特异性识别丛蛋白-信号素-整合素结构域的抗RON单克隆抗体的药物呈递作用及其在肿瘤治疗中的应用的制作方法

本发明归属单克隆抗体药物研发领域，内容是特异性识别ron蛋白的“丛蛋白-信号素-整合素结构域”(简称psi)结构域的单克隆抗体在药物呈递以及肿瘤治疗中的应用。

本申请包括抗体成分序列表，通过efs-web以ascii格式提交。其全部内容通过引用并入本文。于2017年9月5日创建的所述ascii拷贝已命名为pcmt2000wo_sl_.txt，大小为13千字节。

发明背景

在不限制本发明范围的条件下，此处重点介绍ron(recepteurd’originenantais)蛋白其及肿瘤生物学背景。

目前ron受体在肿瘤生物学中的作用已通过遗传学、生物化学、肿瘤模型等方法广泛地被认可。来自体外和体内临床前研究的表明：ron蛋白介导的信号传导系统参与多种上皮性肿瘤细胞的恶性生长和侵袭性过程。在胃，结肠，乳腺，前列腺，肺和胰腺组织的肿瘤组织中，ron蛋白以其蛋白含量过表达和形成多种致癌变异体为主要病理特征。

ron蛋白属于受体酪氨酸激酶家族。在乳腺癌，结肠癌，肺癌和胰腺癌等多种类型的肿瘤组织中呈现显著的异型性。主要特点是ron蛋白的过度表达、变异型亚型的产生和信息途径的异常活化。特异性抗体能与癌细胞表面上的ron受体结合并引起ron内吞。

美国授予pereira等人题为“inhibitionofmacrophage-stimulatingproteinreceptor(ron)andmethodsoftreatmentthereof.”(“抑制巨噬细胞刺激蛋白受体(ron)及其治疗方法”)的专利，专利号为8.133.489。简而言之，本专利涉及抑制ron活化的抗体或其片段，包括对巨噬细胞刺激蛋白受体(msp-r或ron)特异性的人源化单克隆抗体，并提供了抑制ron的方法，特别是提及使用抗ron抗体靶向治疗癌症等疾病。

pereira等人也在癌症研究(cancerresearch,volume66,issue18,15september2006,pages9162-9170)发表了题为“therapeuticimplicationsofahumanneutralizingantibodytothemacrophage-stimulatingproteinreceptortyrosinekinase(ron),ac-metfamilymember”(一种针对c-met家族成员巨噬细胞刺激蛋白受体酪氨酸激酶ron的人源化中和抗体及其治疗意义)，该论文报道了通过噬菌体展示技术制备的抗ron抗体对异种移植瘤的体内治疗效应。

题目为“抑制巨噬细胞刺激蛋白受体(ron)”、专利号为no.2009/0246205的美国专利。该专利描述有关调节ron蛋白治疗哺乳动物肿瘤与其他疾病的方法，包括使用抗ron抗体。并公开了包括有关抑制ron活化的人源化抗体在内的特异性抗ron抗体或抗体片段的组合物。

题为“抗ron抗体”专利号为2012/0027773的美国专利，该专利提出了能结合ron并抑制ron活化的单克隆抗体。该抗体可用于治疗与ron活化有关的癌症。

最后，题为“ron抗体及其用途”、专利号为no.2009/0226442的美国专利，提出靶向ron(mstir)的抗体及其用途。特别是在癌症的诊断和治疗中的应用，包括抗体抑制ron及其变异体、片段和衍生物介导的肿瘤存活与增殖。此专利的内容还包括阻断配体msp与ron、ron片段、变异体或衍生物结合的抗体。本专利包含编码上述抗体或其片段，变异或衍生物的多核苷酸，以及包含多核苷酸的载体和宿主细胞。本专利还包括使用该抗体来诊断和治疗癌症。

