改善的EBV疫苗的制作方法
致癌的eb病毒(ebv)属于可潜伏感染人b淋巴细胞的γ疱疹病毒家族。ebv在超过90％的人群中建立终身持续的b细胞感染(kieff和b.rickinson.(2006),epstein-barrvirusanditsreplication,ind.m.knipe和p.m.howley(编辑),fieldsvirology,第5版，lippincott-raven,philadelphia,pa.2603–2654；küppers,r.(2003).bcellsunderinfluence:transformationofbcellsbyepstein-barrvirus,nat.rev.immunol.3:801–812)。在健康个体中，大多数ebv感染的b细胞显示出有限的病毒基因表达和静息的表型。潜伏感染的细胞向浆细胞的终末分化导致病毒再激活、产生和b细胞的再感染(laichalk,l.l.,和d.a.thorley-lawson.(2005),terminaldifferentiationintoplasmacellsinitiatesthereplicativecycleofepstein-barrvirusinvivo.j.virol.79:1296–1307)。所有病毒潜伏基因的表达都会引起感染b细胞的生长转化和增殖，这可以反映在体外ebv转化的淋巴母细胞样b细胞系的生长以及ebv与多种b细胞淋巴细胞增生性疾病的关联，包括体内不同类型的淋巴瘤。ebv感染由t细胞控制，如先天性或医源性诱导的t细胞功能障碍患者中ebv相关恶性肿瘤的发生率增加所示(rickinson,a.b.,和e.kieff.(2006),epstein-barrvirus,ind.m.knipe和p.m.howley(编辑),fieldsvirology,第5版.lippincott-raven,philadelphia,pa.,2655–2700)，以及如输注多克隆ebv特异性t细胞系成功治疗造血干细胞移植接收者中ebv相关的移植后淋巴细胞增生性疾病所示(rooney,c.m.,等人,(1998),infusionofcytotoxictcellsforthepreventionandtreatmentofepstein-barrvirus-inducedlymphomainallogeneictransplantrecipients.blood92:1549–1555)。除了诱导b细胞淋巴细胞增生外，还在淋巴瘤和上皮或间充质来源的肿瘤如鼻咽癌或平滑肌肉瘤中检测到ebv，这就是为什么ebv被who国际癌症研究机构(iarc)分类为i类致癌剂的原因。除了表达至少一些病毒潜伏基因外，在这些肿瘤中经常发现染色体畸变，特别是易位。这样的畸变被鉴定为与ebv裂解复制相关(kawanishim.epstein-barrvirusinducesfragmentationofchromosomaldnaduringlyticinfection.journalofvirology67,7654-7658(1993))。
靶细胞的ebv感染需要特定病毒糖蛋白与细胞表面上的受体相互作用以及病毒膜与靶细胞膜的融合。已知ebv与b细胞的结合需要gp350病毒糖蛋白与细胞受体cd21的相互作用。与靶细胞的膜融合由ebv的gp85/gp25/gp42糖蛋白的复合物介导，这些糖蛋白分别由ebv的bxlf2、bkrf2和bzlf2基因编码。此外，已知由病毒balf4基因编码的gp110是感染后病毒颗粒从核内体逃逸所必需的(neuhierl等人(2009),jvirol83(9):4616)；因此，假设gp110的功能对应于单纯疱疹病毒(gb)中的其同源物，即介导病毒膜与核内体膜的融合，从而导致病毒颗粒的被膜和衣壳释放到感染细胞的细胞质中。已知ebv的bnrf1基因编码主要被膜蛋白，该主要被膜蛋白在病毒颗粒从核内体转移至b淋巴细胞的细胞核中起作用(feederle等人(2006),jvirol80(19):9435)。然而，该作用的确切分子基础仍有待阐明。
由于ebv是致癌剂，因此本领域需要开发一种预防或清除ebv感染的疫苗。这种疫苗优选应用于显然是健康的受试者，因此这种疫苗的安全性是一个主要问题。到目前为止，只有一种针对ebvgp350的肽疫苗是市售可获得的。然而，首次使用该疫苗的临床试验表明，其不能预防ebv阴性移植接受者中的ebv感染(reesl,等人(2009),aphaseitrialofepstein-barrvirusgp350vaccineforchildrenwithchronickidneydiseaseawaitingtransplantation.transplantation88(8):1025-9)。
病毒样颗粒(vlp)与成熟病毒粒子是相似或相同的结构，但缺少病毒基因组。通常，其以比例如单体肽更大的程度地刺激宿主的免疫应答，这就是为什么其优先用于针对几种病毒(如乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒)的疫苗接种(greenstone,h.l.,等人(1998),chimericpapillomavirusvirus-likeparticleselicitantitumorimmunityagainstthee7oncoproteininanhpv16tumormodel.proc.natl.acad.sci.usa95:1800–1805；mandic,a.,和t.vujkov.(2004).humanpapillomavirusvaccineasanewwayofpreventingcervicalcancer:adreamorthefuture？ann.oncol.15:197–200)。vlp疫苗方案的关键安全性方面是所使用的vlp必须不含病毒基因组(dna或rna)，因为否则疫苗接种可以诱导病毒复制和/或病毒的潜伏感染。
ebv和其他疱疹病毒的病毒裂解复制(即导致子代病毒颗粒形成的过程)是由不同蛋白质类别的相继激活产生的复杂过程。在裂解复制期间，病毒基因组从不同的复制起点扩增数千次以形成高度分支的结构。然后这些大的多联体转变成单位长度的线性病毒基因组，其被包装到感染细胞的细胞核内的预先形成的前衣壳中。含有病毒dna的衣壳将进一步经历构象和结构变化并作为包膜病毒颗粒从感染细胞排出(egress)(roizman,b.,和d.m.knipe.(2001),herpessimplexvirusesandtheirreplication,ind.m.knipe,p.m.howley,d.e.griffin,r.a.lamb,m.a.martin,b.roizman,和s.e.straus(编辑),fieldsvirology,第4版,第2卷.lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa.,2399–2459)。导致ebv衣壳化的一个重要顺式元件是位于线性基因组两端的末端重复序列(tr)，其参与个体病毒基因组从病毒裂解复制以及其包装期间形成的多联体中切除。已经产生了缺失这些末端重复序列的ebv突变株(deltr-ebv)。已经表明，在诱导裂解周期后，产生大量空的eb-vlp并且基因组衣壳化的效率显著降低，因为与使用对照ebv时的29％相比，用含有deltr-ebv的上清液感染的细胞中只有0.001％表达来自所述基因组的标记基因(feederler,等人(2005),defectiveinfectiousparticlesandrarepackagedgenomesproducedbycellscarryingterminal-repeat-negativeepstein-barrvirus.j.virol.79；7641-7)。这表明末端重复序列是重要的，但对于基因组衣壳化不是绝对必要的。此外，已经表明由deltr-ebv产生的vlp仍然感染细胞，尽管很少，因此不保证deltr-ebvvlp用作疫苗的安全性。因此，为了提高含有ebv颗粒的疫苗的安全性，进一步提出进一步从ebv基因组中缺失编码已知转化蛋白lmp-1、ebna-2、ebna3a、ebna-3b和ebna3c的基因(参见wo2012/025603a1)。
总之，尽管存在需要，但到目前为止还没有开发出用于生产安全有效的针对ebv的疫苗的方法。因此，本发明的技术问题可视为提供允许有效生产ebv疫苗的手段和方法。技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案解决。
因此，本发明涉及用于受试者疫苗接种的包含eb病毒(ebv)颗粒的组合物，其中所述ebv颗粒包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性。
如下所述，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任何任意的语法变体以非排他方式使用。因此，这些术语可以指以下两种情况：除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况；以及存在一个或多个其他特征的情况。作为示例，表述“a具有b”、“a包含b”和“a包括b”可以指以下两种情况：除了b之外，a中不存在其他元素的情况(即，a仅有地且排他地由b组成的情况)；以及除了b之外，在实体a中存在一个或多个其他元素，如元素c、元素c和d或甚至其他元素的情况。
此外，如下文所使用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选的特征一起使用，不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是可选特征，并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用替代特征来进行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似表述引入的特征旨在指可选特征，对本发明的其他实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对于组合以这种方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征的可能性没有任何限制。此外，如果没有另外说明，术语“约”涉及具有相关领域中普遍接受的技术精度的指示值，优选地涉及指示值±20％，更优选±10％，最优选±5％。
如本文所用，术语“显著的”，例如，在显著变化、显著比例和显著降低的上下文中与统计学显著性有关。本领域技术人员可以毫不费力地使用各种众所周知的统计学评估工具(例如确定置信区间、确定p值、学生t检验、mann-whitney检验等)来确定偏差、变化或部分是否具有统计显著性。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.05、0.01、0.005或0.0001。因此，优选地，多肽活性的显著降低优选地涉及活性偏离对照活性的p值为至多0.05，优选至多0.01，更优选至多0.005。类似地，优选地，显著降低的化合物(例如，多肽)的量优选地涉及量偏离对照量的p值为至多0.05、优选至多0.01、更优选至多0.005。
根据与ebv基因及其产物相关的命名法，用于基因的名称也可用于作为所述基因产物的多肽。为清楚起见，如本文所用，术语“x基因”涉及基因x，包括可能包含在其中的开放阅读框及其调节序列；术语“xrna”涉及从x基因转录的rna，“x多肽”涉及作为xrna翻译产物的多肽。术语“x活性”和“x多肽活性”涉及由x多肽介导的活性。如本文所用，具有所述ebv多肽活性的ebv多肽的变体涉及“功能性ebv多肽”，而不具有所述ebv多肽活性的ebv多肽的变体涉及“非功能性ebv多肽”。
如本文所用，术语“组合物”涉及包含至少所示成分的物质的组合物；优选地，还预期该组合物包含一种或多种另外的组分。优选地，该组合物由所示化合物组成。优选地，组合物是药物组合物，更优选地是疫苗，如本文其他地方所述。
术语“eb病毒”和“ebv”是本领域技术人员公知的，其是作为疱疹病毒科、淋巴滤泡病毒属的成员的病毒，也被称为人疱疹病毒4(hhv-4)。ebv的几种亚型是已知的(例如ebv1型:genbank登录号:nc_007605.1gi:82503188；基因组:seqidno:1；dejesuso等人(2003)j.gen.virol.84,1443-1450；和ebv2型:genbank登录号:nc_009334.1gi:139424470；dolana等人(2006)virologyvol.350,164-170),基因组:seqidno:2,包括菌株m81(seqidno:3))。如本文所用，术语“ebv颗粒”包括包含ebv结构多肽并具有整体疱疹病毒颗粒结构的所有颗粒。因此，术语ebv颗粒包括如下文所述的感染性ebv颗粒和eb病毒样颗粒。术语ebv颗粒还包括部分或完全缺少被膜的颗粒，优选包括缺少功能性bnrf1多肽、更优选完全缺少bnrf1多肽的颗粒。
除ebv编码的蛋白质外，ebv颗粒还可包含一种或多种人工多肽。术语“人工多肽”涉及不包含在野生型ebv中的掺入ebv颗粒中的任何多肽。优选地，人工多肽是非天然存在的多肽。可以通过以下步骤评估人工多肽是否掺入ebv颗粒中并因此包含在ebv颗粒中：根据已知的方法获得ebv颗粒，例如通过离心或免疫沉淀从生产细胞中分离ebv颗粒，然后确定所述ebv颗粒中人工多肽的存在，这可以通过例如免疫测定法或适合于特定多肽并且技术人员已知的任何其他方法实现。优选地，人工多肽是融合多肽，其包含疱疹病毒糖蛋白的膜整合部分。在优选的实施方案中，人工多肽还包含可检测标签。术语“可检测标签”是指一段氨基酸，其被添加或导入本发明的融合多肽中。优选地，标签应在c-或n-末端添加到本发明的融合多肽中。所述的氨基酸段应允许通过特异性识别标签的抗体检测融合多肽，或者其应允许形成功能性构象，如螯合剂，或者其应允许通过荧光标签可视化。优选的标签是myc标签、flag标签、6-his标签、ha标签、gst标签或gfp标签。适当的标签在本领域中是公知的。在进一步优选的实施方案中，所述融合蛋白包含含有免疫原性蛋白的氨基酸序列的肽或多肽，所述免疫原性蛋白优选病原微生物的免疫原性蛋白，更优选ebv蛋白，最优选潜伏的ebv蛋白。
