛选出来的药物sglu/gal评分低于零则可能有潜在的治疗癌症的用途。正如本文所述，氯苯甲嗪作用于pcyt2，从而扰乱在所有真核细胞都作为主要磷脂(phospholipid)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)的合成。磷脂酰乙醇胺合成可以通过(i)kennedy途径的cdp-乙醇胺分支；(ii)磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)的脱羧(decarboxylation)途径；或(iii)基于磷脂酰丝氨酸的交换途径来完成。在哺乳动物包括人类，所有三个途径都可用。然而，在某些原生动物病原体(pathogen)包括布氏锥虫(trypanosomabrucei)，这个引发人类和动物的非洲锥虫病(昏睡病(sleepingsickness))的病原体；克氏锥虫，一种引起美洲锥虫病(chagasdisease)的寄生虫；和恶性疟原虫，人类疟疾寄生虫，他们的磷脂酰乙醇胺主要都是通过kennedy途径合成的。因此，像氯苯甲嗪针对pcyt2扰乱这一途径的化合物可作为治疗药物，用于治疗靠pcyt2介导磷脂酰乙醇胺合成途径的这些寄生虫所引起的疾病。细胞退化性疾病本文描述的方法包括治疗像神经退化性疾病的细胞退化性紊乱。该方法可以包括给那些已经或正在发展为退化性疾病的患者摄入像氯苯甲嗪这类具有高sglu/gal评分的化合物。可以用这些方法治疗的疾病包括阿尔茨海默氏病(ad)，帕金森病(pd)，亨廷顿病(hd)，肌萎缩侧索硬化(als)和弗里德赖希氏共济失调(freidreichataxia)。线粒体代谢抑制剂已被证明在亨廷顿型病模型中可以挽救细胞死亡(varmaetal，procnatlacadsciusa.2007)，这种线粒体的代谢功能对老龄化酵母中α-突触核蛋白毒性发生尤其需要(buttneretal.，jbiolchem.2008)。正如本文所示，氯苯甲嗪对三种不同亨廷顿病模型中能够起到防止神经细胞死亡和细胞营养不良。糖尿病此外，本方法可用于治疗糖尿病。抑制线粒体呼吸链激活几种自适应途径包括提高amp激酶(ampk)活性，从而促进在外围对葡萄糖的摄取，并抑制肝脏糖异生途径。(leverveetal.，diab.metab.29：6s88-94（2003))。二甲双胍，其功效至少部分是通过这一机制来完成的，是目前广泛应用的ii型糖尿病的治疗药物之一。正如本文所述，氯苯甲嗪和s-氯苯甲嗪能够抑制培养的肌肉细胞的oxphos并激活ampk活性(见图24c)，促进培养的肌肉细胞对葡萄糖的摄取(图36)，降低r6小鼠的血糖水平。缺血性紊乱本文所述方法包括治疗缺血再灌注损伤相关的疾病，包括心肌缺血(myocardialischemia)，脑缺血(cerebralischemia)和肾缺血(renalischemia)。例如，对易患或存在心肌缺血高风险的患者，该方法可用来在心脏手术过程如心脏移植、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronaryintervention，pci)、或冠状动脉旁路搭桥术(coronaryarterybypassgraft，cabg)、和不稳定型心绞痛(angina)期间快速保护心肌、防止心肌损伤。该方法可以包括给冠状动脉疾病患者摄入像氯苯甲嗪这类具有高sglu/gal分值的化合物，作为抗心绞痛药物。对于那些已经患上肾缺血或具有患上肾缺血风险的患者，在冠状动脉旁路搭桥手术时，具有高sglu/gal值的化合物例如像氯苯甲嗪可以用来减轻急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)，并减少移植损伤。对于那些已经患上或具有患上脑缺血风险的患者，在颈动脉内膜切除手术(carotidendarterectomy，cea)或冠状动脉旁路搭桥手术期间，具有高sglu/gal评分的化合物例如氯苯甲嗪可以用来降低中风的风险或中风带来的损伤，并且可以防止蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，sah)后二次缺血。特别是，这些化合物可用于治疗短暂性脑缺血发作(transientischemicattack，tia)或轻微中风，或具有中风风险或在30天内中风复发风险的患者(例如，刚发生完出血性中风(hemorrhagicstroke)的患者，或即将接受伴随缺血再灌注损伤风险的手术例如器官移植、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路搭桥或颈动脉内膜切除等手术的患者)。当患者即将接受伴随缺血再灌注损伤风险的手术，这类化合物可以在手术前、手术过程中或手术后摄入。因此，由文中所描述的方法确认的组合物，例如氯苯甲嗪这类具有高sglu/gal评分的药物适用于治疗缺血性紊乱疾病，包括但不限于中风、缺血性心脏病(例如心脏病发作或心绞痛)、再灌注损伤。缺血性心脏病缺血性心脏病是医生用来描述由于冠状动脉疾病导致的充血性心脏衰竭的一个术语。“缺血”，是指器官(如心脏)得不到足够的血液和氧气。当动脉血液和氧气往心脏运输过程中被阻断时发生缺血性心脏疾病。在用于输送氧气到心脏肌肉组织的动脉中可能积聚了称为斑块的胆固醇(cholesterol)和其他物质。缺血性心脏疾病是充血性心脏衰竭的常见病因。患有这种疾病的患者可能曾经有过心脏病发作、心绞痛、或不稳定型心绞痛。一些患者可能并没有注意到任何前期症状。在美国，缺血性心脏病是心肌病的一种常见类型，大约影响着百分之一的人群，病发人群主要出现在中年到老年男子中。患缺血性心脏病的危险因素包括但不局限于个人或家族有心脏病发作、心绞痛、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化或其他冠状动脉疾病、高血压、吸烟、糖尿病、高脂饮食、高胆固醇和肥胖的历史。缺血性心脏病的症状包括但不局限于胸部疼痛，局部性的胸骨下但可以移动(从中心向四周扩散)到脖子、下巴、背、肩、臂且伴随着紧张、压力、不能站起来和或挤压的感觉(疼痛可能会或不会随着休息或注射硝化甘油得到缓解)、心悸、不规则或快速脉搏(rapidpulse)、呼吸急促、咳嗽、疲乏无力、头晕、警觉性下降或注意力不集中、白天尿量减少、晚上排尿过多和全身肿胀。测量射血分数(ejectionfraction)测试可用于诊断缺血性心脏病，包括但不局限于超声心动图、心导管插入术(cardiaccatheterization)期间的脑室造影照片(ventriculogram)、门控断层显像(gatedspect)、胸部核磁共振成像(mri)、心电图(ecg)或心脏活检。目前的治疗目标是缓解症状和解决致病起因。目前给药的几种类型的药物，包括但不局限于血管紧张素(angiotensin)转换酶抑制剂(如卡托普利(captopril)或赖诺普利(lisinopril))、β-肾上腺素(adrendergic)阻滞剂(如美托洛尔(metoprolol)或卡维地洛(carvedilol))、或利尿剂(diuretic)(如呋塞米(furosemide))(速尿(lasix))、安体舒通(spironolactone)、或依普利酮(eplerenone)。这里描述的方法包括这些治疗方法与氯苯甲嗪相结合，分别实施或组成单一组合物进行实施。脑缺血或中风中风是一个中断向大脑任何部位供应血液的症状。中风有时也被称为“brainattack”。大约每40秒钟，美国就会发生一例中风。中风在如下条件下会发生：i)向大脑供应血液的血管被血凝块堵塞(例如缺血性中风)，ii)血管破裂，导致血液渗漏到大脑(例如出血性中风)。如果血流停止时间超过几秒，大脑得不到血液和氧气，脑细胞就会死亡，造成永久性损伤。缺血性中风是中风的一个常见类型。通常这种类型的中风是由动脉阻塞导致的，这种情况被称作动脉粥样硬化。脂肪、胆固醇和其他物质在动脉壁聚集则会形成一种粘性物质，称为斑块。随着时间的推移，斑块积聚。这往往使得血液很难正常流动，从而导致血液凝结。其他引起血栓相关的缺血性中风的原因，包括但不局限于不正常的心脏瓣膜(abnormalheartvalve)、心内膜炎(endocarditis)或存在一个机械性心脏瓣膜。例如血栓能够在心脏瓣膜形成，中断，然后传播到大脑。因为这个原因，那些能够形成机械性或不正常心脏瓣膜的药物往往是处方的抗凝血药物(例如香豆素(coumadin))。出血性中风也是一种常见的中风类型。通常这种类型的中风是由脑出血导致的。它可以在大脑中的小血管变得软弱和爆裂时发生。某些大脑血管存在缺陷的人更容易出现此现象。当血管破裂损害脑细胞后就会出现脑出血。缺血性中风的危险因素包括但不局限于高血压、糖尿病、家族病史、心脏病高胆固醇或老龄化。某些药物使血液凝块的可能性更大，可能会增加中风的风险(如某些口服避孕药(contraceptive))。出血性中风的危险因素包括但不局限于饮酒、出血疾病、吸食可卡因(cocaine)或头部创伤。中风的症状取决于大脑的哪个部分受损。在某些情况下，一个人甚至不可能意识到他或她中风了。症状往往来得突然，没有任何预兆。他们可能是偶发(episodic)(突然发生，然后停止)或可能随着时间的推移慢慢变得更糟。一般中风的症状包括但不局限于警觉性发生变化、昏睡(coma)、嗜睡(lethargy)、瞌睡(sleepiness)、不省人事(stupor)、失去知觉(unconsciousness)、情绪低落(emotionalwithdrawal)、说话困难或理解能力低下、吞咽困难、读写困难、头痛、散失协调、失去平衡、独自行动困难、恶心(nausea)或呕吐(vomiting)、抽搐(seizure)、自我感观改变、突然混乱、全身虚弱或视力出现问题。诊断中风的测试可以包括但不局限于进行脑血管造影、完整血小球计数、凝血素(prothrombin)活化时间、部分促凝血酶原激酶(thromboplastin)活化时间、心电图(ecg)超声心动图、颈动脉多谱超声(carotidduplexultrasound)、脑部ct、脑部核磁共振成像(mri)、核磁共振造影(magneticresonanceangiography，mra)、血管造影(ctangiography)或心脏检测。目前的治疗通常需要立即(即缺血性中风事件发生3小时内)给药使用溶栓(thrombolytic)药物(例如，对苯二甲酸(tpa))。值得注意的是，如果中风是出血性而非缺血性，溶栓可以使损伤变得更重。对于出血性中风而言，需要进行手术来清除汇集于大脑的血液和修复受损血管。在其他情况下，由于有血液凝块，采用肝素(heparin)和香豆素抗凝血剂来治疗中风。阿司匹林也可以使用。另外可能需要其他药物来控制其他症状，像高血压。止痛药(painkiller)用来控制剧烈的头痛。长期治疗的目的是为了帮助病人恢复尽可能多的功能，防止将来中风。恢复时间和需要长期治疗因人而异。根据症状，康复(rehabilitation)可能包括但不局限于专业治疗、物理治疗或言语治疗。肾缺血急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)可由肾缺血导致。例如，在所有诸如冠状动脉旁路搭桥手术的高风险手术中aki达到了5％。用氯苯甲嗪或s-氯苯甲嗪预处理可以帮助防止或减少急性肾损伤带来的损害。如图所示(图7a和7b)，在来源于人类肾的293细胞中，氯苯甲嗪能够转移呼吸产物到糖酵解途径。当前适应症此外，本发明提供了s-氯苯甲嗪和其药学上可接受的载体，例如盐酸s-氯苯甲嗪，用于其外消旋体(recemate)应用的适应症。这些适应症包括那些列在默克手册上的疾病，像恶心和与伴随运动相关疾病的呕吐(包括慢性和急性运动病)和终端疾病(例如临终病人)；和眩晕(vertigo)或头晕造成的某些内耳问题，例如良性(benign)位置性眩晕，梅尼埃病(meniere’sdisease)，前庭神经炎(vestibularneuronitis)，内耳迷路炎(labyrinthine)；中耳炎(otitismedia)；创伤(trauma)(例如，鼓膜(tympanicmembrane)破裂，挫伤迷路(labyrinthinecontusion)，外淋巴瘘(perilymphaticfistula)，颞骨(temporal)骨折，脑震荡(postconcussion))；听神经瘤(acousticneuroma)；耳毒性给药，例如耳毒性药物；耳袋状疱疹(herpeszosteroticus)(拉姆齐综合症(ramsayhuntsyndrome))；和其他中枢和外周神经炎症。眩晕通常是用来描述各种相关的感觉，包括视线模糊(感觉即将昏厥(syncope))；头晕；感觉不平衡或不稳定；或含糊或精神恍惚的感觉。眩晕是一种虚假的自我或环境的运动感。如tucci所描述的，“头晕和眩晕”是发生在耳、鼻、咽喉和牙的神经紊乱：治疗耳朵有问题患者的途径，默克手册，2009年1月。在一些实施例中，这些迹象表明s-氯苯甲嗪给药剂量和外消旋体是相同的。线粒体疾病或先天性线粒体代谢疾病的禁忌线粒体疾病是指与呼吸链功能失常相关的一些异常症状，这些异常症状在