尽管抗ron抗体及其用途众所周知，但我们仍然需要进一步改进和研发可用于肿瘤治疗的抗ron抗体。

技术实现要素：

本发明的第一个应用方案，包括在制备的h5b14或pcm5b14的单克隆抗体中，纯化出能特异性识别人ron的plexin-semaphorin-integrin(psi)结构域的单克隆抗体或其结合片段。首先，将单克隆抗体或其结合片段的基因序列插入人或人源化基序的互补决定区(cdr)序列，其中免疫球蛋白重链可变区cdrh1、cdrh2、cdrh3由选自seqidno：7、8、9的单克隆抗体序列分别或保守地进行替换；免疫球蛋白轻链可变区的cdrl1、cdrl2和cdrl3由seqidno：10、11、12的单克隆抗体序列分别或保守地进行替换。另一方面，将单克隆抗体或其结合片段与细胞毒性药物偶联，形成抗体-药物偶联物。偶联物中的抗体靶向结合到癌细胞上的ron受体时，通过内吞作用将抗ron抗体和细胞毒性药物一并内吞到细胞中，杀伤肿瘤细胞。此外，抗体或结合片段还可以与细胞毒性蛋白结合。将来，抗体及其结合片段也可与更多的细胞毒性或化疗药物结合。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个应用方案，是在宿主细胞中制备特异性靶向ron的psi结构域的抗体或结合片段的方法。其内容包括：在能表达免疫球蛋白重链可变区多肽或(和)免疫球蛋白轻链可变区多肽的宿主细胞中，表达特异性抗人ron的plexin-scmaphorin-intcgrin(psi)结构域的免疫球蛋白重链可变区多肽或(和)疫球蛋白轻链可变区多肽，从而产生选自h5b14或pcm5b14的抗体或其结合片段，并进行抗体或结合片段的纯化。所有的宿主细胞是h5b14或pcm5b14的杂交瘤细胞。其次，该方法注明将细胞毒性剂或化学治疗剂与抗体或其结合片段偶联或与细胞毒性蛋白质结合制备融合蛋白的步骤。另一方面，宿主细胞可以从细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞中筛选得到。此外，肿瘤可以来自脑，乳腺，子宫颈，胰腺，皮肤、前列腺、肝脏，膀胱，结肠、头颈部，肾，肺，非小细胞肺癌，黑色素瘤，间皮瘤，卵巢，肉瘤、胃，子宫和神经管细胞瘤中。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个应用方案，包括纯化特异性结合人ron的psi结构域的含免疫球蛋白重链可变区或(和)免疫球蛋白轻链可变区的多肽或结合片段，其氨基酸序列与来自h5bi4或pcm5b14的能表达互补决定区(cdr)的单克隆抗体的重链或(和)轻链，至少有95％以上同源性。另一方面，免疫球蛋白重链可变区cdrh1、cdrh2、cdrh3分别来自seqidno：7、8、9单克隆抗体序列；免疫球蛋白轻链可变区的cdrl1、cdrl2和cdrl3分别来自seqidno：10、11、12单克隆抗体序列。在人或人源化框架序列之间插入以上cdr序列。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，在单克隆抗体h5b14或pcm5b14中纯化能特异性结合人ron的plexin-scmaphorin-intcgrin(psi)结构域的抗体或结合片段，随后与能有效抑制或减少肿瘤细胞增殖的细胞毒性药物偶联，形成抗体-药物偶联物，然后将细胞暴露于该抗体药物偶联物中从而实现对肿瘤细胞增殖的抑制和杀伤作用。肿瘤细胞可来源于人或哺乳动物。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，是纯化能特异性结合人ron的psi结构域的抗体或结合片段，纯化抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链可变区与单克隆抗体h5b14或pcm5b14具有至少95％同源性。一方面，免疫球蛋白重链可变区包括：与seqidno：7氨基酸序列相同的cdrh1；与seqidno：8氨基酸序列相同的cdrh2；与seqidno：9氨基酸序列相同的cdrh3。另一方面，免疫球蛋白轻链可变区包含：与seqidno：10氨基酸序列相同的cdrl1；与seqidnos：11氨基酸序列相同的cdrl2；与seqidno：12氨基酸序列相同的cdrl3。同时，cdr序列插入人和人源化框架序列之间。另一方面，抗体重链cdr配对选自seqidno：7、8、9，其轻链cdr配对选自seqidno：10、11、12。此外，抗体表达来自编码免疫球蛋白重链cdrh1，cdrh2和cdrh3的核酸，所述核酸分别选自seqidno：1，2和3。同样，抗体表达来自编码免疫球蛋白轻链cdrl1，cdrl2和cdrl3的核酸，其分别选自seqidno：4，5和6。此外，cdr序列插入人和人源化框架序列之间，框架序列在氨基酸位置27、30、48、67或78处包含至少一个取代，氨基酸编号基于kabat编号系统。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，包括纯化能表达特异性结合人ron的psi结构域的单克隆抗体的核酸，其表达的抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链可变区与单克隆抗体h5b14或pcm5bi4至少有95％同源性。一方面，免疫球蛋白重链可变区包含：编码cdrh1的核酸序列seqidno：1；编码cdrh2的核酸序列seqidno：2；编码cdrh3的核酸序列seqidno：3。免疫球蛋白轻链可变区包含：编码cdrl1的核酸序列seqidno：4；编码cdrl2的核酸序列seqidno：5；编码cdrl3的核酸序列seqidno：6。另一方面，免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区进一步添加编码细胞毒性蛋白并能与免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区形成融合蛋白的核酸序列。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，包括在含有编码免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区核酸的表达载体中加入编码细胞毒性蛋白并与之形成融合蛋白的核酸序列。本发明的另一个使用方案包括构建表达编码免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区载体的宿主细胞。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，包括产生免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区多肽的方法，该方法包括：(a)培养宿主细胞，使之同时表达免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区以及编码细胞毒性蛋白的核酸序列，并在适当条件下使之形成融合蛋白，得到免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区融合细胞毒性蛋白的多肽；(b)纯化包含免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区的多肽。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

本发明的另一个使用方案，包括纯化靶向人ron的psi结构域的抗体或抗体的抗原结合片段，该方法包括：(a)培养宿主细胞，使之同时表达免疫球蛋白重链可变区或(和)轻链可变区以及编码细胞毒性蛋白的核酸序列，并使两者形成融合蛋白，使得宿主细胞表达包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的多肽，从而产生抗体或抗体的抗原结合片段；(b)纯化抗体或抗体的抗原结合片段。人源化抗体从核酸seqidno：13和14表达为氨基酸序列seqidno：15和16。