然而，本发明还预期ebv颗粒中缺少一种或多种非必需ebv多肽。在本说明书的上下文中，“非必需ebv多肽”涉及掺入野生型ebv颗粒中的多肽，但其对于形成这种颗粒不是必需的。因此，优选地，非必需ebv多肽是对形成如本文所述的ebv颗粒不是必需的ebv多肽；因此，优选的非必需ebv多肽是对形成感染性ebv颗粒不是必需的、并且对形成eb-vlp不是必需的ebv多肽。因此，ebv末端重复序列、bflf1基因和bbrf1基因是本文所用的非必需ebv多肽。如果在生产细胞中不存在这种多肽的情况下，通过电子显微镜或本领域技术人员已知的用于检测ebv颗粒的其他方法(包括，例如，ebv颗粒与合适的宿主细胞结合、用ebv颗粒感染合适的宿主细胞等)之一可检测到ebv颗粒，则该多肽是非必需的。在ebv裂解感染期间如何从宿主细胞中除去多肽的方法是本领域技术人员所熟知的。优选地，通过从病毒基因组中缺失编码所述多肽的基因或通过遗传操作的方法使所述基因不可表达而除去多肽，例如，通过使起始密码子突变为非起始密码子的方法。
优选地，非必需ebv多肽是如下文所述的ebv成融(fusogenic)多肽；因此，优选地，包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒还缺少如下文所述的一种或多种ebv成融多肽。
还优选地，非必需ebv多肽是转化ebv多肽。因此，优选地，ebv颗粒还缺少至少一种转化ebv多肽。术语“转化ebv多肽”是本领域技术人员已知的，其涉及由ebv基因组编码的多肽，并且当存在于宿主细胞中时，特别是存在于可感染的人细胞如b细胞中时，其诱导细胞进入一种转化状态，在这种转化状态中增殖不依赖于所述类型的正常细胞所需的至少一些生长信号。因此，优选地，转化ebv多肽是使得许可宿主细胞进入癌症样增殖状态的ebv多肽。优选地，转化ebv多肽选自以下列表：lmp-1多肽、lmp-2多肽、ebna-2多肽、ebna-3a多肽和ebna-3c多肽。还优选地，ebv颗粒缺少多于一种的转化ebv多肽，更优选ebv多肽中缺少至少两种、甚至更优选至少三种、甚至更优选至少四种转化ebv多肽。最优选地，ebv多肽缺少五种转化ebv多肽，优选lmp-1多肽、lmp-2多肽、ebna-2多肽、ebna3a多肽和ebna-3c多肽。如本文所用，术语“转化ebv多肽”优选不包括bnrf1多肽。
本文所用的术语“eb病毒样颗粒”或“eb-vlp”是指衍生自ebv的病毒颗粒，其中小于1％，优选小于0.1％，更优选小于0.01％的所述颗粒包含ebvdna；更优选地，小于1％，优选小于0.1％，更优选小于0.01％的所述颗粒包含dna。因此，优选地，eb-vlp既不是裂解复制的也不是在合适的宿主细胞中建立潜伏感染的。优选地，eb-vlp具有整体疱疹病毒结构，如通过电子显微镜分析的。优选地，eb-vlp至少包含衣壳和外膜。优选地，eb-vlp包含本领域技术人员已知的针对已知ebv类型(优选如上文所述的ebv类型)的颗粒形成所必需的ebv结构蛋白(例如，衣壳、包衣、壳、表面或包膜蛋白和糖蛋白)。
术语“受试者”涉及针对生物体外来分子具有产生免疫应答能力的后生动物生物体。优选地，受试者是动物，更优选哺乳动物，甚至更优选人或实验动物，特别是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、仓鼠、绵羊、山羊、马、牛、驴，最优选是人。优选地，在应用本发明的方法后处死实验动物。
如本文所用，术语“疫苗接种”涉及施用抗原物质以刺激受试者的免疫系统以产生适应性免疫。优选地，疫苗接种是治疗性或预防性疫苗接种。如本文其他地方所述，ebv颗粒可包含一种或多种非ebv多肽；因此，包含至少一种非ebv免疫原性表位的ebv颗粒可用于针对非ebv抗原疫苗接种受试者。优选地，所述非ebv抗原是感染剂，更优选非ebv病毒、细菌或真核感染剂或其中包含的免疫原性结构。优选地，非ebv抗原是疱疹病毒，特别是单纯疱疹病毒、巨细胞病毒或人疱疹病毒8。更优选地，疫苗接种是针对ebv感染的疫苗接种。
治疗性疫苗接种是指施用疫苗接种以在显著程度上改善或治愈本文提及的受试者的疾病或病患或其伴随的症状。在本文提及的疾病或病患方面，治疗性疫苗接种可以导致完全恢复健康。应理解，根据本发明使用的治疗性疫苗接种可能不是对所有受试者都有效。然而，优选地，该术语要求可以成功治疗统计学显著部分的患有本文提及的疾病或病患的受试者。使用本说明书中其他地方讨论的各种公知的统计学评估工具，本领域技术人员可以毫不费力地确定某部分是否是统计学显著的。优选地，治疗性疫苗接种应该对给定群组或群体受试者中的至少25％、更优选至少50％、还更优选至少80％、最优选至少90％有效。
预防性疫苗接种涉及施用疫苗接种以在本文中提及的疾病或病患方面保持受试者持续一段时间的健康，优选保持受试者终身健康。应当理解，所述时间段可以取决于已施用的ebv颗粒的量和本说明书中其他地方讨论的受试者的个体因素。应当理解，预防性疫苗接种可能不是对所有用根据本发明的ebv颗粒处理的受试者都有效。然而，优选地，该术语要求可以有效预防统计学显著部分的群组或群体受试者免受本文提及的疾病或病患或其伴随症状。优选地，在该上下文中预期群组或群体受试者通常(即，在没有根据本发明的预防性疫苗接种时)将发展出本文提及的疾病或病患。使用本说明书中其他地方讨论的各种公知的统计学评估工具，本领域技术人员可以毫不费力地确定某部分是否是统计学显著的。优选地，预防性疫苗接种应该对给定群组或群体受试者中的至少25％、更优选至少50％、还更优选至少80％、最优选至少90％有效。
用常规ebv疫苗进行疫苗接种具有诱导接种疫苗的受试者中细胞转化的风险。然而，由于本发明的疫苗不诱导染色体畸变，并且由于在优选的实施方案中，本发明的疫苗缺少功能性ebvdna和/或转化ebv多肽，因此本文提出的疫苗提供了良好的安全性谱，也可用于非终末疾病受试者。出于同样的原因，可以预期对年轻受试者进行疫苗接种。因此，优选地，接种疫苗的受试者是年龄小于其平均预期寿命的一半，优选小于四分之一，更优选小于五分之一，最优选小于十分之一的受试者。更优选地，受试者是小于18岁的人，优选小于15岁，更优选小于10岁，最优选小于5岁。还优选地，受试者患有免疫缺陷和/或计划进行免疫抑制治疗。因此，优选地，受试者是未来的移植接收者。更优选地，受试者是未来的器官移植和/或造血干细胞移植接受者，优选是同种异体造血干细胞移植接收者，更优选是同种异体骨髓移植接收者。优选地，根据本发明的疫苗接种包括避免诱导染色体畸变。
如本文所用，术语“诱导染色体不稳定性的ebv多肽”涉及由野生型ebv基因组编码并具有诱导宿主细胞基因组不稳定性的活性的多肽。优选地，所述诱导染色体不稳定性的ebv多肽是ebv的被膜多肽。因此，优选地，诱导染色体不稳定性的ebv多肽包含在ebv颗粒中。优选地，诱导染色体不稳定性的ebv多肽是ebv的bnrf1多肽、bplf1多肽、bglf3多肽、brrf2多肽、bkrf4多肽或bxlf1多肽。更优选地，诱导染色体不稳定性的ebv多肽是ebv的bnrf1多肽或bplf1多肽；最优选地，诱导染色体不稳定性的ebv多肽是bnrf1多肽。用于确定诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的手段和方法在本文实施例中描述；优选地，如本文实施例中所述，通过在细胞中过量产生感兴趣基因并与对照比较诱导的染色体畸变的数量来确定所述活性。如本文所用，具有上述活性(特别是诱变活性)的诱导染色体不稳定性的ebv多肽的变体涉及“功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽”，而不具有上述活性(特别是诱变活性)的诱导染色体不稳定性的ebv多肽的变体涉及“非功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽”。因此，例如，优选地，具有上述活性(特别是诱变活性)的bnrf1多肽的变体涉及“功能性bnrf1多肽”，而不具有上述活性(特别是诱变活性)的bnrf1多肽的变体涉及“非功能性bnrf1多肽”。
术语“bnrf1”对于技术人员而言是已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhin片段上可鉴别的第一向右阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“bnrf1”包括来自其他ebv株的bnrf1同源物。优选地，bnrf1是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的bnrf1。优选地，如上文所述，术语“bnrf1多肽”涉及作为bnrf1rna翻译产物的多肽，该多肽也称为ebv的“主要被膜蛋白”或“p140”。可以理解，bnrf1rna和bnrf1多肽都是bnrf1基因的产物(即bnrf1基因产物)。原型ebv株b95-8的bnrf1多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：cad53384.1gi：23893579下获得，b型ebv株p3hr1的bnrf1多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：caa47987.1gi：59166下获得。b型ebv株p3hr1的bnrf1基因的核酸序列可在genbank登录号：x67777.1gi：59165下获得。bnrf1多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“bnrf1活性”涉及由bnrf1多肽介导的活性。优选地，bnrf1活性是bnrf1多肽介导其自身向宿主细胞的细胞核转运的活性和/或其诱变活性，如本文实施例中所述。更优选地，bnrf1活性是bnrf1多肽的诱变活性，最优选是bnrf1在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。用于确定bnrf1介导其自身向宿主细胞的细胞核转运的活性的手段和方法是本领域技术人员已知的，例如，从包含bnrf1多肽或其变体的细胞中分离细胞核，并且例如，通过免疫学方法测定所述分离的细胞核的bnrf1含量。在本文的实施例中描述了测定bnrf1诱变活性的方法。优选地，缺少bnrf1活性的ebv颗粒是由包含seqidno：4所示的核酸序列的ebv基因组产生的ebv株m81颗粒。
术语“bplf1”对于技术人员而言是已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhip片段上可鉴别的第一向左阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“bplf1”包括来自其他ebv株的bplf1同源物。优选地，bplf1是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的bplf1。优选地，如上文所述，术语“bplf1多肽”涉及作为bplf1rna翻译产物的多肽，该多肽也称为ebv的“大被膜蛋白deneddylase”。可以理解，bplf1rna和bplf1多肽都是bplf1基因的产物(即bplf1基因产物)。原型ebv株b95-8的bplf1多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：cad53402.1gi：23893598下获得。bplf1多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“bplf1活性”涉及由bplf1多肽介导的活性。优选地，bplf1活性是bplf1多肽介导其自身向宿主细胞的细胞核转运的活性和/或其诱变活性，如本文实施例中所述。更优选地，bplf1活性是bplf1多肽的诱变活性，最优选是bplf1在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。用于测定bplf1介导其自身向宿主细胞的细胞核转运的活性的手段和方法是本领域技术人员已知的，例如，从包含bplf1多肽或其变体的细胞中分离细胞核，并且，例如通过免疫学方法测定所述分离的细胞核的bplf1含量。本文在实施例中描述了测定bplf1诱变活性的方法。
术语“bglf3”对于技术人员而言是已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhig片段上可鉴别的第三向左阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“bglf3”包括来自其他ebv株的bglf3同源物。优选地，bglf3是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的bglf3。优选地，如上文所述，术语“bglf3多肽”涉及作为bglf3rna翻译产物的多肽。可以理解，bglf3rna和bglf3多肽都是bglf3基因的产物(即bglf3基因产物)。原型ebv株b95-8的bglf3多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：yp_401689.1gi：82503245下获得。bglf3多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“bglf3活性”涉及由bglf3多肽介导的活性。优选地，bglf3活性是bglf3多肽的诱变活性，最优选是bglf3在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。本文在实施例中描述了用于测定bglf3活性的手段和方法。