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很著名；被发现有高的sglul/gal(值正如本文描述的)的化合物对有线粒体疾病的患者中是有毒的，这一观点被普遍接受。因此，这些方法可以包括决定一个患者是否有线粒体疾病，而不是对患者用某种药物(例如不会给患者用氯笨甲嗪)，或者是选择一种没有高的sglu/gal值的药物来治疗。筛选代谢调节物的方法许多生物可以在糖酵解代谢和氧化代谢之间转换，这种灵活性已经在酵母中进行了经典的研究，研究表明当发酵的糖源在培养基中耗尽时酵母中经历了一个二阶段的转换。在某些实施方案中，这里描述的方法探究代谢的灵活性以发现安全和临床可用的药物，而此次研究用本文描述的方法是以细胞为基础的研究策略，为的是发现可以选择性的阻断细胞的生长和生存化合物，当细胞依赖于氧化磷酸化与糖酵解时。与前面的研究一致，这里显示的数据表明当人类的纤维状细胞以葡糖糖为唯一碳源时，细胞从线粒体中的有氧糖酵解和谷氨酰氧化获取能量。例如，当哺乳动物细胞被培养的时候，葡萄糖的出现抑制了氧化代谢(如克拉布特里效应)，在同位素标记的hela细胞实验中已经揭示了当用半乳糖来代替葡萄糖时，细胞就会利用谷氨酰胺驱使的呼吸去产生＞98％的细胞atp，见例子，deberardinisetal.，procnatlacadsciusa104：19345(2007)；andreitzeretal.，jbc254：2669(1979)。见图1a和1b。永生化的人类成纤维上皮细胞通过改变他们的培养基中的糖源可以在糖酵解和氧化代谢之间转化，这种转化可以通过至少两种细胞生理指标(细胞外的酸化速率和氧气的消耗速率)观测到。当葡萄糖为唯一糖源时，细胞从线粒体中的有氧糖酵解和谷氨酰胺氧化获取能量。但是，当半乳糖为唯一碳源时，有一个几乎完全的向谷氨酰胺氧化的转换，作为证明，相比在葡糖糖中生长，糖酵解率会有5-6倍的下降，产生的酸会降低3-4倍，氧气的消耗有2倍的升高，见图1c。附加的数据还描述了在两种营养的情况下的生物动力学，用抗霉素和寡霉素处理可以用来量化整体和解偶联的线粒体呼吸水平。使用这些试剂，在半乳糖存在的情况下，几乎所有的线粒体呼吸是偶联的，在葡萄糖存在时，只有大约15％的呼吸是没有偶联的。只用寡霉素处理显示，在葡糖存在的情况下只有60％的呼吸是用来atp的生产，然而在半乳糖存在的情况下，80％的呼吸是用来生产atp的，见图1d。总的来说，这些结果表明，细胞用在半乳糖培养基中氧化磷酸化生产atp的有效性来弥补糖酵解生产atp的减少。这里描述的筛选的途径可以被用来发现改变细胞能量代谢的小分子。在某些实施方案中，这些物质可以刺激氧化磷酸化的内源抑制剂；在另外一些实施方案中，这些物质减少了pcyt2(磷酸乙醇胺胞甘酸转移酶)的活性。就像本文描述的，氯苯甲嗪抑制pcyt2的活性。因此本文描述的是在体外筛选小分子物质的方法用来确认特异性抑制pcyt2的活性的化合物；这些被确认的化合物作为治疗这里描述的疾病和症状的候选化合物，例如，缺血性的和退行性疾病。在一些实施方案中，一个待试化合物可以应用于表达功能性pcyt2的被测样本中，例如一个细胞，一个存活的组织或器官，或者含有功能性的pcyt2例如纯化的或重组的pcyt2的被测样本，待试化合物对pcyt2活性的影响可以被评估。以培养的或初级细胞为例来来评估被测化合物对pcyt2的抑制能力。在某些实施方案中，这里的方法也包括一个用已知的结合试验来筛选直接和pcyt2、例如分离的pcyt2结合的化合物。pcyt2的基因组序列已经被描述(gene21；325：145-55(2004)))，人类pcyt2mrna序列在genbankacc.no.nm_002861.2中找到，蛋白质的全长序列可以在genbankacc.no.np_002852.1.中找到，可以参考j.biol.chem.272(14)，9567-9572(1997)andjohnsonetal.，biochimbiophysacta.1735(3)：230-5(2005)。对pcyt2活性的测定在
技术领域：
已知，包括试验用14c-磷酸乙醇胺作为底物的结合试验。商业上可通过invitrogen，millipore，sigma-aldrich，r&dsystems，cellsignalingtechnology，和/或enzolifesciences买到实验诸如生化试验。见zhuetal.，gene447(1)：51-59(2009)；tijburgetal.，methodsenzymol209：258-63(1992)；andfullertonetal.，molcellbiol；2007may；27(9)：3327-36。pcyt2的抗体可以从invitrogen，millipore，sigma-aldrich，r&dsystems，cellsignalingtechnology，abcam，abnova，novusbiologicals，epitomics购买得到。在某些实施方案中，小分子可以在生长在葡萄糖或半乳糖的细胞中分别筛选。虽然了解一项发明的机制不是很必要，但是我们认为葡萄糖检测评估糖酵解支持的生长，我们认为半乳糖检测评估基于线粒体氧化磷酸化活性的细胞生产。在某些实施方案中，本发明设计通过比较葡萄糖细胞生长数据和半乳糖细胞生长数据来评估被筛选的小分子化合物的有效性。在一些实施方案中，此种比较包括一个glu/gal的比值。在一些实例中，高的glu/gal比值暗示了氧化代谢的选择性抑制。在一些实例中，低的glu/gal暗示了糖酵解的选择性抑制。在一些实例中，glu/gal比值可以很好地用来鉴别没有毒性的针对任一线粒体途径的抑制剂。在某些实施方案中，本方法包括鉴别选择性地抑制氧化磷酸化的一系列不同化合物。在某些实施方案中，本方法包括鉴别选择性地抑制糖酵解的化合物(即在葡萄糖存在的情况下，通过增加细胞的生长来体现，)，或者鉴别可以同时抑制氧化磷酸化和激活糖酵解的一些药物。在某些实施方案中，鉴别针对细胞的能量代谢的对一系列疾病有广泛治疗效果的临床上已经应用的药物(如fda批准)。一种这样的小分子(例如氯苯甲嗪)，一种otc止吐药，具有很好的血脑屏障通透能力，可以抑制线粒体呼吸。虽然了解此发明的机理不是必须的，但是我们认为氯苯甲嗪可以通过新的代谢机制可以抑制线粒体呼吸，例如抑制pcyt2。另外，氯苯甲嗪在一些疾病包括神经退行性病变，缺血性疾病以及糖尿病疾病的细胞和动物模型中可以抑制疾病的发病机制，显示了这些和其余的通过本文描述的方法发现的线粒体呼吸抑制剂的临床可用性。在某些实施方案中，本文描述的筛选策略可以被用来鉴别小分子化合物，这些小分子化合物可以选择性地抑制线粒体的氧化磷酸化(oxphos)。哺乳动物细胞可以依靠培养基上糖的供应，通过糖酵解或呼吸作用(如氧化磷酸化)来产生atp。见rietzeretal.，jbc254：2669(1979)；androssignoletal.，cancerres64：985(2004)。这种灵活性被开发，并且一种小分子的有效筛选方法用来发现对细胞没有明显毒性的物质。在某些实施方案中，这种筛选方法可以用于鉴别化合物，这种化合物对细胞是否有毒性与细胞中生产atp的途径有关(氧化磷酸化或糖酵解)，也可以叫做依赖于代谢途径的毒性。这些发现的化合物中的一些可以诱导细胞代谢途径的转换-可以是从需氧的糖酵解到线粒体氧化磷酸化，也可以反过来。正如本文所用到的，小分子是指低于3000道尔顿的有机或无机分子。总体来说，这项发明所用到的小分子都是低于3000道尔顿的，这些小分子可以最低从100道尔顿到3000道尔顿之间(大约100da到3000da，大约100da到2500da，大约100da到2000da，大约100da到1750da，大约100da到1500da，大约100da到1250da，大约100da到1000da，大约100da到750da，大约100da到500da，大约200da到1500da，大约500da到1000da，大约300da到1000da，大约100da到250da。)待测化合物可以是天然产物或组合化学库中的成员。采用一组多样分子覆盖多种功能，例如电荷、芳香性、氢键、灵活性、大小、支链的长度、疏水性和硬度等方面的多样性。适用于制备小分子化合物的合成技术为
技术领域：
内所知，就像obrecht和villalgordo所举例的solid-supportedcombinatorialandparallelsvnthesisofsmall-molecular-weightcompoundlibraries，pergamon-elseviersciencelimited(1998)，包括“分裂和组合”或“平行”的合成技术，固相和液相技术，编码技术(参考czarnik，curr。opin。chem。bio。1：60-6(1997))。除此以外，许多小分子的文库都可以在市场上买到。许多合适的小分子检测化合物在美国专利号6,503，713中列出，并全面地以引用的形式合并到文中。用本发明进行筛选的库可以包括许多不同类型的待测化合物。一个库可以包含一系列结构相关或不相关的待测化合物。在某些实施方案中，待测化合物是肽或肽类分子，在某些实施方案中，待测化合物是核酸。在某些实施方案中，待测化合物和化合物库可以通过系统地改变第一个待测化合物的结构而得到，例如，第一个待测化合物结构和目标多肽的已知的天然结合配体的结构相似，或者是第一个小分子具备结合目标多肽的能力，可以使用
技术领域：
已知的或本文描述的技术，也可以将结构和其导致的生物活性联系起来，叫做结构活性相关研究。作为
技术领域：
熟知的一项评估技术，有许多标准的方法可以建立这种结构和活性关系研究。因此，在一些情况下，这项工作需要多大量的实验，其他内源性多肽的三维结构或其中一部分可以作为一个或一些小分子化合物合理设计的起点，例如，在某些实施方案中，用本文描述的方法，筛选一小分子库。在某些实施方案中，待测化合物被应用于检测样本，例如细胞或活组织，并且评估该待测化合物的一个或多个作用。例如在培养或原细胞中，评估待测化合物对调节线粒体呼吸作用的能力。在某些实施方案中，被测样本是或来自于这里描述的疾病的整体模型，例如一种动物模型，啮齿类动物的大鼠或小鼠都可以使用。评估这些效果的方法为本
技术领域：
所知，例如，评估调节蛋白质表达的能力可以在基因或蛋白质水平上，例如使用定量pcr或免疫分析法。在某些实施方案中，高效率的方法，例如蛋白质或基因芯片等在
技术领域：
已知，可以用来检测对线粒体代谢的影响。(可参考文献ch。12，genomics，ingriffithsetal。，eds。moderngeneticanalvsis，1999，w。h。freemanandcompany；ekinsandchu，trendsinbiotechnology，1999，17：217-218；macbeathandschreiber，science2000，289(5485)：1760-1763；simpson，proteinsandproteomics：alaboratorvmanual，coldspringharborlaboratorvpress；2002；hardiman，microarravsmethodsandapplications：nuts&bolts，dnapress，2003)本文所述的已经被筛选和鉴别的调节线粒体呼吸的待测化合物可以作为候选化合物，候选化合物已经在疾病的体内模型中进行筛选，这些疾病与改变的线粒体呼吸和功能有关，如果这些化合物对疾病的一个或多个症状有理想的效果，那么这个候选化合物就可以作为候选的治疗剂。候选治疗剂如果在临床上进行的筛选，就可以作为治疗药物。候选化合物，候选治疗药物和治疗药物可以被选择性的利用和衍生化，并且可以用生理学上可接受的辅料来形成药物组合物。在第一次筛选中选出的(调节线粒体呼吸化合物)的待测化合物可以被选择性或系统性的改变，例如，使用合理的设计去最大可能的利用结合的亲和力，特异性或其他参数。这种利用也可以用这里本文描述的方法来筛选。因此，在一些实例中，发明包括用