附图说明

为了更完整地理解本发明的特征和优点，特附上本发明的详细描述以及附图，其中包括：

图1：显示了本发明所制备和产生的特异性识别ron的plexin-semaphorin-integrin(psi)结构域的抗ron单克隆抗体pcm5b14。

图2：显示了来源于pcm5b14的人源化抗ron单克隆抗体(简称h5b14)与ron受体的亲和力；

图3：显示了h5b14在多种癌细胞中强烈地诱导细胞表面ron内吞的作用；

图4：显示了h5b14与细胞毒性化学治疗剂偶联形成用于药物递送的抗体-药物偶联物(例如monomethylauristatine，mmae)的生化结构；

图5：显示了使用疏水相互作用色谱法分析h5b14与细胞毒性化学治疗剂mmae的偶联比例。

图6：显示了h5b14-mmae偶联物对小鼠体重和存活影响的毒理学作用；

图7：显示了h5b14-mmae偶联物在体外对不同类型的人癌细胞系的细胞毒性作用；

图8：显示了h5b14-mmae偶联物在动物模型中对人异种移植瘤的治疗功效；

图9：显示了h5bi4-mmae偶联物在体内对人异种移植瘤小鼠模型中肿瘤重量影响的治疗效果。

本发明的详细说明

虽然下面详细讨论了本发明的各种使用方案的制订和使用，应当理解本发明提供了许多可以在各种具体环境中实施可应用的发明。这里讨论的具体实施案例仅是说明制造和使用本发明的具体方式，并不拓展本发明的范围。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义术语的含义与本发明相关领域的熟练技术人员通常理解的含义一致。诸如“一个”之类的术语并非指在仅指单个实体，而是包括可用于说明特定示例的一般类别。本文中的术语用于描述具体使用方案，但是除了权利要求中所概述的之外，它们的使用不限制本发明。

本发明人开发了许多靶向plexin-semaphorin-integrin(psi)结构域的抗ron单克隆抗体，其在临床前模型中显示出生物学作用和肿瘤治疗效果。识别psi结构域的抗ron单克隆抗体与化学药物偶联后，能高效地向肿瘤细胞递送细胞毒性药物，并靶向杀死癌细胞。在某些情况下ron的psi域可以称为ron^psi。

本文公开的抗ron单克隆抗体可用于治疗各种形式的癌症，例如非小细胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，宫颈癌，结肠直肠癌，肺癌，胰腺癌，胃癌和头颈癌。将癌细胞暴露于有效治疗剂量的抗体中可以抑制或减少癌细胞的增殖。在一些使用方案，抗体抑制癌细胞增殖能力可达到40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。

相对于核苷酸而言，术语“基本上如seqidno：(#)”中所述的序列，“与……类似的序列”，“核苷酸序列”和相似的术语是指基本上对应于本文中定义为seqidno：1的任何部分的序列。这些术语是指合成以及天然衍生的分子，并且具有生物学、免疫学、实验或其他功能上活性相同的序列，例如关于核酸片段的杂交，或编码全部或部分ron^psi抗体的能力。当然，这些术语旨在凸显其序列中的线性次序。

术语“同源性”是指两个核酸互补的程度。同源性分为部分同源与完全同源。部分互补序列是能部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列，并且使用功能性术语“基本上同源”来指代。如本领域技术人员所知的，可以使用杂交或其他测定方法(例如竞争性pcr测定)来测定，当低同源性时也能特异性地测定杂交的程度。

与seqidno:#的抗ron抗体“基本上同源”的寡核苷酸序列，在本文中定义为当序列超过100bp时表现出与seqidno：#寡核苷酸序列有大于或等于75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同源性。通常，保守氨基酸取代将用于修饰所列百分比内的序列。保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的。

术语“基因”指编码功能性蛋白质，多肽或寡肽的单位。如本领域所知的，该功能性术语至少包括部分基因组序列，cdna序列或其片段或组合，以及基因产物，包括可能已被人工改变的基因产物。纯化的基因，核酸，蛋白质等用于指与至少一种通常与其相关的污染核酸或蛋白质分离后的产物。

术语“载体”是指将dna片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子中。载体可以进一步分为设计用于复制特定序列载体，或者作为可与特定序列结合的启动子的表达载体，或者设计为用于引导这种启动子入核的载体。载体可以以独立于宿主细胞染色体的状态存在，或者可以整合到宿主细胞染色体中。

术语“宿主细胞”，“重组细胞”或“重组宿主”是指无论是原核或真核细胞，经过基因工程改造含有外源核酸片段或被修改片段的细胞。因此，基因工程细胞或重组细胞与不包含重组基因的天然细胞是不同的。

术语“融合蛋白”是指由包含至少两个基因核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。例如，融合蛋白可包含与亲和基质结合的多肽和另一方面的多肽。

术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体制剂，以及包括杂合抗体、改造抗体、f(ab')2片段，f(ab)片段，fv片段，单结构域抗体，嵌合抗体，人源化抗体制剂，及具有源抗体分子免疫结合特性的功能片段。

术语“单克隆抗体”是指具有同源抗体群的抗体组合物。该术语不限于抗体的种类或来源，也不限于其制作的方式。该术语包括完整的免疫球蛋白以及其片段，例如fab，f(ab')2，fv和具有源抗体分子免疫结合特性的功能片段。在本发明中，我们已经开发了许多杂交瘤，其与ron的psi结构域(ron^psi)具有独特的结合特性，例如，它们在ron表达细胞例如癌细胞中引发ron特异性内吞。如本文所用，杂交瘤pcm5b14及其产生的抗体pcm5b14。

制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。合适的免疫载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物，脂质聚集体(例如油滴或脂质体)和无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域技术人员所熟知的。此外，抗原可以与细菌类毒素结合，例如来自白喉，破伤风，霍乱等的类毒素，以增强其免疫原性。

通常使用kohler和milstein，nature(1975)256：495-497的方法或其修改方法制备单克隆抗体。通常，免疫小鼠、仓鼠或大鼠。将脾脏和/或大淋巴结分离成单个细胞。然后诱导b细胞和/或分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤(通常是不表达内源性抗体重链和/或轻链的细胞)，并在选择性培养基中培养(例如，次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷培养基，“hat”)。通过有限稀释将得到的单克隆的杂交瘤，进而测定其产生与ron特异性结合的抗体的能力。然后在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(例如，小鼠的腹水)培养筛选后的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

术语“抗体片段”是指抗体的一部分，例如f(ab')2，f(ab)2，fab'，fab等。无论结构如何，抗体片段都能与相同的抗原结合。例如，抗ron单克隆抗体片段与ron的表位结合。