术语“brrf2”是技术人员已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhir片段上可鉴别的第二向右阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“brrf2”包括来自其他ebv株的brrf2同源物。优选地，brrf2是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的brrf2。优选地，如上文所述，术语“brrf2多肽”涉及作为brrf2rna翻译产物的多肽。可以理解，brrf2rna和brrf2多肽都是brrf2基因的产物(即brrf2基因产物)。原型ebv株b95-8的brrf2多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：p03210.1gi：141396下获得。brrf2多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“brrf2活性”涉及由brrf2多肽介导的活性。优选地，brrf2活性是brrf2多肽的诱变活性，最优选是brrf2在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。本文在实施例中描述了用于测定brrf2活性的手段和方法。
术语“bkrf4”是技术人员已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhik片段上可鉴别的第四向右阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“bkrf4”包括来自其他ebv株的bkrf4同源物。优选地，bkrf4是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的bkrf4。优选地，如上文所述，术语“bkrf4多肽”涉及作为bkrf4rna翻译产物的多肽。可以理解，bkrf4rna和bkrf4多肽都是bkrf4基因的产物(即bkrf4基因产物)。原型ebv株b95-8的bkrf4多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：p30117.1gi：267499下获得。bkrf4多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“bkrf4活性”涉及由bkrf4多肽介导的活性。优选地，bkrf4活性是bkrf4多肽的诱变活性，最优选是bkrf4在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。本文在实施例中描述了用于测定bkrf4活性的手段和方法。
术语“bxlf1”是本领域技术人员已知的，其涉及在ebv株b95-8的bamhix片段上可鉴别的第一向左阅读框；为避免疑义，如本文所用，术语“bxlf1”包括来自其他ebv株的bxlf2同源物。优选地，bxlf1是来自ebv株b95-8、p3hr1或m81的bxlf1。优选地，如上文所述，术语“bxlf1多肽”涉及作为bxlf1rna翻译产物的多肽，也称为ebv胸苷激酶。可以理解，bxlf1rna和bxlf1多肽都是bxlf1基因的产物(即bxlf2基因产物)。原型ebv株b95-8的bxlf1多肽的氨基酸序列可在genbank登录号：yp_401701.1gi：82503257下获得。bxlf1多肽和基因的其他序列可在公共数据库中获得。术语“bxlf1活性”涉及由bxlf1多肽介导的活性。优选地，bxlf1活性是bxlf1多肽的诱变活性，最优选是bxlf1在宿主细胞中诱导染色体畸变的活性。本文在实施例中描述了用于测定bxlf1活性的手段和方法。
根据上文，表述“包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒”涉及如本文所述的ebv颗粒，其包含诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性，所述ebv多肽活性与在未修饰的(优选野生型)诱导染色体不稳定性的ebv多肽基因存在下所产生的ebv颗粒相比，以统计学显著的方式降低。优选地，包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒是不包含可检测的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒。更优选地，包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒是不包含通过本文实施例中所述方法在106个颗粒中可检测的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒。如本文所用，该术语涉及感染的宿主细胞所暴露的所有诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的降低；如技术人员所理解的，可以通过将活性诱导染色体不稳定性的ebv多肽导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中、通过将具有翻译能力的编码诱导染色体不稳定性的ebv多肽的rna导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中、和/或通过将可表达的诱导染色体不稳定性的ebv多肽的编码基因导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中，引起宿主细胞暴露于诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性。如技术人员所理解的，包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒可包含如本文所述的非功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽；和/或编码非功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽的诱导染色体不稳定性的ebv多肽编码rna；和/或编码非功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽的诱导染色体不稳定性的ebv多肽编码基因。
因此，例如，优选地，表述“包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒”涉及如本文所述的ebv颗粒，其包含与在未修饰的(优选野生型)bnrf1基因存在下所产生的ebv颗粒相比，以统计学显著的方式降低的bnrf1活性。优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒是不包含可检测的bnrf1活性的ebv颗粒。更优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒是不包含通过本文实施例中所述的方法在106个颗粒中可检测的bnrf1活性的ebv颗粒。如本文所用，该术语涉及感染的宿主细胞所暴露的所有bnrf1活性的降低；如技术人员所理解的，可以通过将活性bnrf1多肽导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中、通过将具有翻译能力的bnrf1rna导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中、和/或通过将可表达的bnrf1基因导入宿主细胞的细胞质和/或细胞核中，引起宿主细胞暴露于bnrf1活性。如技术人员所理解的，使宿主细胞暴露于bnrf1活性还可包括将bnrf1基因产物导入细胞器，特别是中心体。如本文所用，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒优选包含量显著减少的bnrf1多肽，更优选不包含功能性bnrf1多肽，最优选不包含bnrf1多肽。还优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒包含量显著减少的bnrf1rna，更优选不包含编码功能性bnrf1多肽的rna，最优选不包含编码bnrf1多肽的rna。还优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒包含量显著减少的bnrf1基因，更优选不包含编码功能性bnrf1多肽的基因，最优选不包含编码bnrf1多肽的基因。更优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒优选包含量显著减少的bnrf1多肽和bnrf1rna，更优选不包含功能性bnrf1多肽和bnrf1rna，最优选不包含bnrf1多肽和bnrf1rna。最优选地，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒优选包含量显著减少的bnrf1多肽、bnrf1rna和bnrf1基因，更优选不包含功能性bnrf1多肽、bnrf1rna以及bnrf1基因，最优选不包含bnrf1多肽、bnrf1rna和bnrf1基因。因此，优选地，ebv颗粒不包含bnrf1基因产物。因此，ebv颗粒优选由ebv基因组产生，所述ebv基因组缺少可功能性表达的bnrf1基因，优选缺少可表达的bnrf1基因。如技术人员所理解的，包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒可包含如本文所述的非功能性bnrf1多肽；和/或编码非功能性bnrf1多肽的bnrf1rna；和/或编码非功能性bnrf1多肽的bnrf1基因。
优选地，包含ebv颗粒的组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”涉及包含药学上可接受形式的一种或多种本发明化合物和药学上可接受的载体的组合物。本发明的化合物可以配制成药学上可接受的盐。可接受的盐包括乙酸盐、甲酯、hcl、硫酸盐、氯化物等。药物组合物优选局部施用，或更优选全身施用。通常用于药物施用的合适施用途径是口服、静脉内或肠胃外施用以及吸入。优选地，本发明的药物组合物通过肠胃外途径施用，优选皮下、肌肉内、鼻内或腹膜内施用。在受试者是人的情况下，优选肌肉内施用。然而，多核苷酸化合物也可以通过使用病毒载体、病毒或脂质体以基因治疗方法施用，并且还可以(例如，作为药膏)局部施用。此外，该化合物可以与其他药物组合、在共同的药物组合物中或作为分开的药物组合物施用，其中所述分开的药物组合物可以以各部分的试剂盒的形式提供。特别地，如本文其他地方所述，预期佐剂的共同施用。优选地，ebv颗粒和药物组合物以冻干形式提供。
该化合物优选以常规剂型施用，所述常规剂型通过根据常规步骤将药物与标准药物载体组合制备。根据所需制剂的情况，这些步骤可包括将成分混合、制粒和压缩或溶解。应当理解，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的类型和量、施用途径和其他众所周知的变量。
在与制剂的其他成分相容并且对其接受者是无害的意义上而言，载体必须是可接受的。所用的药物载体可以是例如固体、凝胶或液体。固体载体的实例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油如花生油和橄榄油、水、乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域公知的延时材料，如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上述那些和本领域熟知的其他载体，参见例如remington′spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pennsylvania。
优选地选择稀释剂以便不影响ebv颗粒、免疫原性多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞以及潜在的其他药物活性成分的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和hank溶液。此外，药物组合物或制剂还可包括其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
有效剂量是指用于本发明药物组合物中的化合物的量，其引发受试者免疫的效果。化合物的治疗功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序确定，例如通过测定ed50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和/或ld50(对群体的50％致死的剂量)。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比率ld50/ed50。