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内已知的方法或本文描述的方法来筛选第一个库，找出库中一个或多个“匹配”，对这些“匹配”进行系统的结构选择来形成化合物的第二个库，第二个库中的化合物与“匹配”结构上有关，使用本文描述的方法再筛选第二个库。被称为匹配的化合物被认为是候选治疗药物，对治疗与改变的线粒体呼吸和功能有关的疾病有效。许多技术对测定匹配的结构很有效，这些有效的技术能够使用到本文描述的方法中，例如nmr，质谱，配备电子获气检测器的气相色谱分析，荧光和吸收光谱。因此，本发明也包括用这里描述的方法所发现的作为匹配的化合物，还有一些用来管理治疗，预防，延迟发展和疾病恶化等的方法。被认定为候选治疗药物的被测化合物能够进一步的通过疾病动物模型来筛选，这些疾病与这本文描述的改变了的线粒体呼吸和功能有关。可以检测有疾病的动物的变化，例如疾病参数的提高等，这些参数与临床结果有关。呼吸代谢的调节物本文所描述的组合物和方法包括线粒体代谢的调节剂，在某些实施方案中，这些调节剂是氧化磷酸化的抑制物，在某些实施方案中，这些化合物是糖酵解的抑制物。在某些实施方案中，化合物是一种氯苯甲嗪，或它的一种对映体或一种类似物，或其药学上可接受的盐，例如盐酸氯苯甲嗪，或盐酸s-氯苯甲嗪。在某些实施方案中，化合物是用本文描述的方法发现的氧化磷酸化的另一种抑制剂，例如表1中列出的一些药物。在某些实施方案中，化合物是一种组胺拮抗剂，一种二苯哌嗪，二苯烷(烷氧基)为基础的，或是一种三环环状结构。正如本文描述的，用本发明的方法筛选一个包含3695化合物的库，其中包括两种市场上销售的化合物集合，这些集合包括将近一半的fda批准的药物和其余许多的有生物活性和天然的化合物。这个库被盲法筛选旨在发现哪一结构类型或化学类型可以作为有效细胞保护剂，即抵制线粒体氧化磷酸化。在初步的筛选中，sglu/gal值(这个比值是在葡糖糖中归一化的细胞数目对在半乳糖中归一化的细胞数目的倍数变化的log值)被用作按将细胞代谢依赖性从氧化磷酸化调整到糖酵解的能力区分化合物。在半乳糖中选择性致死或抑制生长的化合物将有一个高的sglu/gal值，很可能包括氧化磷酸化的抑制剂。大约90％的化合物在用药后对在葡糖糖中生长的细胞的存活力和繁值没有显著影响(fcglu的平均值之0.8)。大约有124种化合物表现出高的sglu/gal值(大于等于0.8)，可能选择性抑制在半乳糖中生长的细胞的缘故。这些化合物包括25个被fda批准的药物(见表1)。例如筛选的临床上使用被鉴定出可以选择性的干扰细胞在半乳糖中的生长而被认为是氧化磷酸化抑制剂的药物包括毒灰叶酚，苄索氯铵，抗霉素a，β二氢化鱼藤酮，β毒灰叶酚，，19-羧酸桃柘酮，甲基苄索氯铵，异鱼藤酮，鱼藤素，mundoserone，盐酸小檗碱，明杜隆，壬苯聚醇-9，阿立西定二氢氯化物，地喹氯铵二氯化物，氯非铵甲苯磺酸盐，通佐溴铵，茶痂衣酸，硝呋齐特，甲醚鱼藤酮酸，鱼藤酮酸，恩波维铵，盐酸罂粟碱，副品红噻嘧啶，盐酸乙基罂粟碱，甲萘醌，雷酚内酯，diffraticacid，isogedunin，盐酸苯乙双胍，苏木桐a三甲基乙醚，喷他脒羟乙基磺酸钠，尼洛替星，长春西汀，克罗米芬，白血宁，甲氟奎，硫链丝菌肽，盐酸萘替芳，盐酸氯普硫蒽，氯马斯汀富马酸，丝他康唑，氯化巴马亭，氟苯尼考，哌迷清，地喹氯铵氯化物，脱氧苏木桐b三甲基乙醚，比沙可啶，汞溴红，甲氧檗因，青蒿素，二氢化鱼藤酮，3-deshydroxysappanoltrimethylether，盐酸多佐胺，鱼藤酮，洗必太，氯福克酚，氯化巴马亭，盐酸氯笨甲嗪，钠盐氟伐他汀，抗坏血酸。对以上列出的批准药物中的16种进行了更精细的研究，这16种药物在先前的报道中没有提到其活性对能量代谢的影响。通过对整个库的结构检查和结构活性分析表明通式a代表了一类结构，这类结构的化合物与葡萄糖相比可以选择性地抑制细胞在半乳糖中生长。因此，通式a的这些化合物可以用作治疗用的药物用来保护细胞，通过抑制线粒体oxphos和将细胞能量代谢向糖酵解的调整从而减少氧化损伤、抑制细胞凋亡。通式a至少包括3个亚类。例如，氯苯甲嗪结构上与通式a相似，它是第一个亚类最好的代表。简单来说，从通式a推断出的分子都包括一个亲脂的芳香基团，一个碱性氨基基团(-nr3r4)，连接基团-xcn-，这里的r3和r4是从不同的群体中筛选出来的，包括但不局限于h，c1-6烷基，3-羟基乙烷羟乙烷基(3-hydroxyethoxylethyl)，苯丙烯基(phenylallyl)，c1-4烯代苯基(c1-4-alkylenephenyl)，苯甲基，and3-甲苯甲基，4-terbutylbenzyl。除此以外，-nr3r4一起形成环胺，例如哌啶衍生物(例如咳平)，哌嗪衍生物(硫乙哌丙嗪)。那个连接基团用-x(ch2)n-表示，n值是从1到3的整数，x在亚类iii中没有，在亚类i中可以是n或o，在亚类ii中可以是ch。亚类i的亲脂基团包括两个芳香族苯环通过-ch-连接形成二苯甲基衍生物(y是个ch)，然而在亚类ii中，两个苯环通过一个链烯基(yx是c＝c))和一个s原子(w是s)或乙烯基(w是-ch2-ch2-)连接形成一个三环基团，在亚类iii中，亲脂基团噻嗪(y是-n-)和x是没有的。对亚类i进行结构和活性的关系分析显示二苯甲基的苯环被卤族元素在对位取代，例如氯或氧，这样会导致更有效的化合物，见表26。二苯甲基基团连接到氮原子上(x＝n)，与-nr3r4的氮原子组成的两个氮原子通过r3环化，形成了哌嗪或者高哌嗪衍生物，这里的r3是一种c2-3烯属烃。二苯甲基哌嗪衍生物(也叫做氯环嗪)比高哌嗪类似物的抑制性更强。虽然了解发明的机制不是必要的，但是普遍认为亲脂性胺基比亲水性胺基团更有活性，例如羟嗪和西替立嗪。当r1不等于r2时二苯甲基的亚甲基碳可以形成手性中心。结果，化合物可以是外消旋混合物，或者是有r或者s构造的对映体。对于亚族ii，三环衍生物对生长在半乳糖的细胞表现出中等的抑制活性，三环衍生物包括一个在中环(例如去甲替林或阿米替林)的乙烯(w是-ch2ch2-)，当w是s原子的时候，活性可以提高，这样就产生了一个噻吨衍生物(例如氯普硫蒽)，见表27a。另外，将芳香环取代成c1也是可以的。第亚类ii1主要是吩噻嗪衍生物，在这里连接基团cn可以是直链或有支链的亚烃基，连接基团大约有2到3个碳原子(n＝2-3)，含有乙硫取代基的硫乙哌丙嗪比氟奋乃静的活力更强，氟奋乃静与吩噻嗪核心同样的位置含有三氟甲基取代基，见表27b。其余的用本发明所描述的方法确定的其它抗组胺类药物，至少有一些可以被亚类i，ii，ii1所代表，但是不局限于这些。在某些实施方案中，以抗组胺类药物为基础结构的一组化合物包括在表28中列出的一些，但不只局限于这些。二苯甲胺基结构物在某些实施方案中，本发明考量了一种包含二苯甲胺基结构物的组合物。在某些实施方案中，二苯甲胺基结构包括亚结构a1(双苯哌嗪)或a2例如图29所示的化合物。在某些实施方案中，基于双苯哌嗪结构的化合物包括氯苯甲嗪。在某些实施方案中，双苯氟嗪基结构物包括一种包含但不限于罗列在图29的化合物。二苯基烷基结构物在某些实施方案中，本发明提供了包含一种基于二苯基烷基结构的化合物的组合物。在某些实施方案中，二苯基烷基结构物包括哌咪清。在某些实施方案中，二苯基烷基结构物包括一种包含但不限于罗列在图30的化合物。二苯基烷氧基结构物在某些实施方案中，本发明考虑了一种包括二苯基烷氧基结构物的组合物。在某些实施方案中，二苯基烷氧基结构物包括咳平。在某些实施方案中，二苯基烷氧基结构物包括一种包含但不限于罗列在图31的化合物。基于三环核的结构物在某些实施方案中，本发明提供了一种包括基于三环核结构化合物的组合物。在某些实施方案中，基于三环核的结构化合物包括亚结构e1或e2，如图32所示的化合物1或2。在某些实施方案中，基于三环核的结构包括亚结构f1或f2，如图32所示的化合物3-5在某些实施方案中，基于三环核的结构包括亚结构g1。在某些实施方案中，基于三环核的结构包括亚结构g2，如图32所示的化合物7-10。在某些实施方案中，基于三环核的结构物包括硫乙哌丙嗪。在某些实施方案中，基于三环核的结构物包括一种包括但不限于罗列于图32的化合物。氯苯甲嗪氯苯甲嗪几十年来已适用于人们的恶心和晕眩，耐受性好，伴有催眠的首要副作用。foodanddrugadministration，federalregister52：15866(1987)；andf.p.p.jerroldb.leikin，poisoningandtoxicologyhandbook(informahealthcare，2008)，pp.1331.盐酸氯苯甲嗪目前以以下商品名出售：dramaminelessand(sweden).展示于此的数据证明即使低微摩尔浓度的氯苯甲嗪也可引起显著的能量代谢转换，而且作为神经保护剂可以抵制多聚谷氨酰胺毒性并且在细胞和动物模型的心脏病/心脏缺血性损伤、中风、肾脏缺血性损伤和糖尿病中有细胞保护作用。而且，展示于此的数据也证明了氯苯甲嗪的s-对映异构体(“s-氯苯甲嗪”)并不是用高亲和力与h1受体结合从而并不会有嗜睡和/或镇静的副作用。1.氧化伤害人的sh-sy5y成神经瘤细胞以前用于筛选能够抵制氧化损伤的药物，见sarang，physiol.genomics，11：45-52，2002.氧化损伤在很多神经退行性疾病中是一个病理学因素。sarang鉴定了26种药物作为神经保护剂；其中，6种已经过详细检验，包括氯苯甲嗪。sarang文献所提供的基因组剖析数据表明氯苯甲嗪的氧化保护效应可能是由于对神经肽甘丙肽(galanin)的向上调节。引用文献中不教授比较葡萄糖和半乳糖介质间的细胞生长以鉴定氧化磷酸化作用的无毒性抑制剂(也就是，sglu/gal在0-1.00之间的化合物)作为神经保护剂。一种基于细胞的筛选试验用于筛选能够抵制糖尿病性神经疾病中氧化压力的药物化合物已经报道于vincentetal.，antioxidants&redoxsignaling，10(2)：387-393，2008.1040种所筛选的化合物中的25种可减少线粒体过氧化物和随后的神经元损伤。由vincent等人提供的一潜在的神经保护化合物清单包括盐酸氯苯甲嗪。vincent等人没有教授比较葡萄糖相对于半乳糖介质的细胞生长以鉴定氧化磷酸化或糖酵解的无毒性抑制剂。2、线粒体毒性一种基于细胞的筛选试验用于筛选用于线粒体毒性药物已报道于marroquinetal.，tox.sciences，97(2)：539-547，(2007)。文献比较了生长于葡萄糖相对于半乳糖之间的细胞。结果显示生长于半乳糖里的细胞比生长于乳糖里的细胞对于氧化磷酸化抑制剂的毒效更敏感(较低的ld50)。因此，使用葡萄糖相对于半乳糖的培养基区分线粒体功能障碍并提供了一种综合的毒性筛查。文献没有教导葡萄糖/半乳糖细胞生长比率的计算来鉴定氧化磷酸化或糖酵解的无毒性抑制剂。氯苯甲嗪的对映异构物这里描述的方法可以包括使用光学上纯化的氯苯甲嗪例如s-氯苯甲嗪。如在此描述的，s-氯苯甲嗪保持了外消旋物中转换线粒体代谢的能力，但缺少结合h1受体的能力，因此基本上缺少与组胺系统激活相关的副作用。因此s-氯苯甲嗪或其药学上可接受的盐，比如盐酸氯苯甲嗪可用于描述于此的方法中。s-氯苯甲嗪可用该
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内已知的方法获得。以下是一个典型的合成相当纯的s-氯苯甲嗪的方案。方案1氯苯甲嗪的(r)和(s)对映异构物如方案1所示合成。外消旋4-氯二苯甲胺盐酸盐可用d-酒石酸或l-酒石酸处理。所得到的盐通过水重结晶以提供＞98％纯度的对映异构物。然后分离的对映异构物分别用bisalkylating试剂6处理以提供3的哌嗪环。甲苯磺酰基组在hbr-醋酸中用对羟基苯甲酸脱保护以提供游离的胺。在回流甲醇中用3-溴化甲苄基处理游离的胺提供光学上纯的(r)和(s)-氯苯甲嗪。其他方法也可使用；例如可以分解氯苯甲嗪自身消旋酸盐为其对映异构体而不是分解上图中的化合物1，例如通过一种手性酸如酒石酸进行分解。除了酒石酸，还可用一种不同的手性酸(如乳酸或樟脑磺酸)。此外，可对手性二苯甲基乙醇(看起来与化合物1相似但oh代替了nh2)进行处理，把他转化成甲磺酸盐，然后与哌嗪反应而获得化合物4。smilkstein(u.s.pat.app.pub.no.us200810194652a1)(以引用的方式并入本文中)描述了使用惰性异构体组合物作为耐药逆转剂的方法和在预防性治疗中包括挑选所预选抗组胺剂的一种抗组胺惰性异构体的步骤，并且立体选择性利用抗组胺惰性异构体来预防和治疗疟疾的方法。该报告显示大多数抗组胺剂的抗组胺和镇静活性是由相同的对映异构体造成的。包括此类药物如氯苯那敏(例如(+)异构体)。但是，该报告确定了(-)氯苯那敏异构体能提高对抗疟药物的耐药性。文献确定了氯苯甲嗪作为一种立体异构的抗组胺剂但是不能鉴别抗组胺剂的惰性对映异构体。因此，他没有给该领域内掌握通常技术的人员提示氯苯甲嗪有至少两种包含有差别的生物活性的对映异构体。其他类型的药物的报道显示抗疟药诸如三环类抗抑郁药和吩噻嗪类抗精神病药在体外的抗药性。然而，没有显示这些额外的药物类型在对映异构体活性的任何种差的数据得到探讨。因此，所公开的明确提出抗组胺药的对映异构体的特异性作用对氯苯那敏是有成效的。