术语“抗体片段”是指能结合特定抗原的合成或基因工程多肽，例如包括轻链可变区的多肽，包括重链和轻链可变区的“fv”片段，重组单链多肽分子，其中轻、重可变区域由肽链连接剂(“scfv蛋白”)和包括模拟高可变区域的氨基酸残基在内的最小识别单元连接。

术语fab'在本文中定义为包含可变结构域的异二聚体和抗体重链的第一恒定结构域的多肽，加上抗体轻链的可变结构域和恒定结构域，以及至少一个额外的氨基酸重链ch1结构域的羧基末端的残基，包括一个或多个半胱氨酸残基。f(ab')2抗体片段是fab'抗体片段对，其通过共价键连接。fab'重链可包括铰链区。这可以是任何所需的铰链氨基酸序列。或者，可以完全省略铰链，有利于单个半胱氨酸残基或短的(约1-10个残基)含半胱氨酸的多肽。在某些应用中，使用常见的天然存在的抗体铰链序列(半胱氨酸后跟两条丙氨酸,然后是另一个半胱氨酸)；该序列存在于人igg1分子的铰链中(e.a.kabat等，免疫学蛋白质序列第3版(美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，1987年))。在其他实施方案中，铰链区选自另一种所需的抗体类别或同种型。在本发明的某些优选实施方案中，fab'的ch1的c末端与序列cysxxx融合，优选为ala，尽管它可以是任何其他残基，例如arg，asp或pro。一个或两个氨基酸残基x也可以被删除。

铰链区是位于天然免疫球蛋白ch1和ch2之间的氨基酸序列或其任何序列变体。其他免疫球蛋白的类似区域，尽管可以理解为铰链区域的大小和序列可能有很大的差异。例如，人类igg1的铰链区域大约只有10个残基，而人类igg3的铰链区域大约有60个残基。

术语fv定义为共价或非共价结合的免疫球蛋白重链和轻链异二聚体，不含恒定结构域。

术语fv-sh或fab'-sh在本文中定义为具有半胱氨酰基硫醇的fv或fab'多肽。游离硫醇位于铰链区，其中参与链间键合的轻链和重链半胱氨酸残基以其天然形式存在。在本发明最优选的实施方案中，fab'-sh多肽组合物不含多相蛋白水解降解片段，并且基本上(大于约90摩尔％)不含fab'片段，其中重链和轻链已被还原或以其它方式衍生化。以免出现在他们的本土状态，例如通过形成异常的二硫化物或巯基加成产物。

术语“嵌合抗体”是指含有可变结构域和源自啮齿动物抗体的互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分源自人的抗体。

术语“人源化抗体”是指能够结合预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其包括基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的fr区和互补决定区(cdr)。基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列或工程化能结合预选抗原的序列。人源化抗体通常也被称为“镶嵌”抗体，其具有重链，轻链或两者的可变区中的cdr。

术语“抗体-药物偶联物”是指抗体或其抗体片段，包括能与ron的psi结构域结合的抗体，与细胞毒性药物、细胞抑制剂和/或治疗剂偶联的抗体衍生物。术语“治疗剂”是指对癌细胞或活化的免疫细胞发挥细胞毒性、细胞抑制和/或免疫调节作用的药剂。治疗剂的非限制性实例包括细胞毒性制剂、化学治疗剂、细胞抑制剂和免疫调节剂。术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。术语“细胞毒性作用”是指使用本发明的耗竭、消除和/或杀死靶细胞。术语"细胞毒性剂"是指本发明的一种对靶细胞有细胞毒性和细胞静止效应的药剂。术语“细胞抑制作用”是指使用本发明的抑制细胞增殖。术语“细胞抑制剂”是指对细胞具有细胞抑制作用的本发明的试剂，能抑制特定细胞的生长和/或增殖。

正如本文所讨论的，考虑抗体或免疫球蛋白多肽的氨基酸序列的微小变化，例如，假设氨基酸序列中的变化保持至少75％，甚至80％,90％,95％,96％,97％,98％、99％和100％同源于重链可变域的人的框架区域。具体而言，在本发明中，如果人源化抗体与人可变结构域和恒定结构域的非cdr部分保持至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的同源性，则人源化抗体被认为是完全人源化的。

氨基酸序列中的某些变化被认为是保守的氨基酸替代。保守替代是具有相似侧链的氨基酸之间的取代。氨基酸一般分为以下几类：(1)非极性：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；(2)酸性：天冬氨酸，谷氨酸；(3)碱性：赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(4)极性：赖氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。其他氨基酸家族包括：丝氨酸和苏氨酸是脂族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是一种含酰胺的家族；丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族；苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是一个芳香族。因此，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构相关氨基酸取代氨基酸将不具有对所得分子的结合或性质的主要影响，特别是如果置换不涉及框架区内的氨基酸。

通过测定多肽衍生物的比活性，可以容易地确定氨基酸变化是否导致功能性肽。本领域普通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物，包括在氨基和羧基末端的取代，包括用例如细胞毒性蛋白制备融合蛋白。还可以通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据(如本文所示)和/或序列数据库来鉴定结构域和功能域。计算机化的比较方法可用于鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中发生的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。通常，保守氨基酸替代不会实质性的改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应倾向于破坏发生在亲本序列中的螺旋，或破坏其他类型的表示亲本序列的辅助结构)。

术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，指大多数但不总是在单细胞悬浮液中或附着于板或组织的细胞，并包括它们的后代。术语“转化物”和“转化细胞”包括主要受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转化的数量。此外，由于有意或无意的突变，所有后代的dna含量可能不完全相同。包括具有与最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物活性的突变后代。

