原地衣硬酸在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及原地衣硬酸在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中的应用。

背景技术：

白色念珠菌是一种定植于人体的条件致病真菌。当机体免疫力下降时会引起皮肤黏膜浅层乃至全身系统性真菌感染。近30年以来，随着广谱抗生素的过度使用，肿瘤化疗、器官移植等治疗方法的广泛应用以及免疫系统性疾病患者的增加，临床上由真菌造成的感染出现愈演愈烈的趋势。随着临床上抗真菌药物，特别是抑菌药物的广泛使用，真菌耐药性不断增加并且日趋严重，而这种耐药性的产生通常发生多药耐药，给临床真菌感染的治疗造成极大的困难，甚至是治疗失败。念珠菌属是临床上最常见的条件致病性真菌之一，而在念珠菌属中以白色念珠菌为最常见的致病真菌感染模型。白色念珠菌具有两态性，其中菌丝态是白色念珠菌的一个重要的毒力因子，在其致病感染过程中发挥着重要作用。所以深入研究开发具有抑制真菌形态转化或逆转真菌耐药的药物具有十分重要的意义。

地衣是真菌和藻类结合在一起的共生复合体，既不同于真菌，也不是藻类植物。皮革肾岛衣（nephromopsispallescens(schaer.)park）别名树衣，是药食两用梅衣科（parmeliaceae）肾岛衣属（nephromopsis）地衣植物，地衣体中型叶状，质硬，直径7-15cm，仅中央裂片下表面疏松附着于基物，呈莲座状扩展；上表面淡黄色至黄绿色，有强烈褶皱，无粉芽及裂芽；下表面淡黄色至黄褐色，有强烈褶皱，白色点状假杯点生于皱脊上，假根稀疏，常附着于松树、栎树树干及枯木桩上。

技术实现要素：

本发明提供了原地衣硬酸在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

原地衣硬酸在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中的应用。

所述的，原地衣硬酸是由以下步骤制备得到的：

1）将皮革肾岛衣（nephromopsispallescens）粉碎后过80目筛，得粗粉；在粗粉中加入78%的乙醇浸泡24h以上，超声提取30min，过滤，得滤液；将滤渣重复浸泡、提取和过滤2次，合并3次滤液，浓缩至无醇味，得皮革肾岛衣提取物；

2）将皮革肾岛衣提取物用常压硅胶色谱柱进行硅胶柱层析分离原地衣硬酸，以石油醚和丙酮进行梯度洗脱，得洗脱液；将洗脱液精制，得原地衣硬酸溶液；

3）将原地衣硬酸溶液作为样品，以混合溶剂作为流动相，进行硅胶柱层析分离；用硅胶薄层层析检测，得原地衣硬酸流份；将原地衣硬酸流份置于石油醚和丙酮混合溶液中重结晶，得原地衣硬酸。

所述步骤1）中，乙醇的用量为粗粉重量的20倍。

所述步骤2）中，石油醚和丙酮进行梯度洗脱时，丙酮的体积分数的梯度范围为0-100%。

所述步骤2）中，洗脱液精制时，温度为55℃、真空度0.08-0.09mpa条件下减压浓缩。

所述步骤3）中，硅胶柱的直径为30mm；硅胶柱填充使用300-400目硅胶480ml。

所述步骤3）中，混合溶剂是由石油醚、丙酮和甲酸按照9：1：0.01的体积比制得的。

所述步骤3）中，硅胶薄层层析检测时，展开剂是由石油醚、丙酮和甲酸按照7：3：0.1的体积比制得的；显色剂为15％浓硫酸乙醇溶液。

所述步骤3）中，石油醚和丙酮的体积比为7：3。

本发明制备的原地衣硬酸，分子式为c19h32o4，分子量为324，其结构式如下：

本发明的有益效果：

本发明制备的原地衣硬酸（protolichesterinicacid）在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中具有很好的作用。具体作用见实施例和活性实验。

附图说明

图1为实施例1制备的原地衣硬酸的¹h-nmr谱图；

图2为实施例1制备的原地衣硬酸的¹³c-nmr谱图；

图3为实施例1制备的原地衣硬酸的esi-ms谱图；

图4为实施例1制备的原地衣硬酸的纯度检测图；

图5为实施例1制备的原地衣硬酸抑制白色念珠菌菌丝生长活性对比图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明所用的皮革肾岛衣（云南省楚雄州），由中国科学院昆明植物研究所王立松高级工程师友情提供。