我们认为本领域内掌握通常技术的人员(比如药物化学家)不会认为单一的抗组胺剂对映异构体缺少抗组胺活性(如非氯苯甲嗪类)而提示所有的r和s对映异构体均表现不同。在化学领域里就是这样的，这种通则是不可预测的而需依靠实验数据(就是如这里所提供的)。此外，在本发明之前，还没有关于分析氯苯甲嗪的r或s对映异构体活性的报道。因此，先验性并不显而易见，即使各自对映异构体确实存在不同的活性，但是哪种是r或s和/或者哪种是活性的或惰性的。两种对映异构体能改变能量代谢以及抵制缺血性或者退化性疾病并不显而易见；正如这里所提到的，两种对映异构体在代谢试验中都有活性，但只有一种(r对映异构体)是由抗组胺活性。进一步相信一种对映异构体在寄生虫病(如疟疾)中的效力并不能提示在其它疾病包括但不限于神经退化性疾病，缺血性疾病和2型糖尿病中的效力。氯苯甲嗪由于其良好的安全性能、高血脑屏障穿透力和结构特点而作为一种优先的化合物被选择使用到一些描述于此的方法和组合物中。试剂盒在某些实施方案中，本发明考虑了试剂盒用于本研究方法的实验。该试剂盒包括了一个或多个包含用于本发明的筛选方法的候选化合物试剂的容器。试剂盒可选择性的包括含有细胞培养基质的固体基片。试剂盒可选择性包括一个或多个包含多种碳源的容器。试剂盒可选择性包括一个细胞培养。该试剂盒可选择性包括一套解释怎样鉴定候选化合物作为一种线粒体能量代谢的无毒调节器的说明书。试剂盒可选择性包括包含多个测试孔的固体基片。试剂盒可选择性被冰冻。试剂盒可选择性包括作为碳源的糖(比如葡萄糖或半乳糖)。试剂盒可选择性包括一套提供比较第一个碳源与第二个碳源的细胞生长速率测定的说明书。试剂盒也可选择性包括适当的系统(比如不透光容器)或者稳定剂(例如抗氧化剂)以防止光或其他不利条件造成的试剂降解。虽然指导材料典型地包括书面或印刷材料，但他们不仅限于此。本发明考虑了若干能够储存说明和传递他们给最终使用者的媒介。这些媒介包括但不限于电子存储媒介(例如磁盘，录音盘，暗盒，晶片)，光学媒体(例如cdrom)，以及诸如此类。这些媒体可包括提供这些指导材料的因特网站地址。药物配方本发明进一步提供了药用组合物(例如包括小分子或上面描述的反义药物)。本发明的药用组合物可按多种途径给药，取决于是否需要局部或全身治疗和需治疗的部位。给药可以是局部的(包括眼睛和包括阴道和直肠粘膜)，经肺的(例如通过吸入或吹入散剂或者气雾剂，包括通过喷雾器；气管内的，鼻内的，外表皮和皮肤给药)，口服的或者注射的。注射给药包括静脉内的，动脉的，皮下的，腹膜内的或者肌肉内的注射或者输液；或者颅内的，比如鞘内或心室内的注射。局部摄入的药用组合物和配方可包括皮肤药贴，药膏，洗液，乳清剂，胶凝剂，滴剂，栓剂，喷雾剂，液体和散剂。常规的药用载体，流体，粉末或油基质，增稠剂和之类的东西可能使必要的或合适的。口服的组合物和配方包括散剂和颗粒剂，混悬剂或溶液剂或非水介质，胶囊，香袋或药片。增稠剂，芳香剂，稀释剂，乳化剂，分散助剂或粘结剂可能是需要的。鞘内或心室内注射用的组合物和配方可包括灭菌的水溶液也包含缓冲剂，稀释剂和其它合适的添加剂比如但不局限于，渗透促进剂、载体化合物、和其它药用可接受载体或赋形剂。本发明的药用组合物包括但不局限于，溶液剂，乳剂，和脂质体包含剂型。这些组合物可用各种各样的组分制成包括但不限于，预制液体，自乳化固体和自乳化半固体。以方便呈现的单位剂型的本发明的药用组合物，可根据制药业内众所周知的常规技术制备。这中技术包括将活性成分和药用载体或赋形剂相结合的步骤。一般来说，将活性成分和液体载体或磨碎的固体载体或两者均匀地、紧密地结合以制备药用组合物配方，然后如果必要的话将产品塑型。本发明的组合物可以制成任何一种可能的剂型比如但不局限于药片、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可制成在含水，无水的或混合媒介中的悬浮液。水性悬液可进一步含有增加悬浮液粘性的物质包括，比如羧甲基纤维素钠，山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可包含稳定剂。在本发明的某些实施方案中，药用组合物可制成泡沫剂来使用。药用泡沫剂包括剂型比如但不限于，乳剂，微乳剂，乳清剂，凝胶剂和微脂囊。虽然本质上是基本一样的但这些剂型在成分和终产品的一致性是有差异的。提高细胞水平摄入的药剂也可根据情况添加到这里描述的一些药用的和其他组合物中。例如，阳离子脂质。比如脂质体(u.s.pat.no.5,705,188)，阳离子甘油衍生物，和聚阳离子分子，比如聚赖氨酸(wo97/30731)，提高细胞摄取。本发明的组合物此外还可包含其他在药用组合物中常见的药用辅料。因此，举例来说，组合物可包含额外的，兼容的，药用活性材料比如，止痒剂，收敛剂，局部麻醉剂，抗发炎剂，或者可包含本发明组合物在制定的各种各样的剂型中有用的附料，比如食品色素，芳香剂，防腐剂，抗氧化剂，乳白剂，增稠剂和稳定剂。但是，这样的辅料当添加进去时不能过度影响本发明组合物成分的生物活性。配方可以灭菌消毒并且若需要的话可与药用辅料混合，例如，润滑剂，防腐剂，稳定剂，湿润剂，乳化剂，影响渗透压的盐分，缓冲剂，着色剂，调味剂和/或芳香物以及诸如此类对配方的活性剂没有有害影响的。举个例子来说，这里描述的方法和组合物可包括一种乙酰化或未乙酰化水杨酸盐，例如，乙酰水杨酸或双水杨酸酯。例如，在摄入一日量氯苯甲嗪的实施方案中，日剂量为81mg的乙酰水杨酸也可以摄入。因此组合物可以制成一剂氯苯甲嗪，例如，在单一剂型中含有s-氯苯甲嗪加上辅料如乙酰水杨酸。例如口服剂型如药丸或药片。剂量可取决于需治疗疾病状态的严重性和反应性，伴随持续几天到几个月的疗程，或者直到治疗生效或者达到疾病状态的缓解。最佳的给药方案可根据患者身体内药物累积的测定值计算。医生可确定最佳剂量，用量方法和重复率。最佳的剂量可能根据个体聚核苷酸的相对效力而变化，而且通常可以基于ec50s找到对体内和体外动物模型有效或者基于这里描述的例子估算出。在某些实施方案中，剂量可以每天从约250到1000mg，也可给予每天、每周、每月或每年一次或多次。执行医生可基于测量体液或组织中药物的滞留时间和浓度而估算剂量的重复率；在某些实施方案中，剂量要足够以使在患者血浆中的浓度达到100nm-1μm。让患者经受维持疗法以避免疾病状态的复发也是适合的，其中氯苯甲嗪以维持剂量摄入，范围从每公斤体重0.01μg到100μg，每天一次或多次到每20年一次。实施例下面的实施例是对本发明的进一步说明，但这并不限制本发明权利要求中所述的权利要求范围。实施例1细胞生长实验本实施例描述了利用能够筛选出氧化磷酸化(oxphos)通路抑制剂的生长实验方法。该实验包括在葡萄糖(这使得细胞能够利用糖酵解)或半乳糖(半乳糖将细胞能量生产从糖酵解转变成oxphos通路)中生长的细胞中的细胞生长的监测和测试。为了确定选择性oxphos通路调节剂，对一个小分子库内化合物进行了筛选，筛选出能够选择性地影响半乳糖中的细胞数量，但不影响葡萄糖中细胞数量的化合物和/或试剂。在一些实施例中，使用半乳糖和葡萄糖中不同的生长/细胞生存作为一种筛选方法来确定能够抑制oxphos通路的小分子。为了证明这一原则，本发明的发明人至少成功地筛选了3695种临床使用的药物和生物活性物质，并确定了其中一些作为oxphos抑制剂，对这些物质来说，这是它们迄今未知的用途。在这些实验中，永生化的包含plko.l载体的mch58人二倍体成纤维细胞在37℃和5％co2的环境下的含有10％胎牛血清(fbs)(sigma公司，目录号：f6178)，1x青霉素，链霉素和谷氨酰胺(invitrogen公司目录号：10378-016)，2ul/ml嘌呤霉素和50ug/ml尿苷的dmem高糖培养基(invitrogen公司，目录号：11995)中培养。根据需要在高糖培养基中加入10mm的葡萄糖或10mm的半乳糖。所有培养基均含有1mm的丙酮酸盐和4mm的谷氨酸。表达为野生型(sthdhq7/7)或突变型(sthdhq111/111)的小鼠的纹状体细胞在37℃和5％co2的环境下的含有10％fbs(sigma公司，目录号：12306c)和1×青霉素，链霉素，谷氨酰胺和200ugg418的的dmem高糖培养基中培养(1)。mch58成纤维细胞，hela细胞和293细胞在37℃和5％co2环境下的含有10％fbs(sigma公司，目录号：f6178)dmem高糖培养基中培养。细胞的耗氧量和细胞外酸化实验按如下操作进行。简而言之，将mch58成纤维细胞以30000细胞/孔的密度接种在xf24孔细胞微孔板(seahorse生命科学)中的10mm葡萄糖或10mm的半乳糖培养基中，并在37℃/5％co2环境下孵育～20小时。测定之前，生长培养基中加入～925ul的监测培养基。检测培养基由dmem碱性培养基(sigma公司，目录号：d5030)，2mmglutamax-l(gibco，目录号：350350-061)，1mm丙酮酸钠(sigma公司，目录号：s8636)，10mm葡萄糖(sigma公司，目录号：g8270)或半乳糖(sigma公司，目录号：g5388)，(1.85g/l)氯化钠和(15mg/l)苯酚磺酞。用1n的氢氧化钠溶液将检测培养基的ph值调节为7.4。测定前，将细胞在检测培养基中在37℃下培养60min。通过将hela以40,000/孔和sthdhq7/7以6000/孔的密度将hela，293，和sthdhq7/7小鼠纹状体细胞接种在xf24板中，在它们的常规条件下培养进行ocr和ecar的测定。除了使用25mm的葡萄糖作为糖外，检测培养基与上面所述相同。mch成纤维细胞在混合2分钟和等待2分钟后每隔7分钟同时进行测量，而hela，293，和sthdhq7/7小鼠纹状体细胞每隔6分钟(混合2分钟和等待2分钟)。在加入寡霉素(biochemika，75352)，抗霉素(sigma公司，a8674)，鱼藤酮(sigma公司，r8875)，羰基氰化3-氯苯(sigma公司，c2759)和meclizine盐酸盐(msdiscovery，01500376)记录三个基线测量数据。在dmso中配制50mm的meclizine原液，然后在检测培养基中将其稀释至指定的浓度并用氢氧化钠溶液调整其ph值至7.4。小鼠纹状体细胞在33℃进行测量，而所有其他的细胞种类则在37℃进行测量。细胞数定量高通量实验按如下条件进行。采用机器人多点结合分配器(thermofisher科学公司)将分散在dmem高葡萄糖培养基中的mch58成纤维细胞以5000/孔的密度和每孔100ul的量，接种到96孔板(perkinelmer，6005182)中。结果证明，变异系数＜10％(数据未给出)。24小时后，用pbs将细胞清洗两次并用含有10mm葡萄糖或10mm半乳糖的培养基置换培养基。采用cybi-well机器人(cybio)，将每一种化合物约100ul通过针转移，以一式两份的形式转移到带有钢针阵列的板上。此前已对3695药物的化合物集合进行了描述(wagner等人，natbiotechnol26：343(2008))并包含了两个市售库(spectrumandprestwick)。将化合物处理后的板在37℃下孵育72小时。然后用pbs清洗细胞，用10um的hoechst33342(invitrogen公司)染色并在3.7％的甲醛溶液中固定15分钟。然后对板孔清洗一次并保存在pbs中。将细胞培养板保存在4℃下直至成像，此时是固定后接近24小时。采用arrayscanvti自动显微镜，用自动化板堆垛器(thermofisher科学)进行成像。使用适当的过滤器套件进行hoescht荧光信号检测。每张图像在1.3mmx1.3mm的视野中获得4个放大5倍的非重叠图像。用arrayscan软件对板堆垛器和包含一个自动对焦算法的显微镜进行完全控制。捕获图像并同时储存在至少两个不同的地方。采用免费提供的开放源代码软件包cellprofiler进行图像分析。carpenter等，genomebiol7：r100(2006)。通过hoescht染色信号先确定细胞核的方式进行图像分析。记录每个视野中的细胞核数量，并将每个孔的4个图像加起来作为每孔的细胞计数。采用unix计算机集群进行计算。通过对每个批次开始时和和运行过程中的间歇进行视觉监控确保每个细胞核有适当的遮蔽。作为对照，在生长于富葡萄糖培养基(即，葡萄糖是唯一的糖源)和富半乳糖的培养基(即，此处半乳糖是唯一的糖源)的mch58成纤维细胞中对电子传递链的典型抑制剂(例如，复合物i抑制剂鱼藤酮，复合物iii抑制剂抗霉素，复合物v抑制剂寡酶素，解偶联羧基氰化物m-chlorophenyehyhydra(cccp))进行了测试。正如所料，这些典型的代谢抑制剂在所有测试浓度下都是有毒的，但对生长在富半乳糖的培养基中更毒性强。例如，与富葡萄糖培养基相比，富半乳糖中鱼藤酮，抗霉素，寡的ld50至少低4个数量级。值得注意的是，与富半乳糖培养基相比，富葡萄糖培养基中cccpld50之间的差异更微妙，最有可能的是因为线粒体膜电位对细胞的生存是很重要的。