剂量方案将由主治医师确定，优选考虑相关的临床因素，并且优选地，根据本文其他地方描述的任何一种方法。如在医学领域中众所周知的，对于任何一名患者的剂量可取决于许多因素，包括患者的体重(size)、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、以及同时施用的其他药物。然而，也可以建立适合于特定物种，特别是人的免疫的标准剂量。可以通过定期评估来监测成功的免疫。典型的剂量可以是，例如，优选每次免疫1μg至10000μg；然而，可以预期低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。本文提及的药物组合物和制剂至少施用一次以建立免疫。然而，所述药物组合物可以施用多于一次以上，例如两次至四次。此外，可以预期加强免疫以建立或维持长期免疫。
具体的药物组合物以药学领域熟知的方式制备，其至少包含作为活性化合物的ebv颗粒、多核苷酸、载体或宿主细胞的混合物或以其他方式与药学上可接受的载体或稀释剂组合。为了制备这些特定的药物组合物，通常将一种或多种活性化合物与载体或稀释剂混合，或包封或包裹在胶囊、小袋、扁囊、纸或其他合适的容器或载体中。所得制剂应采用施用模式，即片剂、胶囊、栓剂、溶液、悬浮液等形式。处方者或用户说明书中应指明剂量推荐应，以便根据所考虑的接受者预测剂量调整。
有利地，在本发明的基础工作中发现，通过从ebv颗粒中除去诱导染色体不稳定性的ebv多肽，可以避免例如在感染ebv的细胞中诱导染色体畸变。此外，进一步发现，通过防止ebv颗粒进入细胞的细胞质和/或细胞核中(例如通过防止病毒膜与细胞膜融合)，可以避免ebv颗粒诱导的染色体不稳定性。因此，发现通过提供不向细胞的细胞质和/或细胞核中导入诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒，可以产生包含ebv颗粒(特别是ebvlp)的更安全的疫苗。
上述定义加上必要的变更适用于以下内容。以下进一步进行的另外的定义和解释也适用于本说明书中描述的所有实施方案，加上必要的变更。
本发明进一步涉及用于受试者疫苗接种的包含ebv颗粒的组合物，其中所述疫苗接种包括避免使所述受试者的细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触，优选避免与bnrf1活性接触。
如本文所用，术语“避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触”涉及如上文所述，通过选择合适的ebv颗粒用于疫苗接种，来积极确保细胞的细胞质和/或细胞核不与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触，优选不与bnrf1活性接触。
优选地，通过施用包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒，更优选不包含可检测的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒，用于疫苗接种，实现避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触。如将理解的，为了避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触，优选地，仅施用不包含可检测的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性的ebv颗粒。更优选地，避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与功能性诱导染色体不稳定性的ebv基因产物接触，优选包括避免使所述受试者与功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽接触。更优选地，避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与功能性bnrf1基因产物接触，优选包括避免使所述受试者与功能性bnrf1多肽接触。更优选地，避免使细胞的细胞质和/或细胞核与bnrf1活性接触包括避免使所述受试者与bnrf1基因产物接触，优选包括避免使所述受试者与bnrf1多肽接触。
还优选地，通过施用不包含可检测的ebv成融多肽活性的ebv颗粒，实现避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触。如本文所用，术语“ebv成融多肽”和“成融ebv多肽”涉及由ebv基因组编码的多肽，其具有介导或辅助ebv膜与细胞膜融合的活性。优选地，ebv成融多肽是融合所必需的多肽；即，是这样的多肽：当从ebv颗粒中除去时，导致所述ebv颗粒是非成融的。鉴定ebv成融多肽的方法是本领域已知的，包括例如，从ebv基因组中除去感兴趣基因并观察所得ebv颗粒的感染性。优选地，所述鉴定方法还包括检测ebv颗粒是否在靶细胞的核内体囊泡中积累。优选地，所述ebv成融多肽是包含在ebv颗粒膜中的多肽。因此，优选地，ebv成融多肽包含在ebv颗粒中。优选地，ebv成融多肽是ebv的balf4多肽、bxlf2多肽、bkrf2多肽或bzlf2多肽。更优选地，成融多肽是ebv的balf4多肽或bxlf2多肽；最优选地，成融ebv多肽是balf4多肽。用于确定ebv成融多肽活性的手段和方法是本领域已知的。如本文所用，具有上述融合活性的ebv成融多肽的变体是指“功能性ebv成融多肽”，而不具有上述融合活性的ebv成融多肽的变体是指“非功能性ebv成融多肽”。因此，例如，优选地，具有上述融合活性的balf4多肽的变体是指“功能性balf4多肽”，而不具有上述融合活性的balf4多肽的变体是指“非功能性balf4多肽”。还优选地，可以施用缺少ebv成融多肽活性(优选如本文其他地方所述的balf4活性)的ebv颗粒。
优选地，ebv成融多肽是bxlf2多肽，即技术人员已知的ebv的“gp85”或“bxlf2蛋白”的多肽。来自ebv株b95.8的bxlf2多肽的氨基酸序列保藏在genbankaccno：cad53450.1gi：23893646；此外，来自其他ebv株的同源物的其他氨基酸序列可在公共数据库中获得。此外，编码bxlf2多肽的基因可在公共数据库中获得。因此，技术人员例如，通过序列比对能够确定多肽是否是bxlf2多肽。此外，技术人员例如，根据已知方法的核酸杂交能够鉴定新的bxlf2基因。
还优选地，ebv成融多肽是bkrf2多肽，即技术人员已知的ebv的“gp25”或“bkrf2蛋白”的多肽。来自ebv株b95.8的bkrf2多肽的氨基酸序列保藏于genbankaccno：p03212.1gi：140976；此外，来自其他ebv株的同源物的其他氨基酸序列可在公共数据库中获得。此外，编码bkrf2多肽的基因可在公共数据库中获得。因此，技术人员例如，通过序列比对能够确定多肽是否是bkrf2多肽。此外，技术人员例如，根据已知方法的核酸杂交能够鉴定新的bkrf2基因。
还优选地，ebv成融多肽是bzlf2多肽，即技术人员已知的ebv的“gp42”或“bzlf2蛋白”的多肽。来自ebv株b95.8的bzlf2多肽的氨基酸序列保藏在genbankaccno：cad53422.1gi：23893618；此外，来自其他ebv株的同源物的其他氨基酸序列可在公共数据库中获得。此外，编码bzlf2多肽的基因可在公共数据库中获得。因此，技术人员例如，通过序列比对能够确定多肽是否是bzlf2多肽。此外，技术人员例如，根据已知方法的核酸杂交能够鉴定新的bzlf2基因。
更优选地，ebv成融多肽是balf4多肽，即技术人员已知的ebv的“gp110”、“gp125”或“balf4蛋白”的多肽。来自ebv株b95.8的balf4多肽的氨基酸序列保藏于genbankaccno：p03188.1gi：138191；此外，来自其他ebv株的同源物的其他氨基酸序列可在公共数据库中获得。此外，编码balf4多肽的基因可在公共数据库中获得。因此，技术人员例如，通过序列比对能够确定多肽是否是balf4多肽。此外，技术人员例如，根据已知方法的核酸杂交能够鉴定新的balf4基因。术语“balf4活性”涉及由balf4多肽介导的活性。优选地，balf4活性是balf4多肽在感染后介导ebv颗粒从核内体逃逸和ebv被膜多肽和衣壳进入细胞质的活性。用于确定balf4活性的手段和方法是技术人员已知的。根据以上所述，表述“不包含可检测的balf4活性的ebv颗粒”涉及如本文所述的ebv颗粒，其不包含通过本文所述的方法可检测的balf4活性。因此，如本文所用，不包含可检测的balf4活性的ebv颗粒优选不含功能性balf4多肽，更优选不含balf4多肽。还优选地，包含显著降低的balf4活性的ebv颗粒不含编码功能性balf4多肽的基因，更优选不含编码balf4多肽的基因。还优选地，不包含可检测的balf4活性的ebv颗粒不含功能性balf4多肽和balf4基因，最优选不含balf4多肽和balf4基因。因此，优选地，ebv颗粒不含balf4基因产物。因此，ebv颗粒优选由缺少可功能性表达的balf4基因(优选缺少可表达的balf4基因)的ebv基因组产生。还优选地，避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与包含gp85、gp25、gp42和/或gp110活性的ebv颗粒接触。更优选地，避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与包含gp110活性的ebv颗粒接触。因此，优选地，组合物包含显著降低的bnrf1活性和/或显著降低的gp110活性，优选缺少bnrf1活性和/或缺少gp110活性。更优选地，组合物包含具有显著降低的bnrf1活性和/或具有显著降低的gp110活性的ebv颗粒，最优选组合物包含缺少bnrf1活性和/或缺少gp110活性的ebv颗粒。
本发明还涉及用于受试者疫苗接种的编码ebv颗粒的多核苷酸，所述ebv颗粒包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性。
此外，本发明涉及编码ebv基因组的多核苷酸，其中所述ebv基因组
a)缺少编码活性诱导染色体不稳定性ebv多肽的基因和/或缺少编码活性ebv成融多肽的基因，和
b)缺少ebv末端重复序列和/或缺少至少一种选自bflf1基因和bbrf1基因的可功能性表达基因。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指线性或环状核酸分子。优选地，本发明的多核苷酸应作为分离的多核苷酸(即从其天然环境中分离)或以遗传修饰的形式提供。该术语包括单链和双链多核苷酸。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸，如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修饰的衍生物，如生物素化的多核苷酸。
优选地，在编码ebv基因组的多核苷酸中，通过导入至少一个核苷酸的缺失、添加和/或取代来修饰至少一个如本文所述的基因，导致由所述基因产生的蛋白质的截短、破坏或突变。这些修饰包括导致终止密码子产生的基因中的点突变以及导致开放阅读框移位的修饰。产生的这些多肽异常短或异常长并且不具有野生型多肽的活性，优选地，不具有生物功能。还包括产生不具有生物功能或具有降低的生物功能的多肽的基因中的点突变。还优选地，可以优选地导入至少一个核苷酸的缺失、添加和/或取代，其导致控制基因表达的转录控制序列(即启动子)的失活。此外，优选地，可以导入序列，其在转录的rna中导致rna降解增加。更优选地，上述基因中至少一个基因的整个基因座被缺失或被非功能性或非表达的核酸取代。最优选地，开放阅读框被选择标记基因取代，如下文附图和实施例中所示的卡那霉素抗性基因，或缺失开放阅读框。
上述基因之一的给定修饰是否导致非表达基因的测试将取决于导入的修饰的性质，如本领域技术人员已知的。例如，如果基因的大部分编码序列已被缺失，则电泳分离ebv蛋白、然后用对所述基因的蛋白质产物特异的抗体进行免疫印迹将是合适的，因为含有缺失的基因的产物将具有较低的表观分子量。另一方面，如果上述基因之一完全缺失，则证明缺失的所得ebv基因组的限制性分析可能就足够了。在每种情况下，可以通过检测ebv颗粒中的相应活性或检测不到ebv颗粒中的相应活性来测定上述基因之一的功能丧失。
本发明的多核苷酸是包含ebv基因组的多核苷酸，其具有在合适的宿主细胞中指导产生根据本发明的ebv颗粒的生物活性。用于测量所述活性的合适测定法在所附实施例中描述。
此外，根据本发明使用的术语“多核苷酸”还包括前述特定多核苷酸的变体。所述变体可以代表本发明多核苷酸的株或克隆变体。多核苷酸变体优选地包含核酸序列，其特征在于该序列可以通过至少一个核苷酸取代、添加和/或缺失从上述特定核酸序列衍生，由此变体核酸序列仍然编码具有上述指定活性的ebv基因组。包含任何上述核酸序列的片段的多核苷酸也包括在本发明的多核苷酸中。该片段应编码仍具有上述指定活性的ebv基因组。
本发明的多核苷酸基本上由上述核酸序列组成或包含上述核酸序列。因此，它们也可含有其他核酸序列。具体地，本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白，其中融合蛋白的一部分是由上述核酸序列编码的多肽。这样的融合蛋白可以包含用于监测表达的额外部分多肽(例如，绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白，碱性磷酸酶等)或所谓的“标签”，其可以用作可检测标记物或作为纯化目的的辅助措施。用于不同目的的标签在本领域中是公知的，并且包括flag标签、6-组氨酸标签、myc标签等。