实施例1

原地衣硬酸在抑制真菌菌丝态形成和逆转白色念珠菌耐药活性中的应用。

原地衣硬酸是由以下步骤制备得到的：

将采自云南省楚雄州的皮革肾岛衣（nephromopsispallescens）150g，粉碎后过80目筛，得粗粉；在粗粉中加入78%乙醇（体积分数，乙醇-水）3l，25℃条件下浸泡24h以上，超声提取30min，常压过滤，得滤液；将滤渣用3l体积的78%的乙醇再重复提取2次，合并3次滤液；浓缩至无醇味，得皮革肾岛衣提取物70g。

将皮革肾岛衣提取物以100-200目硅胶拌样，进行常压硅胶色谱柱（100-200目硅胶，φ60×600mm）层析分离，以石油醚和丙酮的混合溶剂（丙酮的体积分数的梯度范围为0-100%）作展开剂进行梯度洗脱，得洗脱液；将洗脱液在温度为55℃、真空度0.08-0.09mpa条件下减压浓缩，薄层层析检测主要成分斑点，合并含主要成分斑点流份，得原地衣硬酸溶液；

将原地衣硬酸溶液作为样品以100-200目硅胶拌样，以混合溶剂（混合溶剂是由石油醚、丙酮和甲酸按照9：1：0.01的体积比制得的）作为流动相，进行硅胶柱层析分离；其中，硅胶柱的直径为30mm；硅胶柱填充使用300-400目硅胶480ml；展开剂是由石油醚、丙酮和甲酸按照7：3：0.1的体积比制得的；显色剂为15％浓硫酸乙醇溶液。合并比移值相同流份，减压浓缩，得原地衣硬酸流份；将原地衣硬酸流份以石油醚和丙酮（石油醚和丙酮的体积比为7：3）溶解，放置，待白色结晶析出，反复重结晶2次，得白色结晶化合物0.45g。经hplc分析，纯度达97%，如图4所示。

对得到的白色结晶化合物进行分析，硅胶薄层层析（石油醚：丙酮=7：3）显示rf=0.54，喷15%浓硫酸乙醇溶液显色为紫色。

ms,m/z324(m^-+1)，分子式为c19h32o4。uv（meoh），218nm(3.82)。¹h-nmr(400mhz,acetone-d6)：6.27(1h,d,j=3hz,c5-hb),5.98(1h,d,j=3hz,c5-ha),4.78(1h,ddd,j3-4=6hz,j6-7=6hz,c4-h),3.80(1h,m.c3-h),1.75(2h,m,c2-h),1.29(22h,brs,c7~8-h),0.88(3h,m,c19-h);¹³c-nmr(100mhz,acetone-d6)：171.89(c-1),136.19(c-2),51.17(c-3),80.79(c-4),125.17(c-5),169.55(c-6),37.12(c-7),26.53(c-8),30.16~31.31(c-9~17),24.22(c-18),15.25(c-19)。可知该化合物为原地衣硬酸（protolichesterinicacid）。

化合物鉴定中涉及的¹h-nmr、¹³c-nmr和esi-ms谱图见图1-3。

活性实验

1.实验材料：白色念珠菌野生型yem30菌株，唑类耐药菌株ca10；rpmi1640培养基。

2.实验方法

2.1逆转耐药

将活化过夜的白色念珠菌ca10菌株，用rpmi1640培养基调节至每毫升2×10³个细胞，用稀释好的菌液配置2倍浓度梯度的氟康唑（flc）和实施例1制备的原地衣硬酸工作液。在96孔板的1-11列各孔中加入50微升各浓度梯度的flc二倍浓度工作液，a-g行加入原地衣硬酸两倍浓度的工作液，按照棋盘法实现flc和原地衣硬酸的混合给药，35℃培养48h。

采用fici模型评价其相互作用效果。

fici=micab/mica+micba/micb

其中mica和micb分别是a药和b药单独使用时的mic值，而micab和micba是联合用药是最小剂量对应的a和b的浓度。fici<0.5，a药和b药相互作用为协同作用。

2.2抑制菌丝形成

将活化过夜的白色念珠菌yem30菌株，用rpmi1640培养基调节至每毫升1×10⁵个细胞，加入到无菌的96孔板中，梯度加入不同剂量实施例1制备的原地衣硬酸，37℃静止培养3、6、9、24h后，用显微镜观察真菌的形态。

3.实验结果

如图5所示，实施例1制备的原地衣硬酸可浓度依赖性抑制白色念珠菌yem30菌株菌丝态的形成，进而抑制白色念珠菌的毒力；并且该化合物与氟康唑联用，可以在4μg/ml时将临床唑类耐药株28a，28d的氟康唑mic值从128μg/ml降低到2μg/ml，表现出极强的逆转耐药效果。采用fici模型评价，fic值为0.078，远小于0.5，显示原地衣硬酸与氟康唑联用具有强协同抗真菌的效果。