术语“蛋白质”，“多肽”或“肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。

术语“内源性”是指其来源来自细胞内的物质。内源性物质是由细胞的代谢活动产生的。然而，内源性物质可能由于操纵细胞代谢而产生，例如，使细胞表达编码该物质的基因。

术语“外源性”是指其来源于细胞外部的物质。然而，外源物质可以通过本领域技术人员用已知的多种代谢或诱导手段中的任何一种方法而被细胞内化。

术语“基因”用于指功能性蛋白质，多肽或肽的编码单元。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列，cdna序列或其片段或组合，以及基因产物，包括可能已被人工改变的基因产物。纯化的基因，核酸，蛋白质及类似物，在从通常与其相关的至少一种污染核酸或蛋白质中识别和分离时，用于指鉴这些实体。如本文所用的术语“序列”用于指核苷酸或氨基酸，无论是天然的还是人工的，例如修饰过的核酸或氨基酸。当描述“转录的核酸”时，那些位于编码区附近的序列区域5'和3'末端使得脱氧核糖核苷酸序列对应于所包括的蛋白质的全长mrna的长度。术语“基因”包括基因的cdna和基因组形式。基因可以产生多种rna种类，其通过初级rna转录物的差异剪接产生。作为同一基因的剪切体的cdnas将包含序列同一性或完全同源性的区域(代表两个cdna上相同外显子或相同外显子部分的存在)和完全非同一性的区域(例如，表示cdnai上存在外显子"a",其中cdna2包含外显子"b")。因为这两个cdna含有序列一致的区域，它们都将与从整个基因或含有两个cdnas序列的部分基因中获得的探针杂交。因此，两种剪切体与这种探针基本上是同源的。

术语“载体”用于指将dna片段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。本文所用的术语“载体”还包括表达载体，其涉及含有所需编码序列的重组dna分子和在特定宿主生物中表达编码序列所必需的其他适当核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子，操纵子(任选)和核糖体结合位点，通常与其他序列一起。已知真核细胞可利用启动子，增强子、终止和多聚腺核苷酸信号。

术语“药学上可接受”是指适合人和/或动物使用而没有与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性，刺激和过敏反应)的组分。

术语“安全有效量”是指足以产生所需治疗反应的组分的量，而没有与使用时合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性，刺激或过敏反应)。“治疗有效量”是指有效产生所需治疗反应的本发明的药物的量。例如，有效延迟癌症或肉瘤或淋巴瘤的生长或导致癌症缩小或不转移的药物量。具体的安全有效量或治疗有效量将随着所治疗的具体病症、患者的身体状况、所治疗的哺乳动物类型、治疗的持续时间、并发症治疗的性质(如果有的话)，以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构等因素而变化。

术语“药用盐”是指用于制备化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的例子包括但不限于矿物或有机酸盐的基本残留物,如胺；酸性残留物(如酚类)的碱盐或有机盐。最好是用有机或无机酸制成的盐。这些首选的酸性盐是氯化物溴、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸酯、马来酸盐、马来酸盐、柠檬酸、苯甲酸盐、盐酸盐、抗坏血酸等。首选的酚类盐是碱土金属盐、钠、钾或锂。

术语“药物载体”是指药学上可接受的溶剂，悬浮剂或载体，用于将抗ron抗体，及其片段和/或抗体-药物偶联物(adc)，化合物递送至动物或人体内。载体可以是液体或固体，并按照计划的给药方式进行选择。脂质体也是药物载体。

术语“癌症”是指在人和哺乳动物中发现的所有类型的癌症或恶性肿瘤，包括表达ron的癌和肉瘤。癌症比如脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，胰腺癌，皮肤癌，前列腺癌，肝癌，膀胱癌，结肠癌，头颈癌，肾癌，肺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，间皮瘤，卵巢癌，肉瘤，胃癌，子宫癌和髓母细胞瘤等。

特异性识别ron的psi结构域的单克隆抗体的产生：ron细胞外psi结构域在ron活化期间充当铰链，可促进细胞表面ron蛋白内吞作用。覆盖整个ron^psi结构域的含有61个氨基酸的肽用作小鼠免疫的免疫原。筛选识别psi结构域并且能够诱导癌细胞实施强烈的ron蛋白内吞作用的杂交瘤细胞和其产生的单克隆抗体。选择命名为pcm5b14的杂交瘤和其产生的抗体作为主要候选物。图1显示了对ron的psi结构域的特异性单克隆抗体(mab)的产生。

pcm5b14的人源化及其抗体-药物偶联物(adc)的产生：将人源化设计合成的包含来自pcm5b14的5条重链和5条轻链的互补决定区(cdr)序列，分别移植到人igg1/k的框架中进行抗体人源化改造，以产生25种不同的人源化igg1/k分子。分析各个人源化pcm5b14的特异性、灵敏度和亲和力(图2)。最终选择人源化pcm5b14-h2l4(igg1/k，命名为h5b14)为主要研发的抗体。

h5b14诱导癌细胞表面ron内吞中作用的实验证据：使用来自人乳腺癌，结肠癌，肺癌和胰腺癌等15种具有不同ron表达水平的癌细胞系，分析h5b14诱导癌细胞表面ron内吞的有效性。确认h5b14具有强烈诱导ron内吞作用的代表性结果见图3。该结果证实h5b14在诱导ron内吞作用方面非常有效，能够递送足够量的用于杀伤癌细胞的细胞毒性药物。就内吞作用的效力而言，靶向ron的psi结构域的h5b14诱导的ron受体内吞作用(ie50：诱导50％ron内吞所需的最短时间)远远优于其他抗ron抗体。

h5b14与多种细胞毒性药物偶联形成抗体-药物偶联物(adc)和其偶联效应：选择人源化的h5b14用于药物偶联。使用的化学治疗剂包括阿霉素，美登素生物碱衍生物(dm1)，单甲基奥瑞他汀e(mmae)和多卡米星。最终选择与mmae偶联的h5b14(即h5b14-mmae)作为用于进一步研究的adc模型(图4)。如图4所示，h5b14-mmae通过人源化的pcm5b14与mmae通过蛋白酶敏感性二肽接头(mc-peg4-vc-pab)以4：1的药物浓度与抗体比(dar)偶联而成。形成的h5b14-mmae通过使用疏水相互作用色谱法，分析h5b14与mmae的偶联比例分配。图5的结果显示达到抗体分子与mmae一比四的偶联比例分配，符合抗体药物一比四的比例.