此前，已经有人利用富葡萄糖培养基和富半乳糖培养基之间的分化生长来诊断人类mictochondrial障碍以及线粒体毒性。robinson等人，biochemmedmetabbiol.48：122(1992)；和marroquin等人，toxicolsci97：539(2007)。在一项筛选前的开发研究中，通过比较各种已报道的oxphos中毒情况证实了成纤维细胞对“代谢状态依赖性杀伤力”的敏感性。见图1e-1h。因为生长和存活是在一个为期三天的时间段内进行测量的，所公开的检测非常敏感，能够识别具有潜在微妙的或新颖的作用机制的化合物。此处所描述小分子筛选方法，即基于代谢状态依赖性死亡的方法，可以通过定量具有高稳定性的细胞数量的基于高通量方法的显微镜，如通过成像细胞核计数测量接种细胞的数量之间的相关性，进行缩放。见图2a。在葡萄糖和半乳糖中用这一高通量的检测方法测定了经dmso处理后的细胞的典型细胞生长情况。见图2b。接下来，通过筛选包含了3695种化合物的化学库，生成数据来评估生长在富葡萄糖培养基或富半乳糖培养基中的一式两份的人类成纤维细胞的“代谢状态依赖性敏感性”。见图2c。在一些实施例中，化学库包括两个市售复合物集合，其中包括了约一半fda批准的药物和其他生物活性和天然产物。在第0天接种成纤维细胞并在标准培养基中培养24小时。在第1天，将培养基更换为含有葡萄糖(如复制样品1)或半乳糖(如复制样品2)的培养基作为唯一的糖源，然后以约为10um的浓度加入需要筛选的化合物。在用需筛选的化合物培养72小时后，对板孔进行成像，相对dmso对照孔测定并标准化细胞计数。用calceinacetoxymethyl(am)酯检测(invitrogen，c34852)对细胞活力进行检测。将分散在dmem高葡萄糖培养基中的mch58细胞以5000细胞/孔的密度接种到96孔板中。20小时后，用pbs清洗细胞，并替换为用含有不同浓度药物或dmso(0.1％)的10mm的葡萄糖或10mm的半乳糖。然后细胞培养72小时，之后用pbs清洗并加入5um的calceinam。在37℃培养30分钟后，在dtx880模探测器(beckmancoulter公司)中分别在激发和发射波长(ex/em)485nm和530nm处的测量荧光强度。采用celltiter-glo发光生存活力实验(promega，g7571)测量总的细胞atp水平。mch58以5000细胞/孔的密度和小鼠纹状体细胞以20,000细胞/孔的密度接种到96孔板中生长。24小时后加入meclizine，72小时后测量mch58细胞的atp水平，而按照制造商的说明，24小时后测量纹状体细胞的atp水平。除非另有说明，在atp测量前，突变异种(sthdhq111/111)纹状体细胞在无血清培养基中生长24小时。在dtx880多模式模检测器中测量发光。测试了不同浓度(介于100um和0.5um之间)的鱼藤酮，抗霉素，寡霉素，meclizine，羟嗪(spectrumchemical)，硫乙哌丙嗪(prcstwick)，赛庚啶(sigma公司)，甲氧苄二胺(spectrumchemical)，tripelcnnamine(spectrumchemical)，苯海拉明(spectrumchemical)，氯马斯汀(prestwick)，bromopheniramine(spectrumchemical)，pheniramine(spectrumchemical)，异丙嗪(msdiscovery01500510)，阿托品(sigma公司)，和东莨菪碱(sigma公司)对无血清的培养基中sthdhq111/111细胞起保护作用。给出了赋予最大程度保护的剂量。在dtx880多模式检测器中测量发光强度。通过用16个dmso处理的孔内修饰后的平均细胞计数(去除最大和最小值之后的平均值)除以每个孔内的细胞计数对每个96孔板的标准化细胞计数进行单独计算。丢弃所有孔内细胞计数非常低的单个96孔板。去除不能重复的样品，其要求是重复样品之间标准化细胞计数比小于1.5，按这一要求就排除了49个孔。对剩余的重复测量进行平均，并倍数变化计算为葡萄糖和半乳糖筛选的平均标准化计数。为了评价统计学意义，计算了每个孔相对于dmso(空白)分布的z得分和整个复制样品的平均z得分。认为平均z得分大于2.5的孔具有显著的统计学意义。通过联合分析葡萄糖和半乳糖的结果，可以计算代表富葡萄糖培养基中细胞生长log10(变化倍数)除以富半乳糖培养基中log10(变化倍数)的葡萄糖-半乳糖细胞生长比率(sglu/gal)。因此，每个筛选药物可以用其对细胞数量的选择性影响来描述，通过将在富葡萄糖培养基中的生长与富半乳糖培养基比较生长。正如所料，在富葡萄糖培养基和富半乳糖培养基中的dmso生长数据相等，因此sglu/gal得分以0(即～0.0)为中心。此外，大部分的筛选的化合物对细胞数量没有影响，相对dmso而言，有些化合物会造成细胞死亡，且没有哪种化合物会增加细胞数量(数据未在这里显示)。选择性致死或在富半乳糖培养基中抑制生长的药物应该有相对较高的sglu/gla得分(例如，介于约0.1-0.9之间不等)，并可能包括oxphos抑制化合物。低sglu/gla得分(例如，介于约(-)0.1-(-)0.7)可能是由于抑制糖酵解或抑制增殖引起的，因为生长在富葡萄糖培养基中的细胞分裂更加迅速。见图2b。在一些实施例中，高sglu/gla(即在富半乳糖培养基中选择性地杀死细胞)的化合物可能是氧化代谢抑制剂。低sglu/gla化合物是那些抑制富葡萄糖条件下迅速增殖的化合物；这些化合物用作抗癌药物可能是有用的；它们可能是迅速分裂细胞的强有力杀手。根据sglu/gal对筛选的化合物进行排名。尽管没有必要去理解一项发明的机理，但我们认为，具有高sglu/gal的化合可能会通过包括但不限于以下的方式抑制oxphos：在特定的复合物上阻止电子传输，解偶联呼吸，并可能改变oxphos亚基的基因表达。正如所预期的，sglu/gal的分布是以0为中心的，其中大部分化合物不论是在富葡萄糖培养基还是在富半乳糖培养基中均表现出具有相近的标准化生长和生存活力。见图2d。尽管如此，数据显示，在sglu/gla分布的上尾部富集了已知的呼吸链毒药(例如，oxphos抑制剂)。见表1。例如，抑制前25名的化合物包括了20种此前报道的会通过直接从atp合成中中断或解偶联电子转移而扰乱呼吸。表1：25种sglu/gal(log10(变化倍数))得分最高的化合物此外，sglu/gla分布的下尾部富集了已知的抗肿瘤化合物(例如，已知的能杀死迅速分裂细胞的药物)。见图2d。例如，50种sglu/gal得分最低的化合物中有26种对应于已知的对富葡萄糖培养基中快速增殖的细胞具有选择性毒性化疗药物。见表2。表2：排名末尾50种sglu/gal(log10(变化倍数))得分最低的化合物在83种sglu/gal得分最高的化合物中(83；分布的前2％)，确定有25种试剂获得了临床应用fda批准。参见表3。观察到这些化合物显示比在验证研究中所使用的5种经典oxphos抑制剂更低的sglu/gal(supra)。表3临床使用的25种高sglu/gal(log10(差异系数))得分化合物此前已经报道，这25种化合物中有九种(即，罂粟碱，降糖灵，青蒿素，喷他脒，克罗米酚，匹莫齐特，氯硝柳胺，氟伐他汀和carvedilol)抑制了或偶合了线粒体呼吸。有趣的是，这个清单中包括了两个抗疟疾药物(如青蒿素或甲氟喹)，符合青蒿素活性需要寄生虫内的呼吸的报道。golenser等人.，intjparasitol36：1427(2006)。其余16种临床使用的药物涵盖了一系列的临床适应症和各种作用机制。这些药物可能有助于治疗与能量代谢调制相关的疾病。实施例2：美克洛嗪(meclizine)活性的评价为了研究表3所列出的筛选出的候选药物对神经退行性疾病的潜在治疗效果，要求该试剂具有良好的治疗指数和跨过血脑屏障的能力。选择meclizine(排名第66)作为一种代表性试验药物。meclizine在人体表现出较好的毒性表现并用作止吐药和抗眩晕剂。此外，meclizine是otc药品，被认为具有良好的中枢神经系统渗透性。美国食品和药物管理局，federalregister52：15866(1987)；且在canadagazellevol.134(2000)中有描述。验证meclizine作为一种潜在治疗药物的第一步是通过使用两种不同的分析评估细胞生长和细胞活力来确认初筛结果。在初步筛选中，发现meclizine能在为期三天的时间内呈剂量依赖性的方式延缓成纤维细胞的生长。比如，观察到生长在富半乳糖中的mch58成纤维细胞比生长在富葡萄糖培养基中的mch58成纤维细胞对meclizine治疗更敏感(即，表现出细胞生存活力下降)。例如，确认ld50值至少有2倍的差异，但这仍然低于所观察到的经典oxphos抑制剂的ld50值。此外，相对于生长在葡萄糖富集的培养基中，生长在富半乳糖培养基中的细胞的atp水平也对meclizine更为敏感。见图3a，3b和3j。全细胞生物能量动力学分析证实，meclizine会改变细胞对oxphos和糖酵解的相对依赖性，例如，meclizine减少了氧气消耗率。见图3c和6a。这在从大鼠的心脏分离的原代心肌细胞(图3k)和从小鼠胚胎分离的原代皮层神经元(图3l)中得到证实。将心肌细胞暴露在所示浓度的meclizine中保持20分钟，然后在呼吸室中进行氧气测量。耗氧率(ocr)测量是给从e14-15天胚胎获得的小鼠原代皮质神经元在0时刻加入meclizine(5和10μm)或抗霉素(1μm)后进行的。此外，meclizine以剂量依赖性的方式增加了乳酸产生，需要几个小时才能出现。参见图3d和图6b。用meclizine处理的细胞随着时间的推迟会在它们的培养基累积乳酸，与对醣酵解的依赖性的增加相符。在其他细胞类型包括人表皮成纤维细胞，小鼠纹状体细胞，人胚肾细胞，hela细胞中也观察到了这些由meclizine诱导产生的耗氧量的减小和细胞外酸化率的随之增加。见图7a，图7b和图8a-f。meclizine被列为一种组胺受体拮抗剂(h1)和弱胆碱受体拮抗剂。brunton和parker，goodmanandgilman′sthepharmacologicalbasisoftherapeutics.麦格劳-希尔公司，第11版，第1889页(2006)。然而，所筛选的其他64种注明的h1受体拮抗剂和33种注明的抗毒蕈碱拮抗剂并没有表现出升高的sglu/gla分值(胆碱能阻滞药：mann-whitneyrank总和p＝0.26；anti-h1s：mann-whitneyrank总和p＝0.77)。这些结果表明，meclizine可能通过一种不同于胆碱或组胺受体阻断的机制影响细胞能量代谢。相对于标准的oxphos抑制剂，meclizine的氧气消耗抑制发生在较慢的时间尺度范围内。见图9。事实上，向分离的线粒体加入meclizine对线粒体的氧消耗没有影响。见图3e-3g。这些观察结果表明，meclizine可能有一种新的作用机制。进行了其他的实验以确定是否存在分离的线粒体制备中存在meclizine的氧化磷酸化抑制作用。例如，在线粒体呼吸状态转换的过程中按如下操作进行了线粒体膜电位和氧化还原电位的测定。用差速离心法从c57bl/6小鼠肾脏分离得到线粒体并悬浮分散到实验缓冲液中，终浓度为0.15mg/ml。mootha等，amjphysiol272：h769(1997)。通过加入2.5mm的谷氨酸钠和2.5mm的苹果酸启动状态2呼吸。通过加入50nm的adp启动状态3呼吸。通过加入5um的cccp(sigma公司，目录号：c2759)启动解偶联呼吸。用由oceanoptics生产的光纤氧传感器探头监测氧气消耗，用perkin-elmerls50b荧光计测量nadh(内源性，370±7nm激发，440±4nm发光)和膜电位(1.25umtmrm，546±7nm激发，590±4nm发光)。6个独立的实验显示存在典型的痕量。用无菌水配制1m的磷酸乙醇胺原液(sigma公司，p0503)并用1n的氢氧化钾溶液将ph调节到7.4。在有或没有meclizine的存在下结果大致相同。表明它不是电子传递链或氧化磷酸化的直接抑制剂。见图3e-3i。此外，如图3m-n所示，meclizine不会改变线粒体dna拷贝数或线粒体mrna的表达。将hela细胞暴露到50μmmeclizine(mec)6小时或暴露到50ng/ml的溴乙锭(etbr)3天，然后进行总基因组dna提取。采用taqman法实时定量pcr检测一细胞核基因和一线粒体基因以测定线粒体dna拷贝数。从50ummeclizine处理过6小时的hela细胞中提取总的rna。用相对特定基因的taqman法实时定量pcr测定线粒体dna编码的转录产物。这些数据表明meclizine自身不会直接抑制oxphos机器。