优选地，除了上面详述的修饰之外，本发明的多核苷酸还包含改变。具体地，由于已知或怀疑ebv的一些潜伏基因产物对细胞具有转化作用(ebna-2、lmp-1、lmp-2、ebna-3a和-c、bhrf1多肽和bart-mirnas(hammerschmidtw,sudgenb(1989)geneticanalysisofimmortalizingfunctionsofepstein-barrvirusinhumanb-lymphocytes.nature340:393-397；cohenji等人(1989)epstein-barrvirusnuclearprotein2isakeydeterminantoflymphocytetransformation.pnas86:9558–9562；kayekm等人(1993)epstein–barrviruslatentmembraneprotein1isessentialforb-lymphocytegrowthtransformation.pnas,90,9150–9154；tomkinsonb等人(1993)epstein-barrvirusnuclearproteinsebna3aandebna3careessentialforb-lymphocytegrowthtransformation.j.virol.62:6762–6771))，所以希望从本发明的多核苷酸中去除编码这些转化蛋白的基因。
ebv基因组背景中的术语“末端重复序列”是技术人员已知的，涉及包含在线性基因组(例如，包裹在ebv颗粒中)的5'末端和3'末端的ebv基因组中的重复序列。缺少末端重复序列的ebv基因组是本领域已知的，例如，wo2012/025603a1中公开了由缺少末端重复序列的基因组产生的ebv颗粒(tr-ebv)中的每个颗粒含有显著减少数量的ebv基因组。
ebv基因“bflf1”和“bbrf1”也是技术人员已知的，并且已被描述为将病毒dna包裹成颗粒所必需的，例如，在wo2013/098364中。因此，从缺少至少一种选自bflf1基因和bbrf1基因的可功能性表达基因的ebv基因组中，产生不包含可检测的ebvdna的ebv颗粒。相关序列可在公共数据库中获得，例如ebv1型bflf1基因的序列：genbankacc.no:yp_401648.1gi:82503206；ebv2型bflf1基因的序列：genbankacc.no:yp_001129444.1gi:139424479。ebv1型bbrf1基因的序列：genbankacc.no:yp_401682.1gi:82503238；ebv2型bbrf1基因的序列：genbankacc.no:yp_001129476.1gi:123811640。
优选地，多核苷酸还包含至少一种编码非ebv多肽的核酸序列，更优选编码人工非ebv多肽的核酸序列。还优选地，多核苷酸还缺少至少一种编码非必需ebv多肽的可表达基因，优选缺少编码转化ebv多肽的可表达基因，更优选缺少编码可表达的ebv潜伏基因，最优选缺少选自bzlf1、lmp-1、lmp-2、ebna-2、ebna-3a和ebna-3c的基因。
此外，本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。
优选地，载体是能够在细胞中稳定维持ebv基因组的质粒或病毒载体。更优选地，载体来自大肠杆菌(e.coli)f-质粒；这些载体是技术人员已知的基于f因子的复制子或细菌人工染色体(bac)，其允许例如，在大肠杆菌细菌细胞中稳定维持完整的ebv基因组。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合到基因组dna中。此类靶构建体优选包含足够长度的dna用于同源重组或异源插入。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于在宿主中增殖和/或选择的选择性标记物。载体可以通过本领域熟知的各种技术掺入宿主细胞中。如果导入宿主细胞，载体可以存在于细胞质中或可以掺入基因组中。在后一种情况下，应理解载体可以进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。可以通过常规转化或转染技术将载体导入原核或真核细胞中。载体和转化或转染技术是本领域熟知的，并且可以由本领域技术人员毫不费力地应用。例如，可以通过电穿孔将bac质粒载体导入大肠杆菌细胞中，或者以带电脂质复合物导入哺乳动物细胞中。
此外，本发明涉及包含本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的宿主细胞。
如本文所提及的“宿主细胞”包括真核细胞以及原核细胞。特别地，根据本发明提及的原核细胞可以是可用于增殖例如本发明的多核苷酸或载体的细菌细胞。用于此目的的优选细菌是大肠杆菌细菌，更优选菌株dh10b。真核细胞优选是能够表达包含在本发明多核苷酸或载体中的ebv基因组的基因的细胞。表达ebv生命周期潜伏期基因的优选细胞是例如raji细胞。更优选地，所述细胞能够组装ebv颗粒，即许可宿主细胞。如本文所用的术语“许可宿主细胞”涉及能够促进ebv裂解复制、导致产生ebv颗粒的细胞。优选地，所述许可细胞是哺乳动物细胞，更优选灵长类细胞，甚至更优选人细胞。最优选地，宿主细胞是293细胞、b细胞或b细胞衍生的细胞系。本发明还可预期宿主细胞可提供ebv裂解复制所必需的某些因子。例如，在使用缺少功能性bzlf1基因的ebv基因组、导致病毒不能进入裂解周期的情况下，可在所述bzlf1基因、brlf1基因、或两种基因的表达构建体被转染到细胞之后，由宿主细胞提供这种功能。
此外，本发明涉及由本发明的多核苷酸和/或本发明的载体产生的或可产生的ebv颗粒。
此外，本发明涉及包含显著降低的bnrf1活性的ebv颗粒、根据本发明的ebv多核苷酸、根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞用于制备疫苗的用途。
本发明还涉及制备eb-vlp的方法，所述eb-vlp包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽的活性和/或显著降低的ebv成融多肽的活性并且包含显著降低的ebvdna的量，所述方法包括以下步骤：
a)培养包含根据本发明的多核苷酸和/或本发明的载体的许可宿主细胞；和
b)从所述许可宿主细胞中获得eb-vlp。
优选地，制备本发明的eb-vlp的方法是体外方法。此外，除了上面明确提到的步骤之外，该方法还可以包括其他步骤。例如，其他步骤可以涉及，例如，在步骤a)的所述许可宿主细胞内提供bzlf1基因产物，或者从步骤b)中培养的许可宿主细胞的上清液中除去许可宿主细胞和/或获得eb-vlp。而且，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。
本发明还涉及制备疫苗的方法，该方法包括制备eb-vlp的方法的步骤和将eb-vlp配制成疫苗的进一步的步骤。
此外，本发明涉及疫苗接种受试者的方法，所述方法包括使所述受试者与包含ebv颗粒的组合物接触，其中所述方法包括避免使所述受试者细胞的细胞质和/或细胞核与bnrf1活性接触。
此外，本发明涉及一种疫苗接种受试者的方法，所述方法包括使所述受试者接触
(i)包含显著降低的bnrf1多肽活性的ebv颗粒，
(ii)根据本发明的多核苷酸，
(iii)根据本发明的载体，
(iv)根据本发明的宿主细胞，
(v)根据本发明的ebv颗粒，
(vi)根据本发明的组合物；或者
(vii)(i)至(vi)的任何组合。
此外，本发明涉及包含通过如上所述制备eb-vlp的方法的步骤的方法可获得的eb-vlp的组合物，所述eb-vlp包含显著降低的bnrf1多肽的活性和/或显著降低的gp110多肽的活性，并且包含量显著减少的ebvdna。
鉴于以上所述，以下实施方案是特别优选的：
1.包含eb病毒(ebv)颗粒的组合物，其用于受试者疫苗接种的用途，其中所述ebv颗粒包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性，优选包含降低的bnrf1活性。
2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述ebv颗粒包含量显著减少的ebvdna。
3.根据实施方案1或2所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒不含ebvdna。
4.根据实施方案1至3任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒是eb病毒样颗粒(eb-vlp)。
5.根据实施方案1至4任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒不含功能性bnrf1多肽、不含功能性bplf1多肽、不含功能性bglf3多肽、不含功能性brrf2多肽、不含功能性bkrf4多肽、和/或不含功能性bxlf1多肽，优选不含功能性bnrf1多肽。
6.根据实施方案1至5任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒包含量显著减少的bnrf1基因产物。
7.根据实施方案1至6任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒不含bnrf1基因产物。
8.根据实施方案1至7任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒由缺少可功能性表达的bnrf1基因的ebv基因组产生，优选由缺少可表达的bnrf1基因的ebv基因组产生。
9.根据实施方案1至8任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒还包含至少一种非ebv多肽，优选人工非ebv多肽。
10.根据实施方案1至9任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒还缺少至少一种非必需ebv多肽活性，优选缺少ebvgp110活性。
11.根据实施方案1至10任一项所述的用于用途的组合物，其中所述ebv颗粒还缺少至少一种转化ebv多肽。
12.根据实施方案1至11任一项所述的用于用途的组合物，其中所述疫苗接种是针对ebv感染的疫苗接种。
13.根据实施方案1至12任一项所述的用于用途的组合物，其中所述疫苗接种是非终末疾病受试者的疫苗接种。
14.根据实施方案1至13任一项所述的用于用途的组合物，其中所述受试者是年龄小于其平均预期寿命的一半，优选小于四分之一，更优选小于五分之一，最优选小于十分之一的受试者。
15.根据实施方案1至14任一项所述的用于用途的组合物，其中所述受试者是小于18岁的人，优选小于15岁的人，更优选小于10岁的人，最优选小于5岁的人。
16.根据实施方案1至15任一项所述的用于用途的组合物，其中所述受试者患有免疫缺陷和/或计划进行免疫抑制治疗。
17.根据实施方案1至16任一项所述的用于用途的组合物，其中所述受试者是未来的移植接收者。
18.根据实施方案1至17任一项所述的用于用途的组合物，其中所述受试者是器官移植和/或造血干细胞移植的未来接受者，优选是同种异体造血干细胞移植的未来接受者，更优选同种异体骨髓移植的未来接受者。
19.根据实施方案1至18任一项所述的用于用途的组合物，其中所述疫苗接种包括避免诱导染色体畸变。
20.根据实施方案1至20任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
21.包含ebv颗粒的组合物，其用于受试者疫苗接种的用途，其中所述疫苗接种包括避免使所述受试者的细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触，优选包括避免使所述受试者的细胞的细胞质和/或细胞核与bnrf1活性接触。
22.根据实施方案21所述的用于用途的组合物，其中所述避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与bnrf1基因产物接触，优选包括避免使所述受试者与bnrf1多肽接触。
23.根据实施方案21或22所述的用于用途的组合物，其中所述避免使细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触包括避免使所述受试者与包含ebv成融多肽活性的ebv颗粒接触，优选包括使所述受试者与缺少ebv的balf4多肽、bxlf2多肽、bkrf2多肽和/或bzlf2多肽的ebv颗粒接触，更优选包括避免使所述受试者与包含ebv的balf4多肽、bxlf2多肽、bkrf2多肽和/或bzlf2多肽的ebv颗粒接触。
24.根据实施方案21至23任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含显著降低的bnrf1活性和/或显著降低的gp110活性，优选缺少bnrf1活性和/或缺少gp110活性。
25.根据实施方案21至23任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含具有显著降低的bnrf1活性和/或具有显著降低的gp110活性的ebv颗粒。
26.根据实施方案21至24任一项所述的用于用途的组合物，其中所述组合物包含缺少bnrf1活性和/或缺少gp110活性的ebv颗粒。
27.一种多核苷酸，其编码如实施方案2至11中任一项所述的ebv颗粒，其用于受试者疫苗接种。
28.一种编码ebv基因组的多核苷酸，其中所述ebv基因组
a)缺少编码功能性诱导染色体不稳定性的ebv多肽的基因，和/或缺少编码功能性ebv成融多肽的基因，和