h5b14-mmae在动物实验中的最大耐受剂量：将不同剂量的h5b14-mmae分别注射于小鼠体内，观察动物的体重和其他变化。图6的结果显示，h5b14-mmae在小鼠体内的最大耐受剂量为每公斤体重60毫克。远远高于正常的肿瘤治疗剂量。

h5b14靶向递送mmae在体外杀伤癌细胞和体内清除异种移植肿瘤中的疗效：采用乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌等多种人类癌细胞系，在体外实验中证实了h5b14-mmae对癌细胞的杀死作用(图7)。半数有效致死剂量为每毫升1-3微克。此外，通过人的乳腺、结肠、肺和胰腺癌细胞系的异种移植肿瘤模型，验证了h5b14-mmae在体内的高效的癌症治疗作用(图8和图9)。

一种新型的识别ronpsi结构域的人源化抗ron单克隆抗体(h5b14)作为药物递送载体在靶向癌症治疗中的作用的研究总结。

针对ron细胞外psi结构域产生单克隆抗体，强烈诱导ron内化：用含胞外序列中特异性psi结构域的ron蛋白对小鼠进行免疫，筛选了多个杂交瘤细胞并获得了特异性识别psi结构域的抗ron单克隆抗体，其中命名为pcm5b14的克隆被选定为主要候选克隆，产生的抗体能够强烈诱导癌细胞ron蛋白的內吞。

pcm5b14的人源化和抗体-药物偶联物(adc)的制备：将pcm5b14的重链和轻链的互补决定区(cdrs)序列嫁接到人免疫球蛋白igg1/k框架中，生成5个轻链和5个重链，形成h5b14igg1/k分子的25个不同的抗体分子。对每个人源化的pcm5b14亚克隆进行特异性、敏感性和亲和力分析，最终选择人源化的pcm5b14-h2l4(igg1/k,命名为h5b14)进行药物偶联，偶联的药物包括多柔比星，美登素生物碱衍生物(dm1)，单甲基奥瑞他汀e(mmae)和多卡米星等化疗药物。将h5b14与mmae偶联的adc(h5b14-mmae)，作为进一步研究的首选药物。

h5b14-mmae在体外杀伤癌细胞和体内清除异种移植瘤的治疗效果：使用乳腺癌、结肠癌、肺癌和胰腺癌等人类肿瘤细胞系,证实了h5b14-mmae在体外有效杀伤癌细胞的作用。通过人乳腺、结肠、肺和胰腺癌细胞系的异种移植瘤模型，验证了h5b14-mmae在体内的高效抗癌治疗作用。

ron细胞外区域的psi基序作为一个铰链，促进细胞表面ron二聚体化，然后在癌细胞中内化。为制备特异识别ron的psi结构域的单克隆抗体，将覆盖整个psi结构域的氨基酸序列作为小鼠免疫抗原。通过对多种杂交瘤细胞的分析，筛选出一种克隆名称为pcm5b14的单克隆抗体，该抗体能特异性地识别ron的psi结构域，而不与其他同源蛋白发生交叉反应。进而选择pcm5b14作进一步的开发。

上述研究的结果表明：特异性识别psi结构域的抗ron单克隆抗体的产生，为使用h5b14诱导肿瘤细胞ron内吞进行靶向给药提供了新型的药理基础。

dna序列：

cdrsfrompcm5b14vh(重链可变区)：

cdr1:ggctacaccttcacagactatcacatggat(30nt)seqidno:1

cdr2:gacatcaacccaaacaatggcggcgccatctacaatcagaagtttaagggc(51nt)seqidno:2

cdr3:tctcactacgattatgctggaggagcttggttcgcttac(39nt)seqidno:3

cdrsfrompcm5b14vl(轻链可变区)：

cdr1:aagagctcccagagcctgctgttctccggcaaccagaagaattacctggct(51nt)seqidno:4

cdr2:tgggcttctaccagagctagc(21nt)seqidno:5

cdr3:cagcagtactatagcttcccaagaacc(27nt)seqidno:6

氨基酸序列：

cdrsfrompcm5b14vh(重链可变区)：

cdr1:gytftdyhmd(10aa)seqidno:7

cdr2:dinpnnggaiynqkfkg(17aa)seqidno:8

cdr3:shydyaggawfay(13aa)seqidno:9

cdrsfrompcm5b14vl(轻链可变区)：

cdr1:kssqsllfsgnqknyla(17aa)seqidno:10

cdr2:wastras(7aa)seqidno:11

cdr3:qqyysfprt(9aa)seqidno:12

图2显示人源化抗ron单抗pcm5b14(h5b14)与ron受体的特异性亲和力。每个细胞表达19,000个ron分子的结肠癌ht29细胞系用作测试模型。小鼠pcm5b14用作阳性对照。不同浓度的单个h5b14克隆与细胞孵育，加入fitc偶联的抗人igg1抗体。用bd流式细胞仪分析每个样本的荧光强度。图2中的结果是各个h5b14s的剂量依赖性特异性结合力。根据测试结果，我们选择ec50结合亲和力为0.3456ug/ml的h5b14-h2l4作为主要候选克隆。结果表1显示了反映每个h5b14亚克隆对人ron受体结合亲和力和敏感性的数值。