这些数据与所观察到的meclizine对整个细胞内氧消耗的慢动力学(即超过几个小时)的影响是一致。见图3c。上述研究表明，在所有试验的细胞类型中，meclizine能将细胞能量代谢从氧化磷酸化(oxphos)向糖酵解转换。以前我们都不知道meclizine的这一作用。此外，meclizine将细胞从oxphos转移到糖酵解的能力是其能够在培养的神经元缺氧缺葡萄糖状况下赋予细胞保护作用，在huntington疾病细胞模型中抵制聚谷氨酸毒性，以及防止出现缺血损伤的主要原因。实施例3：s-meclizine影响细胞能量代谢市售的meclizine是一种消旋混合物，其中包括r-meclizine和s-meclizine。因此，制备了meclizine旋光对映体并对它们各自减少细胞氧消耗率和/或立体选择性进行了评价。首先，如schemei所示，使用下列方法合成了以上两种旋光对映体。步骤i(r)和(s)-4-氯苄胺用d-酒石酸处理消旋4-氯苄胺(4-chlorobenzbydrylamine)，然后在水中重结晶10次(如clemo等，j.chem.soc，(1939)，1958-1960所描述的方法)得到高光学纯度的(s)-4氯苄胺(根据手性高效液相色谱结果，＞98％)。用类似的方法，用l-酒石酸处理外消旋的4-氯苄胺得到了高纯度的(r)-4-氯苄胺(根据手性高效液相色谱结果，ee：＞98％)。步骤2：(r)和(s)1-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪按照opalka等人，synthesis1995，766-768中所描述的方法制备了1-((4-氯苄胺)(苯基)甲基)哌嗪(1-((4-chloropbenyl)(pbenyl)methyl)piperazine)。步骤4：(r)-meclizine和(s)-meclizine将含有(s)1-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪(50mg，0.18mmol)，3-甲基苯基甲基溴(0.025ml，0.19ml)，碳酸钾(80mg)和甲醇(3ml)回流下搅拌过夜。然后将混合物冷却至室温并过滤。滤液浓缩，然后用硅胶色谱柱纯化得到10mg的黄色油状s-meclizine，然后进一步将其转化为其盐酸盐。ms：391(m+l)；ee：＞99％(保留时间＝22.6分；chiralpakod-h柱；流动相：正己烷(0.1％二乙基胺(dea))。按如上所述方法进行氧消耗率(ocr)测定。简单而言，将分散在外加10％胎牛血清的dmem高葡萄糖培养基中的hek293细胞以50,000细胞/孔的密度接种到xf24细胞培养基微板(seahorse生物科学)上。将细胞在37℃，5％二氧化碳的环境下培养过夜。测定开始前，用约925ul不含血清的检测培养基替换生长培养基。测定前，将检测培养基中的细胞在37℃，5％二氧化碳的环境下培养30分钟。在混合2分钟和等待2分钟后，每隔6分钟测定一次。在加入r-meclizine，s-meclizine，或外消旋meclizine前，记录3个基线测量结果。所有上述化合物的原液均用100％dmso配制，原液均是在检测培养基中稀释到特定的浓度，并用氢氧化钠溶液将其ph值调整至7.4。数据表明，s-meclizine和r-meclizine能够抑制耗氧量。s-meclizine和r-meclizine表现出剂量依赖性的细胞耗氧率(ocr)。这两种对映体在25-50um的浓度时，均抑制ocr达到60-80％，见图24a-b。也采用westernblot通过检测用r-meclizine(r-mec)，s-meclizine(s-mec)和外消旋meclizine(rac-mec)处理24小时后c2ci2肌管内ampk磷酸化评价了meclizine，s-meclizine和r-meclizine激活c2ci2肌管内ampk的能力。如图24c所示的结果表明，meclizine，s-meclizine和r-meclizine均能激活c2c12肌管内的ampk。利用与外消旋体的竞争结合实验对每种对映体体结合h1受体的能力进行了评估。通过3nm的[3h]甲氧苄二胺([3h]pyrilamine)存在下的竞争结合实验确定了r-meclizine(r-mec)和s-meclizinc(s-mec)结合到人h1受体的体外结合情况。在过量(1mm)未标记甲氧苄二胺存在下检测非特异性结合。用竞争曲线的非线性回归分析确定了ic50。令人惊讶的是，如图24d-f所示，r-mec结合到h1受体并具有高亲和力，而s-mec在h1受体上表现出的的非常弱的亲和力。这表明，在活体中，与抗组胺作用相关的meclizine给药的副作用(如嗜睡和/或镇静)不可能在用s-对映体给药时出现。实施例4：meclizine作用的机理上述数据表明，meclizine：i)诱导从oxphos向糖酵解的缓慢动力学转变；ii)不直接抑制呼吸。这些数据的一种解释可能是，meclizine能够通过一种代谢或转录重新布线机制改变细胞能量代谢。a.基因表达谱为了探讨这一假说，通过缺氧诱导因子(hif)：一种已知的糖酵解转录激活剂对糖酵解的激活进行了测试。通过在hela细胞中，采用抗hif1-α抗体(cellsignaling，目录号：3716)和抗hif2-α抗体(novus生物制品公司)进行westernblot检测对hifl-α和hif2-α稳定性进行了评估。再从细胞中提取蛋白之前用0.1％二甲基亚砜，50ummeclizine或100um的去铁胺(sigma公司，目录号：d9533号)进行预处理。用抗gls抗体(西班牙马拉加大学哈维尔马尔克斯博士免费提供的样品)对从293细胞上提取出来的蛋白质进行了谷氨酰胺酶westerndetection(gls)。meclizine处理后没有观察到hif稳定性。见图10a-b。接下来，对用meclizine处理6个小时(即，具有最大oxphos抑制作用的时间点)后的成纤维细胞测定了总的基因表达谱。按如下操作进行了寡核苷酸微阵列实验。用rneasy试剂盒(qiagen)从约2百万mch58细胞上提取了总rna。对于3次传代和药物治疗的样本，细胞生长在10mm的葡萄糖或10mm的半乳糖中，并用0.1％dmso或50um的meclizine处理6小时。用10ug的rna用于用t7-(dt)24引物和superscriptone-cyclecdna合成试剂盒(affymetrix)来合成cdna。根据affymetrix公司所建议的方法，进行了crna标记，杂交到人类ul33和2.0寡核苷酸阵列，清洗和染色。对于每个条件，使用了3个生物复制样品，总共6个阵列。利用采用了荧光定量检测的定量rt-pcr方法(appliedbiosystems)确认了了gls的表达。在最严格的错误发现率(fdr＝0.174)下，数据集包括了14个基因，其表达相对于vehicle处理上升或下降了。请参见，如hochberg等人，statmed9：811(1990)。数据表明，下调基因是gls，该基因编码谷氨酰胺，下调了～40％(p＜10)。见图11a和11b。谷氨酰胺被认为是负责线粒体内将谷氨酸转化为谷氨酰胺。此外，总的基因表达谱数据还表明，meclizine上调了许多糖酵解酶(例如，hk2；出现了1.5变化倍数，p＜10-3)。另一方面，有一种细胞葡萄糖摄取的负调节的基因(如txn1p)被下调了35％。帕瑞克等，plosmedicine4：e158(2007)。进行了motifade，以确定这些meclizine诱导的总基因表达变化是否与过度取代了顺式调控机制相关联。mootha等，pnasusa101：6570(2004)。确定了一个e-box结合位点(即，5′-cacgtg-3′)(bonferroni校正；p＜10-5)。已经确定该e-box结合位点参与多种转录调节因子，包括葡萄糖的响应转录因子，如chrebp和mondo。b.gls转录分析按如下操作进行了rnai和c-dna过度表达的表达实验，以便评价gls。含有空载体(plko.1)的lentiviral颗粒或对gls表达shrna的载体(gcacagacatggttggtatat)(seqidno：1)。用lentiviral颗粒转导后，在嘌呤(2ug/ml)中对mch58成纤维细胞进行选择并扩展制备稳定的组合。通过定量rt-pcr利用荧光定量检测确认了gls组合。使用这些细胞进行代谢状态依赖性敏感性和ocr及ecar实验。使用带有引物的校对taq聚合酶(accuprime，invitrogen公司)对谷氨酰胺酶全长cdna(openbiosystems，accession编号：bco38507)进行放大，引物包括用于随后亚克隆成pdonr221载体的attb1和attb2位点(invitrogen)。5′引物总包含了部分kozak序列，而从3′引物中去除了终止密码子。往前的序列(f)和反向引物(r)分别为5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccaccatgatgcggctgcgaggctc-31(seqidno：2)；和5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccaacaatccatcaagattct-3′(seqidno：3)。用bpclonase，利用stbl2e.coli感受态细胞(invitrogen公司)将得到的pcr片段克隆到gateway人口载体pdonr221(invitrogen公司)上。随后，用lrclonase将其亚克隆到目的载体pcdna6.2-emgfpdest上，并进行了测序验证。采用fugene(roche)试剂，用pcdna6.2-gls-gfp和对照载体pcdna6.2-lacz-gfp对293细胞进行转染。采用抗gls抗体，用westernblot对gls表达进行了确认。见图14a。对facs排序转染细胞进行meclizine处理，然后进行ocr和ecar测定。见图14b。gls的是一种线粒体酶，并将谷氨酸转换成谷氨酰胺，是tca循环的一种关键的补缺基质并且是atp合成的前体。见图1a及1b。在富半乳糖培养基中，观察到细胞快速消耗谷氨酰胺且相对于葡萄糖条件，gls上调了约30％。如果减少的gls表达与代谢状态依赖杀伤力相关，那么经meclizine处理的生长在半乳糖培养基中的细胞应该可以通过加入谷氨酸(一种线粒体谷氨酰胺酶活性的产品)而获救。因此，将经meclizine处理的生长在富半乳糖培养基中的细胞与谷氨酸以及细胞渗透酯二甲基谷氨酸一起孵育。虽然它是没有必要的了解一项发明的机理，我们认为这些代谢物都应该会被摄取进入细胞，运送到线粒体内，通过谷氨酸脱氢酶转化为酮戊二酸，进而作为tca循环中的补缺前驱体。然而，没有观察到meclizine诱导的细胞生存活力抑制的挽救。见图4b及4c。随后的结果表明，gls的转录变化在谷氨酸介导的呼吸中起作用，但不可能是发生在meclizine处理后的代谢变化的主要驱动力。进一步的实验证实：i)meclizine处理6个小时后，通过实时定量pcr检测到gls转录减少50％，且ii)shrna介导的gls表达的抑制导致了半乳糖中生长细胞生存活力的选择性丢失。例如，rnai对gls减少了耗氧量，并引起了代谢状态依赖性杀伤力升高。见图12a和12b。但是，gls蛋白质在meclizine处理之后没有减小。见图13。此外，甚至基本的启动子迫使gls表达细胞的细胞中meclizine继续抑制氧消耗。见图14a和图14b。总的来说，这些数据表明，gls转录水平的下降对于积极的meclizine影响可能是次要的。c.代谢产品的评价为了获得meclizine在减少氧化代谢作用机制进一步了解，对用meclizine处理的细胞进行了以质谱为基础的代谢分析。在用50ummeclizine或vehicle对照品对mch58成纤维细胞处理6小时后，采用与此前描述的方法类似的方法进行了代谢产物分析，参见shaham等，molsystbiol4：214(2008)。简单而言，在浸泡于4ml培养基中的6cm组织盘上培养低传代的mch58细胞，直至90％的融合且最终产量为1x106的细胞。为了评估培养基代谢产物，从培养盘中取出500ul用过的培养基或基线培养基(加入到细胞之前)并立即加入500ul预冷的(-80℃)甲醇提取液(80％甲醇，20％的水)，以便快速淬新成代谢并提取代谢产物。在4℃放置20分钟后，将样品在14000克的离心力下离心10分钟，收集50ul上清，用1∶20甲醇萃取液再稀释，将在氮气下蒸发100ul的最终溶液。将样品复溶于60ul的hplc级水中并按下述方法测定代谢水平。为了评估细胞内的代谢产物，从上述组织培养板上吸取培养基并用4毫升的pbs轻轻地洗涤细胞，以确保彻底清除残留的培养基代谢产物。