b)缺少ebv末端重复序列和/或缺少至少一种选自bflf1基因和bbrf1基因的可功能性表达的基因。
29.根据实施方案27或28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含至少一种编码非ebv多肽的核酸序列，优选编码人工非ebv多肽的核酸序列。
30.根据实施方案27至29中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还缺少至少一种可表达的编码非必需ebv多肽的基因。
31.根据实施方案27至30中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还缺少至少一种可表达的编码转化ebv多肽的基因。
32.根据实施方案27至31中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还缺少至少一种可表达的ebv潜伏基因。
33.根据实施方案27至32中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还缺少至少一种选自bzlf1、lmp-1、lmp2、ebna-2、ebna3a和ebna3c的可表达基因。
34.一种载体，其包含根据实施方案27至33中任一项所述的多核苷酸。
35.一种宿主细胞，其包含实施方案27至33中任一项所述的多核苷酸和/或实施方案34所述的载体。
36.由实施方案27至33中任一项所述的多核苷酸和/或实施方案34所述的载体产生或可产生的ebv颗粒。
37.如实施方案1至11中所限定的ebv颗粒、根据实施方案27至33中任一项所述的ebv多核苷酸、根据实施方案34所述的载体和/或根据实施方案35所述的宿主细胞用于制备疫苗的用途。
38.一种制备eb-vlp的方法，所述eb-vlp包含显著降低的bnrf1多肽的活性和/或显著降低的gp110多肽的活性、并且包含量显著减少的ebvdna，所述方法包括以下步骤：
a)培养许可宿主细胞，所述许可宿主细胞包含根据实施方案27至33中任一项所述的多核苷酸和/或根据实施方案34所述的载体；和
b)从所述许可宿主细胞中获得eb-vlp。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述eb-vlp获自培养的许可宿主细胞的上清液。
40.一种制备疫苗的方法，所述方法包括实施方案38或39的方法的步骤和进一步将eb-vlp配制成疫苗的步骤。
41.可通过包括实施方案38或39的方法的步骤的方法获得的包含eb-vlp的组合物，所述eb-vlp包含显著降低的诱导染色体不稳定性的ebv多肽的活性和/或显著降低的ebv成融多肽的活性，并且包含量显著减少的ebvdna。
42.一种疫苗接种受试者的方法，所述方法包括使所述受试者与包含ebv颗粒的组合物接触，其中所述方法包括避免使所述受试者细胞的细胞质和/或细胞核与诱导染色体不稳定性的ebv多肽活性接触，优选包括避免使所述受试者细胞的细胞质和/或细胞核与bnrf1活性接触。
43.一种疫苗接种受试者的方法，所述方法包括使所述受试者接触
(i)如实施方案1至11中任一项所限定的ebv颗粒，
(ii)根据实施方案27至33中任一项所述的多核苷酸，
(iii)根据实施方案34所述的载体，
(iv)根据实施方案35所述的宿主细胞，
(v)根据实施方案36所述的ebv颗粒，
(vi)根据实施方案41所述的组合物；或者
(vii)(i)至(vi)的任何组合。
本说明书中引用的所有参考文献，其全部公开内容和本说明书中提及的具体公开内容均通过引用并入本文。
附图说明
图1：被eb病毒感染的b细胞显示出染色体不稳定性的特征。感染后将细胞持续培养3或6天，离心涂片细胞(cytospinned)并染色α-微管蛋白、中心粒蛋白-2、ph3(有丝分裂的染色体标记物)或crest(着丝粒标记物)。我们报告了8个血液样品的分析。对于每个样品，检查来自离心涂片细胞的感染细胞的至少100个有丝分裂细胞和500个有丝分裂间期细胞。(a)经历围绕6个中心体排列的多极有丝分裂的细胞。(b)围绕增加数目的中心粒排列的有丝分裂后期细胞。(c)图片显示正在经历有丝分裂中期的细胞中未对齐的染色体(箭头)。(d)这种有丝分裂后期细胞显示两条滞后的染色体(箭头)。(e)有丝分裂细胞显示染色体的不对称分割。(f)具有增加数目的中心粒的有丝分裂间期细胞。插图显示中心体的放大视图。(g)具有多个细胞核的细胞。(h)显示较大的细胞核旁边的微核的有丝分裂间期细胞，以及在插图中放大的多个中心体。(i)具有单个细胞核的多倍体细胞，其含有超过46个着丝粒。(j)点图显示异常有丝分裂频率的总结，该异常有丝分裂通过商陆有丝分裂原刺激或用野生型m81或m81/δzr感染的相同个体的b细胞中在(a到h)中描述的染色鉴定。该分析排除了后来描述的非整倍体的频率。一些获得的结果包括空值。因此，我们应用精确的wilcoxon符号秩检验来比较结果。
图2：野生型ebv(m81wt)或复制缺陷型突变体(m81/δzr)转化的细胞中染色体不稳定性的比率。我们分析了8个样品对。在感染后第3、6或30天分析细胞。对细胞进行细胞离心涂片并用多种标记物染色。对于每个样品，分析至少100个有丝分裂和500个有丝分裂间期细胞。独立地，制备染色体以评估非整倍体的比率，并且对于这些样品中的每一个，分析至少50个有丝分裂。该图总结了围绕超过4个中心粒排列的双极有丝分裂的频率(a)、具有超过4个中心粒的有丝分裂间期细胞的频率(b)、多核细胞的频率(c)、携带一个或几个微核的细胞的频率(d)、非整倍体有丝分裂的频率(e)、多倍体有丝分裂的频率(f)。该图包括在感染后第30天分析的样品对上进行的统计学上显著的配对t检验的结果。dpi：感染后的天数。
图3：在感染后4周野生型ebv转化的b细胞比用非复制突变体转化的b细胞显示更高的cin比率。m-fish核型的实施例，其显示用野生型ebv(a)或复制细胞缺陷型突变体(b)感染的一对转化细胞系的有丝分裂。(c)和(d)显示在野生型ebv转化的2个其他细胞系中发现的2个易位。
图4：感染野生型m81的b细胞比感染复制缺陷型m81/δzr病毒的b细胞更高频率地在免疫缺陷型小鼠中诱发肿瘤。将b细胞暴露于m81野生型和m81/δzr突变体，并腹膜内注射给nsg小鼠或体外培养。(a)该图显示7个独立b细胞样品在体外的细胞生长，持续34天的期间。我们显示平均值与标准偏差。(b)将(a)中描述的样品中的三个接种在覆盖饲养细胞的96孔簇板中，每孔浓度为3或30个ebna2阳性细胞。点图显示作为转化标记物的生长(outgrow)孔的百分比。(c)该图显示注射4x104感染的b细胞后无免疫应答小鼠中肿瘤的发生率。考虑到由于在该实验中使用三种感染的原代b细胞样品引起的变化，通过分层的精确mantel-haenszel检验评估用野生型m81和m81/δzr获得的结果。(d)点图显示16组动物对中的肿瘤质量，这些动物在注射4x105个感染m81或m81/δzr的b细胞后形成肿瘤。通过非配对t检验分析结果。(e)组织学染色显示在无免疫应答小鼠中注射ebv感染的细胞后形成的肿瘤形态学(h&e染色)、eber非编码rna的表达模式、以及bzlf1和gp350蛋白的表达模式。我们显示了在野生型病毒感染后或在m81/δzr突变体感染后形成的肿瘤的一个实例。dpi：感染后的天数。
图5：用野生型m81产生的淋巴样肿瘤比用复制缺陷型m81/δzr突变体产生的淋巴样肿瘤表现出更高程度的cin。向32只nsg小鼠注射4x105个感染野生型m81或m81/δzr突变体的b细胞。点图总结了围绕超过4个中心粒排列的双极有丝分裂的频率(a)、具有超过4个中心粒的有丝分裂间期细胞的频率(b)、多核细胞的频率(c)、携带一个或几个微核的细胞的频率(d)、非整倍体有丝分裂的频率(e)、多倍体有丝分裂的频率(f)。除2个样品外，对于每一个样品，分析至少100个有丝分裂和500个有丝分裂间期细胞。结果进行非配对t检验。还参见图2，用于与体外感染的结果进行比较。
图6：野生型ebv感染的细胞中的中心体扩增主要是由于过度复制。用中心粒蛋白和cep170(这两种蛋白质位于中心体)特异性抗体共染色感染野生型病毒的lcl，并用dapi复染。(a)该感染细胞显示两个中心粒蛋白阳性中心粒(绿色)，但只有一个中心粒(红色)表达cep170。(b)具有中心体积累的感染的双核细胞显示在约50％的中心粒中对cep170染色。(c)显示中心体过度复制的感染细胞中，仅有一个cep170阳性中心粒和至少4个中心粒蛋白阳性中心粒。(d)该图显示在感染野生型m81或m81/δzr的细胞中具有通过过度复制产生的中心体扩增的细胞的比例。对3个血液样品进行分析。(e)使用plk4、sas-6、stil、肌动蛋白或bzlf1特异性抗体，对3对感染m81或m81/δzr的lcl进行免疫印迹。未感染的静息b细胞、用cd40l和il4刺激的b细胞和伯基特氏淋巴瘤细胞系elijah作为对照。
图7：将m81/δzr转化的b细胞、商陆有丝分裂原刺激的b细胞、cd40l刺激的b细胞和rpe-1细胞暴露于病毒样颗粒导致中心粒扩增。用m81病毒样颗粒(vlp)、不能与靶细胞融合的病毒样颗粒(δgp110vlp)或培养基处理不同的细胞群。在感染后三天进行分析。对于每个样品，检查了至少100个有丝分裂和500个有丝分裂间期细胞。点图显示在m81/δzr突变体转化的6个b细胞样品中(a，b和c)、在il4和cd40-l刺激的7个b细胞样品(d，e和f)中，具有中心粒扩增的有丝分裂间期细胞的频率、具有中心体数量增加的双极有丝分裂的频率或非整倍体有丝分裂的频率。我们还定量了在商陆有丝分裂原刺激的6个b细胞样品(g和h)中和在经受3次独立感染的rpe-1细胞(i和j)中显示超过4个中心粒的有丝分裂间期细胞或有丝分裂的百分比。我们显示了b细胞样品的配对t检验和rpe-1细胞的非配对t检验的结果。
图8：感染缺少bnrf1的eb病毒的b细胞相对于野生型感染显示出显著降低的中心体扩增和非整倍体比率。(a至c)在m81/δzr病毒转化并暴露于野生型b95-8或b95-8/δbnrf1病毒的细胞中，中心体扩增和非整倍体比率。在感染后3天进行分析。这些点图总结了具有超过4个中心粒的有丝分裂间期细胞的频率(a)、围绕超过4个中心粒安排的双极有丝分裂的频率(b)、非整倍体有丝分裂的频率(c)。用配对t检验评估了结果。(d至g)用野生型b95-8、敲除b95-8/δbnrf1的病毒或与补充bnrf1的b95-8/δbnrf1病毒(δbnrf1-c)产生来自5个独立血液样品的lcl。点图显示具有增加数量的中心粒的有丝分裂间期细胞的频率(d)、围绕超过4个中心粒排列的双极有丝分裂的频率(e)、多极有丝分裂的频率(f)和非整倍体有丝分裂的频率(g)。(h至k)与(d至g)相同的实验，但用基于m81构建的敲除bnrf1的病毒进行。对于每个样品，检查至少100个有丝分裂和500个有丝分裂间期细胞。对于(a)至(c)，我们给出配对t检验的结果；对于(d)至(k)，我们应用精确的wilcoxon符号秩检验来比较用δbnrf1突变体感染的b细胞与用野生型或补充病毒感染的b细胞的异常率。p值给出具有随机效应的全局混合线性模型分析的结果。
图9：bnrf1富含在中心体级分中
对293细胞进行bnrf1过表达。排除细胞核后，在蔗糖梯度上分离细胞器。我们用鉴定中心体蛋白的γ-微管蛋白特异性抗体和bnrf1特异性抗体免疫染色从该梯度收集的连续级分。我们还用parp1特异性抗体对提取物进行染色，parp1是一种定位于中心体的蛋白质。parp1特异性抗体鉴定全长蛋白质以及由半胱天冬酶3裂解产生的较小形式的蛋白质。最后，我们用akt特异性抗体染色印迹，以检测游离细胞质蛋白的污染。进行后一染色以确保梯度未被游离细胞质蛋白污染。具有bnrf1过表达的细胞的未纯化全细胞提取物(wcl)作为阳性对照包括在内，并且φ表示没有样品的孔。(a)显示从表达bnrf1的细胞收集的级分，(b)显示从用空对照质粒转染的细胞收集的级分。(c)含有中心体蛋白并在(a)和(b)中描述的级分的免疫印迹。
图10：诱导染色体不稳定性的ebv蛋白
用指定ebv基因的表达质粒转染293hek细胞。确定了染色体不稳定性的指示物。(a)组合的hek293转染有丝分裂间期；y轴：具有>4中心粒的细胞部分(％)；(b)组合的hek293转染中心体聚类；y轴：具有聚集的中心体有丝分裂的细胞部分(％)；(c)组合的hek293转染多极性；y轴：多极有丝分裂的部分(％)。
以下实施例仅用于说明本发明。它们不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：方法
伦理声明
所使用的所有人原代b细胞均从购自海德堡大学血库的匿名血沉棕黄层中分离。无需伦理批准。所有动物实验均严格按照德国动物保护法(tierschg)进行，并经位于德国
细胞系、原代细胞、病毒