表1不同的h5b14亚型克隆对人类ron受体结合的亲和力和敏感性的数值

这些研究结果表明人源化pcm5b14，包括克隆h2l4，对人ron具有高度特异性和敏感性。图3显示h5b14在强烈诱导癌细胞细胞表面ron受体內吞的作用。

分别使用每个细胞表达10,000至19,000个ron受体分子的ht29，l3.6p1,h358和t-47d癌细胞作模型。将细胞与5ug/ml的h5b14一起温育不同时间，使用小鼠抗ron抗体zt/g4，pcm5b14和人源化zt/g4作为对照。在通过酸性缓冲液除去细胞表面结合的抗体后，通过fitc标记的山羊抗小鼠igg1抗体和抗ron单抗zt/f2检测细胞表面剩余的ron分子。使用bd流式细胞仪分析来自各个样品的免疫荧光强度。将细胞表面ron减少50％所需的最短时间(小时)定义为ec50。

研究的结果表明，对于ron^psi结构域特异的h5b14在诱导癌细胞表面ron内吞方面优异，ec50为5.3至8.2小时，当然这也取决于不同的癌细胞系。表2显示，与其他抗体相比，h5b14克隆在诱导癌细胞表面ron内吞方面具有更好的特性。

表2与其它抗ron抗体比较，人源化抗ron抗体h5b14能更强地诱导癌细胞ron蛋白的内吞作用

图4显示h5b14与细胞毒性化学治疗剂偶联以形成靶向药物递送的抗体-药物偶联物(monomethylauristatine，mmae作为实例)的生物结构。

h5b14可通过多种化学偶联方法与多种细胞毒性化疗药物偶联。图4所示的一个例子是h5b14通过蛋白酶敏感的双肽连接子(maleimidocaproy1-val-cit-pabc，可商品化购买获得)在规定的药物抗体比(dar,4:1)下随机与mmae结合。mmae是一种高效的微管蛋白抑制剂，可阻断细胞有丝分裂导致细胞死亡。

图5为疏水相互作用色谱法分析h5b14与细胞毒性化疗药物的偶合比。图5中，h5bi4-mmae偶联物首先用pc10sephadexg25柱纯化，然后通过0.22um过滤器除菌。使用varianprostar210quaternaryhplc系统与tskbuty1-npr4.6×3.5柱(tosohbiosciences，prussia，pa)交联，通过疏水相互作用色谱验证偶合比。根据分子大小和洗脱时间确定了mmae与h5bi4结合的数量。具有结合不同数量mmae(0～8)的h5b14-mmaes命名为p0～p8。分析结果表明，h5b14通过控制化学反应达到规定的dar，与细胞毒性药物结合是高效的，平均dar为3.76，这是显示对癌细胞最大细胞毒性所必需的。这些研究结果表明，h5b14在规定的药物抗体比下可与多种细胞毒性化疗药物偶合。

图6为h5b14-药物偶联物对小鼠体重和存活的毒理学作用。以小鼠为模型，确定h5b14-mmae的毒性作用及最大耐受剂量(mtd)。balb/c小鼠(每组5只)经尾静脉一次性注射不同剂量h5b14-mmae。测量小鼠个体体重，以获得各组小鼠的平均体重。注射前小鼠体重(18-20g/只)设为100％。每天监测小鼠日常活动、体重和死亡情况。

这些研究结果表明，h5b14-mmae在治疗剂量下对受试小鼠没有毒性。此外，受试小鼠对60mg/kg的h5b14-mmae具有良好的耐受性。增加h5b14-mmae至80mg/kg则对小鼠具有明显的毒性，小鼠的平均体重显著降低。

图7为h5b14-mmae体外对不同类型人癌细胞系的细胞毒性作用，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌在内的12个人类癌细胞系。以不表达ron的癌细胞系作对照。同时，与鼠源的pcm5b14-mmae和zt/g4-mmae(另一种抗ron-adc)进行比较。用不同剂量的h5b14-mmae处理癌细胞72小时，细胞存活率采用标准的mts法测定。这些研究结果表明h5b14-mmae对表达ron的癌细胞具有高度特异性，杀死50％的癌细胞(ic50)所需要的h5b14-mmae的最小量在1ug/ml到3ug/ml之间，这取决于不同的癌细胞系。

图8显示了h5b14-mmae在体内对5种小鼠移植瘤模型的治疗效果。在无胸腺的裸鼠(每组10只裸鼠)中分别建立人结肠癌，肺癌，乳腺癌和胰腺癌四种异种移植瘤模型。每种移植瘤模型的对照小鼠用正常人igg-mmae处理，实验小鼠用单剂量20mg/kg的h5b14-mmae处理。这些研究的结果表明，h5b14-mmae在抑制和/或根除源自不同类型癌细胞的异种移植瘤方面非常有效。计算出的有效抑瘤药物浓度(达到肿瘤生长和肿瘤抑制之间平衡所需的h5b14-mmae的最小剂量，tsc)在1～3mg/kg体重范围内。此外，所有注射h5b14-mmae的小鼠均未观察到任何毒性作用。