去除pbs并立即加入1ml预冷(-80℃)的甲醇萃取液(80％甲醇，20％水)淬灭细胞的新陈代谢。刮下细胞，收集提取液，振荡并按上述制备培养基样品的方法对样品进行离心。收集100ul上清，用1∶1的甲醇提取液再次稀释，并在在氮气下蒸发100ul的最终溶液。将样品复溶于60ul的hplc级水中并评估代谢产物。每组评估6个生物重复样本。采用由连接在三个agilent1100二进制hplc泵(agilent科技公司)的4000qtrap三重四极杆质谱仪(appliedbiosystems公司/sciex公司)和一个配备了三个注射口和一列选择阀的htspal自动进样器(leap科技)组成的液相色谱串联质谱法(lc-ms)对内源性代谢物进行分析。为每个样品的分析配置了三种多路色谱方法：lc方法1使用lunaphenyl-hexyl色谱柱(phenomenex)，用水/乙腈/乙酸(初始比例100/0/0.001，最终比例10/90/0.001)进行线性梯度洗脱；lc方法2采用正相lunanh2色谱柱，梯度洗脱采用含有0.25％的氢氧化铵和10mm醋酸铵(梯度洗脱开始时乙腈/水比例为80/20和结束时为20/80)的乙腈/水流动相；lc方法3使用反相的synergipolar-rp色谱柱(phenomenex)，梯度洗脱采用5％乙腈/5mm醋酸铵(流动相a)和95％乙腈/5mm的醋酸铵(流动相b)为流动相。在阳离子模式(lc方法1)和阴离子模式(lc方法2和3)两种离子模式中均采用多反应监测(mrm)获取ms数据。在开发这种方法的过程中，采用可信的参考化合物来分别确定lc保留时间和调整mrm转换。通过采用multiquant软件(1.1版；应用生物系统公司/sciex公司)对特定的mrm转换的峰面积进行积分来进行代谢产物的定量且人工对所有积分峰的质量进行审核。在评估在这项研究的样本之前，对提取和定量程序进行了优化，以确保所测量的细胞内和培养基的代谢产物在检测的线性范围内。采用外源性磷酸乙醇胺标准品来确认磷酸乙醇胺的峰(sigma公司，p0503)。在所测定的约125种代谢产物中，在多假设检验校正后，有6种产物有显著改变的细胞内水平(padj＜0.05)。见表4。表4：meclizine处理后代谢产物的代表性列表上调最多的是磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine)，meclizine处理6小时后增加了将近35倍。参见图15a。通过正交色谱仪以及通过31p-nmr证实了磷酸乙醇胺上调。在多种类型的细胞中均观察到了磷酸乙醇胺(pea)上调。见图15b。以往的研究表明，磷酸乙醇胺(pea)在未成年的细胞中可能升高，乙醇胺和磷酸乙醇胺(pea)可以直接抑制线粒体oxphos。zhu等人.，jlipidres49：2197(2008)；andmodica-napolitanoetal.，biolpsychiatry55：273(2004)。为了测试磷酸乙醇胺(pea)对线粒体呼吸的影响，在加入2.5mm谷氨酸钠和2.5mm的苹果酸及随后加入lumcccp之前，将线粒体在不同浓度的磷酸乙醇胺(pea)溶液中孵育1小时。与这些报道一致的是，磷酸乙醇胺(pea)阻断了解偶联剂刺激的呼吸，且，在完整的细胞中，meclizine处理减弱了解偶联剂刺激的呼吸。分别见图16a及16b。磷酸乙醇胺(pea)，大多是通过pe-kennedy途径和磷脂酰丝氨酸脱羧重新合成的一种重要的内膜磷脂，是受meclizine影响上调最大的细胞内代谢产物，只需meclizine处理6小时后增加近35倍。ctp：磷酸乙醇胺胞苷酰转移酶(pcyt2)催化cdp-乙醇胺的形成，是pe-kennedy途径的速率调控步骤。参见fullerton等，jbiolchem18；284(38)：25704-13(2009).为了确定meclizine是否影响pcyt2的活性，在加入了50-1000ummeclizine或50-600ums-meclizine的情况下，用纯化的重组pcyt2pcyt2在体外进行了(ctp：磷酸乙醇胺胞苷酰转移酶)酶检测。如需了解详细资料，见zhu等，jlipidres49：2197(2008)。如图16c-16d所示，meclizine和s-meclizine结合到pcyt2上并抑制pcyt2，导致磷酸乙醇胺甚至是乙醇胺的升高。相比于经典的线粒体呼吸抑制剂，在此已经证明meclizine是一种间接的oxphos抑制剂。例如，我们可以在广泛的浓度范围内滴定测量meclizine的效果，可以达到10％至60％的抑制细胞耗氧率。如图6a和图17a所示。虽然没必要了解一项发明的机理，我们认为，此处的数据表明，meclizine是独立于毒蕈碱或组胺受体而发生作用的，因为影响这两种类型受体的药物没有影响能量代谢；见图17b-c所示。以往的研究表明，乙醇胺和磷酸乙醇胺可以作为线粒体oxphos的内源性抑制剂，且这两种代谢产物在癌细胞中均升高。分别见modica-napolitano等，biolpsychiatry55：273(2004)和zhu等，jlipidres49：2197(2008)。有意思的是，已有报道称两种meclizine代谢产物在alzheimer疾病和huntington疾病患者的大脑中均减少。参见ellison等.brainres417：389(1987)。此外，众所周知的是，线粒体的磷脂成分影响超复合物的形成。由于预计pcyt2抑制剂可能会影响细胞内的磷脂成分，这可能是oxphos可能被减弱的另一种机理。实施例5：神经退行性疾病中meclizine的体内评价本实施例描述了证明meclizine能有效地防止神经退行性疾病细胞模型中细胞死亡的实验。最近的几项研究表明，线粒体呼吸的基因或药物抑制，可以抑制氧化损伤和神经退行性疾病的细胞死亡。buttner等，jbc283：755415(2008)；fukui等，pnasusa104：14163(2007)；和varma等，pnasusa104：14252(2007).虽然这些结果满有希望且具有创新性，将这些结果转化为治疗效果，尤其是治疗的中枢神经系统疾病的治疗效果的一个主要局限，是缺乏跨血脑屏障并有良好治疗指数的oxphos抑制剂。经典的线粒体呼吸抑制剂如鱼藤酮和寡霉素能够抑制多聚谷氨酰胺(polyq)的毒性。varma等，pnasusa104：14252(2007)。然而，由于其急性和直接抑制oxphos，这些试剂是剧毒的，不适合治疗干预。meclizine能防止多聚谷氨酰胺的毒性用以上所描述的筛选方法确定了几种满足治疗各种疾病临床成功这一条件的候选化合物。这些候选化合物之一就是meclizine。选择这一化合物作为整个潜在候选药物类的代表进行进一步的测试，这些潜在候选药物类可能会有治疗效果，同时不会出现目前已知的oxphos抑制剂所产生的典型的线粒体毒副作用。例如，以往的研究已经表明，oxphos抑制剂包括鱼藤酮和寡霉素在huntington疾病(hd)的细胞和动物模型中能提供保护作用。varma等，pnasusa104：14252(2007)。然而，这些oxphos抑制剂都是剧毒，因此不能用作人类治疗的药物。进一步探讨了meclizine在细胞和动物hd模型中的治疗潜力，因为该化合物具有优良的中枢神经系统渗透性，广泛的治疗指数，并能通过轻微地减少oxphos基质的可用性来抑制线粒体呼吸。最近有关细胞和动物模型的研究表明，oxphos的基因抑制实际上可以抑制一系列的神经退行性疾病突变型等位基因的毒性。huntington疾病就是这样一种由于huntingtin基因的蛋白质产物中聚谷氨酰胺(polyq)扩展造成的。gusclla等.nature306：234(1983)。疾病的发病机制的理论之一认为，polyq与线粒体呼吸链相互作用会提高氧化损伤和损害线粒体钙处理。以往的研究表明，线粒体呼吸的经典抑制剂如鱼藤酮和寡霉素可以抑制polyq的毒性，但在这些研究中所使用的试剂对于人类使用是不安全的。varma等，pnasusa104：14252(2007)。a.纹状体细胞培养模型从表达具有多聚谷氨酰胺不同重复长度(例如，111多聚谷氨酰胺重复长度(sthdhq111/111)或7聚谷氨酰胺重复长度(sthdhq7/7)的hdhcag基因敲除小鼠胚胎上获得有条件永生化的纹状体祖细胞。trettel等，hummolgenet9：2799(2000)。具有111重复长度的小鼠(sthdhq111/111)表现出类似hd的显型，而用表达较短的7重复长度的小鼠作对照且没有这一表型。wheeler等.hummolgenet.1(9)：503(2000)。sthdhq111/111小鼠的一种细胞表型包括一种去血清后的快速、细胞凋亡性死亡，比野生型细胞更为明显(～218％)。见图5a和5d所示。给sthdhq111/111细胞加meclizine，在去除血清24小时后，明显地增加了呈剂量依赖性(ec50-17.3um)细胞存活(如挽救)，如图5a-5c所示。虽然没有必要了解一项发明的机理，但我们认为所观察到细胞存活可能是由于基于半胱天冬酶3和7裂解的细胞凋亡受抑制所造成的。参见图5d。通过显微镜证实了提高的细胞活力。见图5g。由于meclizine在细胞内有多种可能的作用机制(例如，抗-组胺，抗-毒蕈碱，或抗-oxphos)，对meclizine赋予纹状体的细胞保护的细胞死亡机理进行了研究。因此，从6类不同的化合物中选择了10种抗-组胺，2类抗毒蕈碱化合物，和3种oxphos抑制剂进行了评价。按如下操作进行westernblot分析。表达突变的huntingtin蛋白的小鼠sthq111/111纹状体细胞生长至覆盖15em细胞培养板～75％面积。然后用0.1％dmso或50ummeclizine无血清培养基替换含血清的培养基，并在去除血清和细胞裂解液中药物处理后的0.4，10和24小时提取总蛋白(cellsignaling，目录号9803)。采用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度(thermoscientific，目录号：23227号)。采用购自invitrogen公司的nupage4-12％bis-tris凝胶(np0321)进行sdspage。每个通道加载15ug的蛋白质。根据标准操作规程进行westernblotting。裂解半胱天冬酶3(目录号：9661)，裂解半胱天冬酶7(目录号：9491)，p-erk(thr220/try204；目录号：9803)，akt(目录号：9803)抗体购自cellsignaling。p-肌动蛋白抗体购自sigma公司(a1978)结果表明，meclizine在去除血清后24小时内防止了半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的无血清诱导活化。见图5d。在这一纹状体细胞培养hd模型中也考察了meclizine对h1和/或毒蕈碱受体的拮抗性。在所有这些化合物中，meclizine提供了最大程度的保护，且按类别看，oxphos抑制剂能提供最大程度的保护，表明meclizine诱导的oxphos抑制对其神经保护作用有贡献。见图5e。此外，在meclizine抑制纹状体细胞耗氧量的能力和其为表达突变等位基因提供增强生存能力之间也观察到了剂量反应的单调关系。见图17a。尽管没有必要了解一项发明的机理，我们认为这些数据表明，meclizine保护小鼠纹状体细胞的能力可以通过转换能量代谢的能力实现。以往一项使用polyq毒性的大鼠细胞培养模型的研究报告显示，通过鱼藤酮挽救细胞死亡是部分通过亲生存akt和erk信号通路的上调介导的。varma等.procnatlacadsciusa104：14525(2007)。此处给出的数据证实了从血清去除诱导的细胞凋亡中用鱼藤酮挽救小鼠sthdhq111/111细胞。见图5d-5e。但是，没有证明鱼藤酮或meclizine激活erk或akt通路。见图18a和图18b。且如图5a-b所示，huntington疾病模型中，meclizine能够抵制多聚谷氨酰胺毒性。这种抵制与其能够抑制细胞呼吸的能力相关(见图17a)，是独立于其抗组胺和抗毒蕈碱活性的(见图5e)。这是通过血清去除和用药物处理后检测sthdhq111/111细胞的生存活力进行评价的。化合物是按照药物目标进行安排的。血清处理用作阳性对照。也对meclizine两种对映体提供保护的能力进行了评价。在去除血清和用药物处理后对sthdhq111/111细胞的生存活力变化百分比进行了评价。r-meclizine(r-mec)，s-meclizine(s-mec)和外消旋混合物(rac-mec)使用的浓度为20μm。如图18c所示，s-meclizine在huntington疾病的细胞模型中是具有保护作用的。