293细胞系是通过用腺病毒转化胚胎上皮肾细胞而获得的神经内分泌细胞系(atcc：crl-1573)。hela是被18型乳头瘤病毒感染的人宫颈腺癌细胞系(atcc：cll-2)。helakyotomegfp-α-微管蛋白/h2b-mcherry细胞系是其衍生物，其稳定表达megfp-α-微管蛋白和h2b-mcherry蛋白融合物(heldm等人,naturemethods7,747-754(2010))。rpe-1是用htert永生化的人上皮细胞系(atcc：crl-4000)。rpe-1/中心粒蛋白-1-gfp是组成型表达中心粒蛋白-1-gfp融合蛋白的细胞系(yangz等人,naturecellbiology10,748-751(2008))。u2os是源自中度分化的胫骨肉瘤的细胞系(atcc：htb-96)。在ficoll垫上纯化从海德堡血库购买的血沉棕黄层中外周血单核细胞，并使用m-450cd19(panb)dynabeads(dynal)分离cd19阳性原代b淋巴细胞，并使用detachabead(dynal)分离。wi38是原代人肺胚胎成纤维细胞(atcc：ccl-75)。所有细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)(biochrom)的rpmi-1640培养基(invitrogen)中常规培养，并且原代b细胞补充有20％fbs直至建立lcl。helakyotomegfp-α-微管蛋白/h2b-mcherry细胞补充有0.5μg/ml嘌呤霉素和500μg/mlg418。先前已经描述了本研究中使用的ebv产生细胞(m81、m81/δzr、b95-8、b95-8/δbnrf1、b95-8/δbflf1δbfrf1δbbrf1δbalf4(具有gp110缺失的vlp)、b95-8/δbflf1δbfrf1δbbrf1(vlp))，并且其通过将ebv-bac稳定转染到补充有100μg/ml潮霉素的293细胞中来建立(linx等人,plospathogens11,e1005344(2015)；tsaimh等人,cellreports5,458-470(2013)；pavlovas等人,journalofvirology87,2011-2022(2013)；neuhierlb等人,journalofvirology83,4616-4623(2009))。产生vlp的突变体和δbnrf1突变体也可以基于m81菌株获得。它们正确构建为其b95-8同源物。m81/δzr缺少启动裂解复制的bzlf1和brlf1反式激活子，因此其无法复制，b95-8/δbnrf1和m81/δbnrf1缺少bnrf1被膜蛋白。
质粒
先前描述了bzlf1(p509)、balf4(pra)和bnrf1(b056)表达质粒(feederler等人,journalofvirology80,9435-9443(2006))。我们筛选了由cmv启动子驱动的66种ebv蛋白的文库(adhikaryd等人,plosone2,e583(2007))。在pcdna3.1中构建编码细胞质截短形式的大鼠cd2(b673)的表达质粒。我们还将bnrf1基因克隆到四环素诱导的质粒中，该质粒含有由teto操纵子控制的最小cmv启动子、由cag启动子驱动的四环素反式激活蛋白(tet-on)、来自b95-8株的质粒复制起点、和由sv40启动子驱动的嘌呤霉素抗性盒(b1439)(bornkammgw等人,nucleicacidsresearch33,e137(2005))。没有插入物的亲本载体用作阴性对照。
转染
所有转染实验均使用基于脂质体的转染metafectene(biontex)、根据制造商的说明进行。
病毒产生
用编码bzlf1(p509)和balf4(pra)的表达质粒转染用重组ebv-bac稳定转染的293细胞以诱导裂解复制，除了产生缺少gp110的vlp的情况，在这种情况下仅转染编码bzlf1的质粒。在稳定携带δbnrf1病毒的生产细胞系中转染编码bnrf1蛋白(b056)的质粒导致反式互补，如前所述(feederler等人,journalofvirology80,9435-9443(2006))。转染三天后，收集病毒上清液并通过0.4μm过滤器过滤。
用有丝分裂原或cd40配体刺激b细胞
将新鲜分离的cd19+原代b细胞与15μg/ml商陆有丝分裂原(pwm)(l9379，sigma-aldrich)培养，或将新鲜分离的cd19+原代b细胞在25ng/ml重组人il4(peprotech，德国)存在下在90gy-γ照射的cd40-配体饲养细胞层上培养。在刺激开始3天后对细胞进行细胞离心涂片或染色体分析。
吉姆萨染色
用0.075μg/ml秋水仙碱(sigma-aldrichc3915)处理细胞2小时以诱导有丝分裂中期停滞并允许有丝分裂中期的制备物涂层(spreads)。用pbs洗涤3次后，将细胞在75mmkcl低渗缓冲液中在37℃孵育10分钟，并在甲醇：冰醋酸(3：1)中固定，滴在冷玻璃载玻片上并用5％吉姆萨水溶液染色(carlrothgmbht862.1)。使用配备有dfc300fx(leica，cambridge，uk)照相机的dm2500(leica，wetzlar，germany)显微镜捕获有丝分裂中期的数字图像，并进行核型分析。每个样品我们分析了至少50个有丝分裂。
多重荧光原位杂交(m-fish)。
如geigl等人,natureprotocols1,1172-1184(2006)所述进行m-fish。简而言之，使用简并寡核苷酸和pcr(dop-pcr)扩增7个流式分选的人全染色体涂染探针池并用7种不同的荧光染料(deac、fitc、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5和cy7)直接标记。将固定在玻璃载玻片上的有丝分裂中期染色体在70％甲酰胺/2×sscph7.0中于72℃变性2分钟，然后在纯度递增的乙醇系列中脱水。杂交混合物含有组合标记的涂染探针、过量的未标记cot1dna、50％甲酰胺、2xssc和15％硫酸葡聚糖。将其在75℃下变性7分钟，在37℃下预退火20分钟，并在37℃下与变性的有丝分裂中期制备物杂交。48小时后，将载玻片在室温下在2×ssc中瞬时洗涤，持续5分钟，然后在0.2×ssc/0.2％tween-20中在56℃下洗涤两次，每次7分钟。用4.6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对有丝分裂中期涂层进行复染，并用抗褪色溶液覆盖。使用配备有sensysccd照相机(photometrics，tucson，az)的dmrxa落射荧光显微镜(leicamicrosystems，bensheim，germany)记录有丝分裂中期涂层。照相机和显微镜由leicaq-fish软件控制，图像基于leicamck软件处理并呈现为多色核型图(leicamicrosystemsimagingsolutions，cambridge，unitedkingdom)。我们分析了每个样品的15到20个有丝分裂中期。
有丝分裂纺锤体的分析
将细胞洗涤3次并重悬于pbs-3％fbs中。然后将单细胞悬浮液加载到带有载玻片的shandoncytospin室(thermoscientifics)上，并以2000rpm离心10分钟。将离心涂片的细胞风干，在-20℃下在纯甲醇中固定8分钟，并在室温下在pbs中短暂洗涤两次，每次5分钟。将细胞在pbs-3％bsa中封闭30分钟，与一抗一起孵育1.5小时，在pbs中洗涤3次，每次5分钟，与缀合cy-3、cy-5或alexa488的二抗一起孵育1.5小时。将载玻片再次在pbs中洗涤三次并在包含dapi荧光染料的prolonggold抗褪色试剂中(lifetechnologies)封装。在每个样品中，检查至少100个有丝分裂和500个有丝分裂间期细胞。用连接dm2500荧光显微镜(leica)的照相机或用共聚焦显微镜(在zen2009上运行的zeisslsm700)拍摄染色细胞的照片。
细胞周期同步
将helakyotomegfp-α-微管蛋白/h2b-mcherry细胞(或在研究中应用的其他细胞)用2mm胸苷处理16小时，释放8小时并再次阻断16小时以获得双胸苷阻断。
活细胞成像
我们对helakyotomegfp-α-微管蛋白/h2b-mcherry细胞进行了活细胞成像，这些细胞用培养基、病毒或病毒样颗粒处理72小时。在该处理期间，细胞通过双胸苷阻断在g1期同步化。在胸苷阻断的第二次释放后，将每孔2.5×105个细胞接种在ibidiμ-slide8孔板或lab-tekii有隔室的盖玻片(8个隔室)中。在5％co2和37℃的孵育箱中在倒置显微镜(zeissmotorizedobserver.z1)上用20x/0.4空气物镜(airobjective)监测细胞，所述倒置显微镜连接到彩色ccd照相机axiocamicc3。在470nm用于gfp和在590nm用于mcherry的led模块colibri.2用于荧光染料激发。使用细胞zeisszenblue软件，用3-8个z-堆叠拍摄多点图像，每5分钟覆盖6至8μm的范围，持续5-15小时。通过imagej软件进行荧光通道的最大强度投影，以创建8位rgbtiff文件和动画。
b细胞感染和体外转化实验
从不同健康供体的外周血中纯化的b细胞暴露于病毒2小时，感染复数(moi)为20个病毒基因组，如前所述的每个靶细胞的qpcr所定义(feederler等人,journalofvirology80,9435-9443(2006))。用pbs洗涤感染的细胞一次，并在补充有20％fbs的rpmi的簇板中铺板。对于转化分析，我们首先使用免疫染色确定感染后3天的感染样品中ebna2阳性细胞的百分比。将感染的细胞群接种在覆盖103个γ-照射的wi38饲养细胞的96-u-孔板中，每孔浓度为3或30个ebna2-阳性细胞。未感染的b细胞用作阴性对照。在30dpi监测淋巴母细胞样细胞克隆(lcl)的生长。同时，我们还通过每周两次计数感染群中的细胞数量来监测分批培养中的细胞生长。
筛选ebv文库
ebv蛋白表达文库用于瞬时转染到293细胞中。为了鉴定转染的细胞，我们共转染了编码细胞质截短的大鼠cd2的质粒，该质粒作为表面标记物表达。
无免疫应答小鼠中的转化实验
我们从血沉棕黄层中分离人cd19+b细胞，并在室温下持续搅拌以足以产生20％的ebna2阳性细胞的moi使其体外暴露于m81或m81/δzr2小时(linx等人,plospathogens11,e1005344(2015))。我们使用3种不同的血沉棕黄层感染26只小鼠。通过离心收集感染的细胞并用pbs洗涤两次。将暴露于病毒的2x105或2x106原代b细胞(分别相当于4x104和4x105ebv感染的细胞)腹膜内注射到nsg小鼠中。我们使用3种不同的血沉棕黄层(具有4x104ebv感染的细胞)感染26只小鼠，和5种不同的血沉棕黄层(具有4x105ebv感染的细胞)感染32只小鼠。在注射后6周出现临床症状时(冷漠、拒绝食物、褶皱的毛发、体重减轻、可触及的肿瘤)，对小鼠实施安乐死。仔细尸检后，对器官进行肉眼和显微镜检查，包括h&e染色和免疫组化。我们还从rpmi-20％fbs中过夜培养的肿瘤块中生成单细胞悬浮液，用于产生有丝分裂中期涂层或细胞离心涂片并进行免疫荧光染色。
免疫组化
将来自安乐死小鼠的器官固定在10％福尔马林中并包埋在石蜡中。制备3μm薄切片并在抗原修复后(10mm柠檬酸钠、0.05％tween20，ph6.0；98℃，40分钟)进行免疫染色。用envisiontm+双链系统-hrp(dako)显现结合的抗体。用连接光学显微镜(axioplan，zeiss)的照相机拍摄照片。
蛋白质印迹
用标准裂解缓冲液(150mmnacl、0.5％np-40、1％脱氧胆酸钠、0.1％sds、5mmedta、20mmtris-hclph7.5、蛋白酶抑制剂混合物(roche))在冰上提取蛋白质，持续15分钟，然后超声处理以剪切基因组dna。在sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离至多20μg的蛋白质(该蛋白质在laemmli缓冲液中在95℃变性5分钟)，并电印迹到硝酸纤维素膜(hybondc，amersham)上。将印迹在3％bsapbst(含0.2％tween20的pbs)中预孵育后，加入针对靶蛋白的抗体并在室温下孵育1小时。在pbst中充分洗涤后，将印迹与二抗一起孵育1小时。使用ecl检测试剂(pierce)显示结合的抗体。
抗体
我们使用针对α-微管蛋白(sigma-aldricht5168)、γ-微管蛋白(sigma-aldricht6557)、plk1(santacruzsc-17783)、sas-6(santacruzsc-81431)、中心粒蛋白-2(millipore04-1624)、npm1(zymed32-5200)、β肌动蛋白(dianovadln-07273)的原代小鼠单克隆抗体；针对中心粒蛋白-2(santacruzsc-27793-r)、cep170(abcamab72505)、磷酸组蛋白h3(ph3，cellsignaling9716)、stil(bethyllaboratoriesa302-442a)、parp1(cellsignaling9542s)、akt(cellsignaling)的兔多克隆抗体；人多克隆抗着丝粒(crest，antibodiesincorporated15-235-f)。从杂交瘤上清液中收集针对bzlf1(克隆bz.1)、gp350(克隆ot6)、lmp1(克隆cs1-4)、大鼠cd2(克隆ox34)的小鼠单克隆抗体。如前所述产生针对bnrf1蛋白的兔抗血清(feederler等人,journalofvirology80,9435-9443(2006))。针对合成肽产生抗人plk4的小鼠抗体(人plk4的氨基酸567-579)(cizmeciogluo等人cep152actsasascaffoldforrecruitmentofplk4andcpaptothecentrosome.thejournalofcellbiology191,731-739(2010))。应用于免疫荧光染色的二抗是与alexa488(invitrogena11029)或cy3(dianova115-165-146)偶联的山羊抗小鼠抗体、与alexa488(invitrogena11008)或cy3(dianova111-165-144)偶联的抗兔抗体。将辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠或兔抗体(promega)用作二抗体，用于蛋白质印迹分析。
中心体分离