图9为h5b14-mmae在体内对荷瘤小鼠瘤体重量的影响。在无胸腺裸鼠(每组10只小鼠)中建立人结肠癌，肺癌，乳腺癌和胰腺癌四种异种移植瘤模型。每种移植瘤模型的对照小鼠用正常人igg-mmae处理，实验小鼠用单剂量20mg/kg的h5b14-mmae处理。在第24天或第32天实验结束时，处死小鼠。收集每组小鼠的肿瘤并称重以获得每组平均肿瘤重量，相应地计算肿瘤生长抑制的百分比。这些研究的结果表明，h5b14-mmae不仅抑制异种移植瘤生长，而且还能根除肿瘤。根据对照组和实验组的平均肿瘤重量，计算出h5b14-mmae的肿瘤生长抑制率在85％到98％之间，这取决于不同的肿瘤模型。

来源于pcm5b14的完整的人源化抗ron单抗h5b14-igg1/k序列(亚型h2l4)

人源化pcm5b14重链(igg1)的完整核苷酸序列：1425nt(seqidno：13)，前导序列加下划线，前导肽加下划线和斜体，cdrs为粗体，ch1-ch2-ch3结构域为斜体。

kozak序列-前导肽-vh(cdr1-cdr2-cdr3)-ch(ch1-ch2-ch3)-终止码

人源化pcm5b14轻链(κ链)的完整核苷酸序列如下：729nt(seqidno：14)，前导序列加下划线，前导肽加下划线和斜体，cdrs结构如粗体所示，cl结构域如斜体所示。

人源化pcm5b14重链(igg1)的完整氨基酸序列如下：472个氨基酸(seqidno.15)。蛋氨酸如下划线所示，*-终止。

人源化pcm5b14轻链(k)的完整氨基酸序列如下：240个氨基酸(seqidno.16)。蛋氨酸如下划线所示，*-终止。

可预期的是，本说明书中所讨论的任何实施方案可以通过本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合来实施，反之亦然。

必须明确理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例说明而不是限制本发明的方法来展示的。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者仅仅利用常规的实验即能够确定，本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请反映了本发明所涉及领域的技术水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请与本专利的关联度。

词语“一个”或“一种”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指供选择物，或供选择物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指供选择物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括装置和用来测定所述值的方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(以及任何形式的“包含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”)或“含有”(以及任何形式的“含有”)是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。如本文所使用的，短语“大体上由..·组成”将权利要求的范围限定至指定的物质或步骤和未在实质上影响要求保护的发明的基本和新颖的特征。如本文所使用的，短语“由...组成”不包括在权利要求中指定的任何元素、步骤或者成分，除了例如通常与元素或限制有关的干扰。

本文所使用的术语“或其组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”意在包括a、b、c、ab、ac、bc或abc中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa,cababb等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中有明显的显示。

如本文所使用的，表示近似的词语如但不限于“约”、“基本的”或者“基本上”指这样的情况，当这样修饰时理解为并非必须是绝对的或者精确的，而应认为是足够地接近本领域技术人员认为与当前的情况一样可以使用的情况。说明书可以变化的程度取决于进行多大的变化之后，仍然使得本领域技术人员认为经改变的特征仍然具有所需的性质和未经改变的特征所具有的能力。总地来说，与前面的讨论一致地，使用表示近似的词语如“约”修饰的数值可以从所宣称的数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15％。

根据本发明的公开内容，在适当的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管已就优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。所有这样相似的对本领域技术人员而言明显的取代和修饰被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。

序列表

<110>王明海

<120>特异性识别丛蛋白-信号素-整合素结构域的抗ron单克隆抗体的药物

<130>pcmt:2000wo

<140>不详

<141>2017-09-01

<150>62/384,989

<151>2016-09-08

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gly

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<213>人源化抗体(homosapiens)

<400>13

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cattcccaggtgcagctggtccagtctggggctgaagtgaagaagcccggcgccaccgtg120

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atctacaatcagaagtttaagggccgggtgaccatcacagctgacacctctacagatacc300

gcctatatggagctgagctccctgagatccgaggacacagccgtgtactattgcgcccgg360

tctcactacgattatgctggaggagcttggttcgcttactggggacagggcacactggtg420

accgtgagccgggcttccaccaagggccctagcgtgtttccactggccccctcttccaag480

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tctcggacaccagaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggatcccgaggtg900

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aatcactatacccagaaatccctgagtctgtcacctggaaagtga1425

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<213>人源化抗体(homosapiens)

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<213>人源化抗体(homosapiens)

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151015

valhisserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslys

202530

proglyalathrvallysilesercyslysvalserglytyrthrphe

354045

thrasptyrhismetasptrpvalglnglnalaproglylysglyleu

505560

glutrpmetglyaspileasnproasnasnglyglyalailetyrasn

65707580

glnlysphelysglyargvalthrilethralaaspthrserthrasp

859095

thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralaval

100105110

tyrtyrcysalaargserhistyrasptyralaglyglyalatrpphe

115120125

alatyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserargalaserthr

130135140

lysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrser

145150155160

glyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheproglu

165170175

provalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhis

180185190

thrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserser

195200205

valvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecys

210215220

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225230235240

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245250255

gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

355360365

gluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlys

370375380

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

385390395400

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405410415

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

420425430

lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser

435440445

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

450455460

leuserleuserproglylys

465470

<210>16

<211>239

<212>prt

<213>人源化抗体(homosapiens)

<400>16

metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

151015

valhissergluilevalmetthrglnserproglythrleuserleu

202530

serproglygluargalathrleusercyslysserserglnserleu

354045

leupheserglyasnglnlysasntyrleualatrptyrglnglnlys

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

alaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisgln

210215220

glyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys

225230235

<210>17

<211>54

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>合成多肽

<400>17

proileargglyproglycysarghispheleuthrcysglyargcys

151015

leuargalatrphisphemetglycysglytrpcysglyasnmetcys

202530

glyglnglnlysglucysproglysertrpglnglnasphiscyspro

354045

prolysleuthrgluphe

50