meclizine作为止吐药或抗眩晕剂的作用机制还没有准确地阐明，但人们认为是通过阻断组胺和蕈毒碱受体发生作用的。上述以细胞为基础的生物能量学分析表明，meclizine能在几个小时内将代谢从氧化磷酸化转换为糖酵解，这可能是通过一种独立于组胺和毒蕈碱细胞表面受体的新的转录后机制实现的。例如，meclizine转换能量代谢的km高于已公开的阻断h1受体km的百倍以上。b.转基因线虫模型在huntington疾病的一种动物模型中也对meclizine进行了测试。转基因线虫接触受体神经元能表达一种含有128个谷氨酰胺重复单元的huntingtin(htt)n端片段，而野生型蛋白质只有17个谷氨酰胺重复单元。这些神经元显示出polyq依赖性神经功能障碍，导致后部机械性刺激感觉缺陷。parker等，natgenet37：349(2005)。使用融合到接触受体神经元中cfp的动物共同表达的yfp和n-端htt进行药物测试。请参见，parker等，procnatlacadsciusa98：13318(2001)。如此前所述，在96孔板中，用含有op-50细菌和30mg/ml链霉素的50ulm9培养基，将通过次氯酸钠提取获得的同步l1幼虫与药物一起在20℃下培养3天。进行了三次独立检测且每个剂量至少测试100只蠕虫。蠕虫用dmso或33μm的meclizine处理3天。如果在轻轻接触(如，启动反向运动)后发生了反应，则认为这些蠕虫动物是接触反应性的。在3次接触中，有2次或3次反应被认为是反应性的，而0次或1次反应则被认为是非反应性的。如此前所描述的，采用光学显微镜对plm神经元中的聚集和轴突形貌进行评分(parker等，procnatlacadsciusa98：13318(2001))。采用cfp荧光对htt聚集进行评分，采用yfp荧光对轴索营养不良进行量化，以便检测轴索肿胀。采用分散在4-15％bis-tris凝胶上的wormbook方法提取蛋白，转移到膜上，然后用抗-gfp抗体(abcam公司，ab6556)对gfp标记的128q-htt片段进行探查。采用抗肌动蛋白抗体对蛋白的数量进行标准化(mp生化，69100)。在突变polyq动物中，meclizine以剂量依赖性的方式改善了对板尾刺的感官反应，而在对照动物中没有检测到影响。见图5f。在33.33μm浓度下观察到了最佳响应，这与在小鼠sthdhq111/111细胞中的细胞生存活力相当。见图5c。在33.33um的剂量下，在转基因蛋白表达中没有观察到变化。见图19a。类似地，没有检测到对polyq蛋白聚集的影响。见图20。然而，轴索肿胀减小了。见图21a和图21b。这一数据与以前有关polyq-15表达蠕虫的报道是一致的，轴索营养不良症是神经功能障碍的一种较强的关联物。parker等，procnatlacadsciusa98：13318(2001)。在33.33um的浓度下，meclizine没有产生任何毒性。虽然100um会造成轻度发育延迟。相比之下，已经证明，甚至在更低的剂量下，鱼藤酮会因严重中毒造成发育迟缓。varma等，procnatlacadsciusa104：14525(2007)。c.转基因果蝇模型在huntington疾病的转基因昆虫模型中也对meclizine进行了测试，将人类htt的前548个氨基酸(含有128个谷氨酰胺)在果蝇的眼睛内进行表达。编码分别含有0个或128个谷氨酰胺的人类htt前548个氨基酸的uas-htt-qo和uas-htt-q128细胞株是由troylittleton免费提供的样品。elav-gal4driver购自bloomingtonstockcenter(编号：8765)。将uas-htt-q128细胞株杂交到elav-gal4/cyo获得uashtt-q128/elav-gal4果蝇。对羽化后的蝇的伪瞳分析表明，这些成年蝇没有出现可鉴别的退变，但这些感杆在接下来的10天出现了逐步退化。见图22b。相比之下，由elav-gal4驱动的has-httq0没有出现退化。将相同数量的新羽化的uas-htt-q128/elav-gal4蝇加入到含有用水和不同浓度(100，33，11或3um)的meclizine或dmsovehicle新鲜配制的carolinabiologicalinstant蝇食物的瓶子中。每隔两天给蝇更换新鲜的食物和药物并在整个实验过程中保持在25℃。对于每个条件，在第10天，通过对至少8个动物的感杆数量/小眼评分，利用假瞳技术对神经退行性进行评估；请参见jackson等，neuron21：633(1998)。实验进行了两次且评分是在盲态下进行的。采用小鼠抗-人hd((mab2216，购自ca，temecula的chemicon公司)对来自用33μm的meclizine或dmso喂养了10天的uas-htt-q128/elav-gal4成年蝇的细胞裂解物进行了westernblot分析。突变htt输异基因的表达会导致每个小眼感杆数量的逐步减少。见图22a和图22b。用33μm的meclizine处理不会影响转基因蛋白的表达。见图19b。然而，与用dmso处理的对照相比，这种meclizine处理确实能防止感杆的损失。见图23。实施例6：缺血性疾病中meclizine的体内评价此处的数据显示，meclizine在缺血和再灌注的文献所接受的细胞模型中能提供保护。将生长在含有10％透析胎牛血清的dmem中的永生化小鼠纹状体20a5细胞暴露到氧气和无葡萄糖的环境中18小时，然后用完全的培养基在含氧量正常的环境下恢复12小时。经atp荧光检测celltiter-glo测定，这一ir模型诱导了约30％的细胞生存活力的降低。见图25a。然后，在去除氧气和葡萄糖之前，细胞用25μm的meclizine处理8小时，其中，相对于相应空白预处理的细胞，meclizine预处理导致了细胞生存活力的明显改善。见图25b。按如下方式对meclizine保护分离的心肌细胞和分离心脏抵制缺血性损伤的能力进行了研究。通过内毒素无胶原酶灌注分离了成年大鼠的心室心肌细胞，并按如前所述的方法(wojtovich和brookes，basicres.cardiol.，104：121-129(2009))对缺血再灌注损伤进行了模拟。在进行图33a中的处理前，先培养分离出来的心肌细胞。将对照细胞暴露于dmso20分钟。将测试细胞暴露于vehicle或不同剂量的meclizine20分钟，在进行60分钟缺血前清洗掉，然后在ph7.4的常氧葡萄糖充满缓冲液的正常氧气条件下灌注30分钟。用曲利本蓝排出检测细胞生存活力。通过分离线粒体评价v02并采用clark氧电极(woitovich，supra)测定呼吸细胞和线粒体。如图33b所示，观察到dmso处理过的细胞在面临缺血/再灌注(i/r)时细胞生存活力减少了约60％，而不同浓度的meclizine保护心肌细胞不受i/r影响。在meclizine浓度为0.5μm-10μm时观察到了最优化的保护作用。在浓度为50μm和100μm时未观察到meclizine保护作用。使用其他抗组胺药物(甲氧苄二胺和苯吡胺)或抗胆碱剂(东莨菪碱和阿托品)时未观察到保护作用。如图33c所示，与dmso处理的细胞相比，meclizine处理促进了vo2的降低。这些观察结果支持meclizine可以用于保护心肌细胞不受i/r影响。采用逆行灌注心脏和langendorf心脏(nadtochiy等，biochem.j.，395：611-618(2006))评估meclizine在分离的、体外的心脏中的作用。然后，心脏处于一段时间的缺血状态，之后进行灌注。如图34a和34b所示，如分压的增加(见图34a)和较小的梗死面积(见图34b)所示，与未处理的对照品相比，meclizine保护处理过的心脏以防止i/r损伤。这些观察结果进一步证明了在分离心肌细胞中所显示的观察结果并支持meclizine可以用于保护完整和正在运作的心脏防止i/r损伤。按以下操作，采用文献公认的中风动物模型对meclizine对中风的保护作用进行了评估。腹腔注射到c57bl/6小鼠后测定了meclizine的血浆浓度。注射100mg/kg的meclizine或vehicle对照品后1小时或6小时，心脏穿刺抽血。采用液相色谱串联质谱法，以纯化的标准品对照测定血浆中meclizine的绝对浓度。为了考察所测试化合物的保护作用，在缺血前的第17小时和第3小时，雄性c57bl/6小鼠分别两次腹腔注射100mg/kg的meclizine，20mg/kg的甲氧苄二胺和0.5mg/kg的东莨菪碱或vehicle。甲氧苄二胺和东莨菪碱的药物剂量是根据以往的文献中体内大脑的生物利用度的证据选择的(参见，miyazaki等，lifesci57：2137(1995)andtoyota，etal.，mol.pharmacol62：389(2002))。实验人员对处理组是处于盲态的。用异氟烷麻醉小鼠麻醉(2.5％用于诱导，1.5％用于维持麻醉，70％n2o/30o2％中)，使用腔内长丝经颈外动脉插入使小鼠处于1小时的瞬态中间脑动脉闭塞。使用放置在核心大脑中动脉区域的激光doppler探头监测局部大脑血流。用伺服控制加热垫控制直肠温度为37℃。通过对每个通常切片水平中梗死区的面积积分，在2，3，5-三苯基氯化四氮唑(ttc)染色的1毫米厚冠状切片上通过整合10个切片中每一个的梗死区的面积计算总的梗死体积。用“间接方法”，即对侧脑半球减去同侧非梗死体积，来计算梗死体积。数据以平均值±标准偏差表示。采用单因素方差分析和tukey多重比较检查对不同组间的值进行分析。采用kruskal-wallis非参数方差分析和dunn多重比较检查对神经功能缺损评分进行分析。p＜0.05就确定为具有统计学显著意义。使用mca闭塞让动物处于1小时的缺血，随后再灌注24小时，在缺血前给予meclizine或vehicle对照品(见图35a)。如图35b和35d所示，与对照动物相比，meclizine处理的动物的梗死体积显着降低，而cbf没有差异显著(图35c)。这些观察结果支持meclizine可用于保护防止中风。总之，此处所给出的结果支持，meclizine可用于防止心脏、大脑(中枢神经系统)、和肾脏中缺血再灌注促进的细胞损伤。实施例7：meclizine和糖尿病此处给出的数据表明，meclizine可用于糖尿病的治疗。按照如下操作，根据葡萄糖摄取协议对完全分化的c2c12成肌管进行处理。简而言之，在含有0.1％dmso作为对照，50微摩尔meclizine，50微摩尔s-meclizine，或2mm甲福明二甲双胍的无血清的培养基中孵育c2c12成肌管4小时。随后将细胞在无血清和葡萄糖的缓冲液中孵育30分钟，然后过渡到含有[3h]-2-脱氧葡萄糖的缓冲液中孵育5分钟。多次清洗后，裂解细胞，并将裂解液进行闪烁计数以量化摄取量。数据按每分钟原始计数表示，该数据与2-脱氧葡萄糖的摄取量成比例。如图36所示，meclizine和s-meclizine促进了c2c12成肌管中基底葡萄糖摄取的增加。此外，meclizine和s-meclizine也激活了amp激酶，如图24c所示。细胞研究表明，meclizine和s-meclizine具有降低血糖的作用。此外，meclizine和s-meclizine能够激活ampk。总之，这些数据支持meclizine和s-meclizine作为糖尿病的治疗潜力。实施例8：meclizine和寄生虫感染此处给出的数据表明，meclizine可用于治疗某些寄生虫引起的感染。磷脂是所有真核细胞中一种主要的磷脂类。可通过以下方式合成磷脂：(i)kennedy途径的cdp-乙醇胺分支反应；(ii)磷脂酰丝氨酸脱羧；或(iii)与磷脂酰丝氨酸的阳离子交换。在包括人类在内的哺乳动物中，所有这三个途径都是可以实现的。但是，在某些病原体中，包括布氏锥虫(trypanosomabrucei)——一种导致人类和动物的非洲锥虫病(昏睡病)的病原体，trypanosomacruzi——一种能引起南美洲锥虫病(chagasdisease)的寄生虫，和恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)——人类疟疾寄生虫，磷脂主要是通过kennedy路经合成的。因此，我们假设meclizine能够有效杀死这些寄生虫。如表5所示，meclizine，r-meclizine和s-meclizine在低的微摩尔范围内能杀死半数有效量(ed50)的布氏锥虫。表5-对布氏锥虫的有效性化合物ed50meclizine1.4i±0.12μmr-meclizine0.66±0.05μms-meclizine3.43±0.23μm其他实施例可以理解的是，尽管已结合其详细描述对本发明进行了说明，上述描述只是对本发明进行说明，而不是限制权力要求书中所载的有关本发明的权力要求范围。其他方面，优势，以及对本发明的修改均在以下权利要求的保护范围内。当前第1页12