使用嘌呤霉素选择(2μg/ml)，用携带bnrf1(b1439)或其对照(b484)的四环素诱导型质粒稳定转染293细胞。选择显示出至少90％诱导率的单细胞集落用于进一步的实验。用0.025μg/ml多西环素诱导这些细胞1.5天，然后用诺考达唑(10μg/ml；merckmillipore)和细胞松弛素b(5μg/ml；merckmillipore)处理90分钟。将细胞重悬于冰冷的pbs中，通过离心收集沉淀。用0.1xpbs、8％蔗糖洗涤后，通过每15cm平板加入8ml裂解缓冲液(1mmtris-hclph8.0、0.5％nonidetp-40、0.5mmmgcl2、0.1％β-巯基乙醇、1x蛋白酶抑制剂混合物(roche))裂解沉淀、倒置数次、并在冰上放置5分钟。将裂解物在4℃以2,500×g离心10分钟以沉淀细胞核、聚集体和完整细胞。仔细收集澄清的上清液，并通过40μm细胞过滤器进一步过滤。通过使用50xpe缓冲液(500mmpipes、50mmetda，ph7.2)将裂解物调节至1xpe(10mmpipes、1mmetda)，在冰上与1μg/mldnasei孵育15分钟，加载至梯度缓冲液(1xpe缓冲液、0.1％nonidetp-40、0.1％β-巯基乙醇)中制备的50％(重量/重量)蔗糖垫上，在4℃下以12,000rpm用sw40ti转子不间断离心20分钟。离心后，在垫顶部可见7ml上清液。我们丢弃了前5ml上清液，并收集剩余的2ml，以及第一ml蔗糖梯度。将这些合并的级分充分混合并加载到不连续的蔗糖梯度上，该梯度从底部至顶部由梯度缓冲液中制备的1ml70％(重量/重量)蔗糖、1.5ml50％(重量/重量)蔗糖、2.5ml40％(重量/重量)蔗糖制成。将梯度在34,000rpm、4℃下离心90分钟而不中断。离心后，弃去蔗糖梯度顶部的上层上清液，并从底部至顶部以450μl等分收集蔗糖级分。通过将100μl各级分与1.2ml1xpe缓冲液混合并在21,000xg，4℃下离心25分钟，回收每个级分中存在的细胞器。从每种这些制备物中小心地除去上清液，用sds样品缓冲液裂解沉淀，并进行sdspage和蛋白质印迹分析。
统计学分析
针对从用2种不同类型病毒感染的多个原发b细胞样品、或从用2种不同类型病毒感染的相同血样中建立的lcl收集的数据，我们应用配对学生t检验。用配对学生t检验分析用2种不同病毒独立感染的细胞系实验收集的结果。结合bonferroni调整的成对比较，我们针对供体使用具有随机效应的混合线性模型，以全局分析暴露于不同病毒或模拟感染的效果。计算使用sas9.3进行。使用wilcoxon符号秩检验分析包括阴性结果的感染实验，其中使用r进行计算。使用分层的精确mantel-haenszel检验评估多个b细胞群用于感染的动物实验的结果，用r进行计算。如预期的那样，活细胞随时间成像所收集的数据，是右偏的并且是对数转换的。然后在sas9.3上对它们进行anova检验，然后进行bonferroni调整的成对比较。
实施例2：感染的b细胞中的ebv复制增加染色体不稳定性
通过比较用从npc分离的高度复制菌株m81和其复制缺陷型突变体(m81/δzr)感染的b细胞，我们研判了ebv裂解复制对病毒诱导的新生肿瘤过程的贡献。我们通过比较用商陆有丝分裂原(pwm)刺激或用m81或m81/δzr感染的细胞有丝分裂开始我们的研究。在处理后第3天，分裂中的pwm刺激的b细胞在不同阶段显示典型的有丝分裂图，在子细胞中染色体平均分布。相反，许多感染任何一种病毒的分裂中细胞都表现出异常的有丝分裂。一些有丝分裂是多极的，其他是双极的，但是围绕多个中心粒排列(图1a，b，图2a)。一些有丝分裂包含未对齐的染色体，一些有丝分裂后期显示染色体滞后的图像(图1c，d)。我们还发现了不对称的有丝分裂后期，其中染色体组有瑕疵地(imperfectly)分布(图1e)。总而言之，这组实验表明，感染细胞中15％至42％的有丝分裂显示出异常组织，相比之下，pwm刺激后为异常组织为0至6％(图1j)。此外，在病毒感染的群中2.2至7％的有丝分裂间期细胞显示超过4个中心粒(图1f，图2b)。
感染后6天，具有细胞核异常的细胞也变得明显。一些细胞显示2至4个相同大小的细胞核，其他细胞携带一个或几个微核与大致正常大小的细胞核共存(图1g，h，图2c，d)。其他细胞含有单个大核，在用来自crest患者的血清染色后(其证明了着丝粒的数量)证明是多倍体(图1i)。有丝分裂板的吉姆萨染色显示，这些样品中25-40％的细胞是非整倍体，并且至多3％为多倍体(图2e，f)。在用m81或m81/δzr感染后6天我们对3个样品对进行了m-fish。该分析证实了用任一种类型的病毒感染的细胞中高水平的非整倍体(平均29.2％)，但也有个别细胞具有染色体缺失(2/120)或易位(3/120)。然而，这些异常都不是克隆性质的，即未在相同样品的超过2个有丝分裂中发现。在这个时间点，pwm刺激的细胞已经死亡，可能无法分析。我们继续监测m81和m81/δzr感染的细胞直至感染后第30天，此时在野生型病毒感染的细胞中开始裂解复制。到那时，在用m81/δzr感染的细胞中，中心体扩增和非整倍体比率都降低了大约3倍，这意味着导致其出现的条件随时间消失(图2a，b和e)。在感染后第3、6、15和30天对m81/δzr感染细胞的研究显示中心体扩增比率有规律地降低。相反，尽管用野生型病毒感染的细胞显示出呈现中心体扩增的细胞百分比的初始降低，但是在第30天当感染细胞开始复制时，该比率急剧增加(图2a，b)。
4个样品对的m-fish核型分析证实，感染30天后感染野生型病毒的细胞中非整倍体水平更高于感染复制缺陷型突变体的非整倍体水平(平均38.75％对9％)(图3)。前者的细胞也更高频率地携带结构重排，包括染色体缺失和易位。感染野生型的四个样品中有两个显示克隆性异常，但感染m81/δzr的样品则没有，该克隆性异常定义为对于结构异常，超过2个相同的异常有丝分裂，以及对于染色体缺失，超过3个有丝分裂。感染野生型病毒的一个b细胞样品携带复发t(6；9)，另一个显示染色体y的克隆性丢失。我们将观察结果扩展到感染b95-8的细胞，b95-8是一种几乎不诱导裂解复制的病毒株，发现它们表现出的cin和非整倍体的模式，与m81/δzr诱导的模式非常相似。我们还在感染后60天使用m-fish分析了b95-8感染的细胞系，发现其携带复发t(9；15)。
实施例3：ebv感染诱导体内染色体不稳定性
然后我们将在体外短暂暴露于ebv的静息原代b细胞注射到免疫缺陷的nsg小鼠中。尽管用野生型或复制缺陷型病毒感染静息b细胞在体外产生相同的细胞转化率和细胞生长率，但腹膜内注射用m81野生型感染的4x104b细胞比复制缺陷型突变体感染更高频率地导致肿瘤发生(图4a至c)。当注射10倍(4×105)ebv感染的细胞后，这种发病率差异消失。然而，在那种情况下，用野生型病毒感染后动物产生的肿瘤负荷更高(图4d)。肿瘤样品的免疫组化分析证实肿瘤细胞被ebv感染，并且只有野生型病毒感染的细胞经历裂解复制(图4e)。相对于m81/δzr突变体，野生型病毒感染后，这些肿瘤中的非整倍体和中心体异常的频率高2至3倍，并且这些异常中的许多异常的绝对频率高于体外观察到的频率(比较图2和图5)。
实施例4：ebv感染诱导中心体过度复制
中心体扩增可以来自s期中的中心体过度复制或来自有丝分裂滑脱(mitoticslippage)后发生的中心体积累，此时分裂中的细胞回到g1期而不分配它们的染色体，从而变成四倍体并且配备有2个中心体19。通过用抗cep170蛋白的抗体染色具有增加数量的中心体的细胞，我们研究了这两种可能性，其中cep170蛋白与母中心粒20的子分支附属物相关联(图6a至d)。中心粒过度复制导致比母中心粒更多的子中心粒，而中心粒积累则产生相同数量的母中心粒和子中心粒。用cep170特异性抗体和中心粒蛋白特异性抗体的共染色表明，超过三分之二的细胞感染了野生型m81并显示数量增加的中心粒经历了中心粒过度复制。在用m81/δzr感染的细胞中，该比例下降至约三分之一，表明在这些细胞中，中心体扩增更频繁地由中心体积累引起。我们试图将观察到的中心体过度复制与参与控制中心体复制的蛋白质表达水平的改变联系起来。然而，被m81或m81/δzr感染的细胞以相似的水平表达plk4蛋白，即中心体复制21的主要调节子(图6e)。使用对sas-6和stil特异性的抗体进行的免疫印迹获得了类似的结果，sas-6和stil是参与中心体复制的其他两种蛋白质。
实施例5：ebv颗粒的重叠感染在分裂细胞中诱导cin
迄今收集的结果显示，ebv裂解复制增加了非整倍体和中心体扩增。然而，在大多数感染的细胞群中，平均5％的细胞经历裂解复制。该亚群不能解释在感染复制病毒的细胞中观察到的更高的非整倍体和cin率。然而，经历病毒复制的细胞产生与感染的b细胞群中的邻近b细胞结合的病毒粒子。通过用具有病毒样颗粒(vlp)的m81/δzr突变体产生的lcl处理，我们测试了这些结合的颗粒是否能够产生在野生型ebv转化的b细胞中观察到的遗传异常，所述病毒样颗粒(vlp)缺少病毒dna并且无法建立慢性感染。将细胞暴露于纯化的颗粒三天，以排除来自上清液的可溶性因子的污染。我们测试了来自b95-8或m81的vlp。在任何一种vlp感染后，这种处理至少使中心体扩增和非整倍体的频率加倍(图7a，b，c)。重要的是，这些特性不能被不能与其靶标融合的vlp共享，因为它们缺少进入细胞所需的gp110蛋白。由于我们发现源自b95-8或m81的vlp之间没有差异，我们集中于可以以更高水平产生的m81vlp。我们在il4存在下将m81vlp添加到由cd40l系统扩增的b细胞中，并在这些ebv阴性细胞中获得非常相似的结果(图7d，e，f)。我们还在相同条件下用vlp处理pwm刺激的b细胞、rpe-1和hela细胞，并且还观察到携带异常中心体数目的细胞百分比的增加(图7g至j)。用gfp-中心粒蛋白-1融合蛋白稳定转染的rpe-1细胞获得了类似的结果。rpe-1细胞的m81vlp处理也使存在于胞质分裂的细胞率加倍，表明该过程因该处理而延迟。通过将用megfp-α-微管蛋白和h2b-mcherry融合蛋白稳定转染的hela细胞暴露于ebvvlp并进行活细胞成像，我们解决了该问题。尽管平均有丝分裂时间不受处理的影响，但在用vlp或野生型病毒处理的细胞中胞质分裂显著延长。
实施例6：bnrf1主要被膜蛋白诱导中心体过度复制和非整倍体
然后，我们在293细胞中表达了66种ebv蛋白，以评估它们对cin的贡献。我们发现，相对于模拟转染的细胞，bnrf1(一种强烈增强ebv感染效率的蛋白质)的转染使中心粒扩增的频率加倍，并且使多极有丝分裂的频率几乎为三倍。对cep170的染色显示，用bnrf1转染不增加携带超过2个cep170阳性中心粒的细胞的频率，表明该病毒蛋白导致中心粒过度复制。我们监测了暴露于ebv的原代b细胞中的bnrf1表达。在感染后的前5天，在感染的b细胞中可清楚地检测到该蛋白质。该观察结果表明，感染后的头几天bnrf1蛋白的水平不会因细胞分裂而降低，这符合ebv感染的b细胞在感染后头3天未启动细胞分裂的观察结果。它们也符合在感染后第3天可见的中心体扩增的动力学，在该时间点bnrf1仍可用于感染细胞。然后，我们用野生型b95-8或缺少bnrf1的缺陷型b95-8突变体重复上述重叠感染实验。虽然用复制缺陷型m81/δzr突变体产生的lcl暴露于缺少bnrf1基因的重组b95-8ebv(b95-8/δbnrf1)，并未增加这些细胞中的中心粒数量(图8a至c)，但是暴露于野生型病毒或暴露于使用bnrf1表达质粒反式互补的b95-8/δbnrf1病毒，增加了这些细胞中的中心粒数量。我们还用来自b95-8或m81野生型病毒的敲除bnrf1基因的病毒感染原代b细胞，并发现相对于感染野生型病毒的细胞，生长的细胞显示出中心粒扩增和多极有丝分裂的平均频率显著降低5到10倍(图8d至f和h至j)。用bnrf1蛋白补偿这些缺陷型bnrf1敲除病毒以重建野生型病毒，恢复了异常。类似地，虽然不太明显，但对非整倍体率的影响是可见的。相对于野生型或bnrf1补偿的病毒的感染，用b95-8/δbnrf1或m81/δbnrf1病毒感染的原代b细胞显示出非整倍体率降低2.5至3.5倍(图8g和k)。
实施例7：bnrf1蛋白定位于中心体级分
为了获得对构成bnrf1诱导中心体扩增能力的机制的一些见解，我们生成了在四环素响应启动子控制下的表达bnrf1的稳定的293细胞系。这允许在超过90％的细胞中立即诱导。排除细胞核后，在蔗糖梯度上分离细胞器。使用对γ-微管蛋白和中心粒蛋白-2特异性的抗体进行蛋白质印迹，可以鉴定含有中心体的梯度级分(图9)。使用bnrf1特异性抗体的免疫印迹显示bnrf1仅位于中心体级分中。我们还用对核磷蛋白(nucleophosmine，npm1)和人聚(adp-核糖)聚合酶1(parp1)特异性的抗体染色连续的蔗糖级分。如先前在文献中所述，这两种蛋白质也沉淀在中心体级分中。在存在或不存在bnrf1的情况下，两种细胞蛋白质的表达水平相似，尽管由半胱天冬酶切割产生的parp1的较短形式在表达病毒蛋白的细胞中过量表达。
实施例8/图10：
(a)将指定的ebv蛋白与cd2表达载体共转染到293细胞中。感染后一天，用抗cd2蛋白和抗中心粒蛋白的抗体染色转染的细胞。cd2阳性细胞是成功转染的细胞。斑点印迹显示含有超过4个中心粒的cd2阳性细胞的百分比。用cd2表达质粒转染的细胞用作阴性对照。该实验显示用bplf1、bnrf1、bglf3、brrf2、bkrf4或bxlf1转染的细胞具有异常高百分比的显示中心体扩增的细胞。(b)与(a)中相同，不同之处在于调查样品中是否存在围绕异常数量的中心体排列的有丝分裂。点图显示转染指定的ebv蛋白后这些异常的频率。(c)与(a)中的相同，不同之处在于调查样品中多极有丝分裂细胞的频率。点图显示转染指定的ebv蛋白后这些异常的频率。
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