阳离子水包油乳液的制作方法

相关申请本申请要求2010年7月6日提交的美国临时申请第61/361,892号的优先权，其内容通过引用纳入本文。技术背景核酸治疗在治疗从遗传紊乱到获得性病症的疾病中具有前景，所述疾病如癌症、感染性紊乱(aids)、心脏病、关节炎、和神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)。不仅可递送功能基因来修复遗传缺陷或诱导外源基因产物表达，而且还可递送核酸来抑制内源基因表达以提供治疗效果。基因表达的抑制可通过例如反义寡核苷酸、双链rna(如sirna、mirna)或核酶来介导。该治疗的关键步骤是体内递送核酸分子到细胞中。然而，体内递送核酸分析，尤其是rna分子，面临许多技术障碍。首先，由于细胞和血清核酸酶，体内注入的rna的半衰期仅为约70秒(参见例如kurreck,eur.j.bioch.270:1628-44(2003))。已试图通过使用化学修饰来增加注射rna的稳定性；然而，有数个例子显示化学变化导致细胞毒性效果增加或功能丧失或降低。在一个具体示例中，细胞不耐受一定剂量的rnai双链，该双链中每个第二磷酸盐替换为硫代磷酸酯(harborth,等,antisensenucleicaciddrugrev.13(2):83-105(2003))。因此，需要开发体内递送足量核酸分子(尤其是rna分子)以引起治疗响应，但对宿主没有毒性的递送系统。基于核酸的疫苗是一种感兴趣的接种疫苗方案。例如，肌肉内(im)免疫编码抗原的质粒dna可诱导细胞和体液免疫响应并保护免受攻击。dna疫苗比使用蛋白抗原或减毒病原体的传统疫苗具有一些优势。例如，与蛋白疫苗相比，dna疫苗可在产生具有天然构型的适当折叠抗原和产生细胞免疫响应中更加有效。dna疫苗还不具有与灭活或减毒病原体相关的一些安全问题。例如，灭活的病毒制剂可包含残留的活病毒，且减毒病毒可突变并回复为致病表型。基于核酸的疫苗的另一限制是在非人灵长类和人中通常需要大剂量的核酸以获得有效的免疫响应。因此，需要递送系统和佐剂来提高基于核酸的疫苗的效力。已开发各种方法用于将核酸分子引入细胞，如磷酸钙转染、聚戊二烯转染、原生质体融合、电穿孔、微注射和脂质转染。阳离子脂质已被广泛配置为脂质体来递送基因到细胞中。然而，由于血清含阴离子材料，即使少量血清(～10％)也可显著降低脂质体/dna复合物的转染活性。近期，开发了阳离子脂质乳液来递送dna分子到细胞中。参见例如，kim等，internationaljournalofpharmaceutics,295,35-45(2005)。美国专利号6,753,015和6,855,492描述了用阳离子微粒递送核酸分子到脊椎动物对象中的方法。所述微粒包括聚合物如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐等，并用阳离子表面活性剂来形成。核酸分子吸附在所述微粒的表面。kim等(pharmaceuticalresearch,18卷,第54-60页,2001)和chung等(journalofcontrolledrelease,71卷,339-350页,2001)描述了用于提高dna分子体外和体内转染效力的各种水包油乳液制剂。ott等(journalofcontrolledrelease,79卷,第1-5页,2002)描述了涉及阳离子亚微米乳液作为dna递送系统/佐剂的方案。所述亚微米乳液方案基于mf59，mf59是溶于水佐剂的有效鲨烯，其已大规模生产并用于市售批准的产品1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)用于促进质粒dna的细胞内递送。尽管基于dna的疫苗在预防和治疗疾病中前景广阔，有关其安全性已引起广泛关注。引入的dna分子能有效整合到所述宿主基因组中或，由于其分布到各组织中而引起不需要的持续抗原表达。此外，某些dna病毒还用作递送dna分子的载剂。由于其感染性质，该病毒可实现非常高的转染率。所用病毒通常以在转染细胞中不形成功能性感染颗粒的方式进行遗传修饰。尽管采用这些预防措施，仍不可能排除引入基因和病毒基因不受控增殖的风险，这是由于例如潜在的重组事件。这还产生了dna通过例如重组而插入宿主细胞基因组的完整基因中的风险，结果是该基因可能突变并因此完全或部分失活或可产生错误信息。换句话说，对细胞重要的基因产物的合成可被完全抑制或者表达了修饰或不正确的基因产物。此外，通常难以大规模生产和纯化临床级的病毒载体。如果dna整合入涉及调节细胞生长的基因，则产生特定风险。在该情况中，所述宿主细胞可能退化并引起癌症或肿瘤形成。此外，若引入细胞的dna待表达，需要对应的dna载剂以包含强启动子，如病毒cmv启动子。此类启动子整合到处理细胞的基因组中可引起细胞中基因表达调节的不需要改变。使用dna作为试剂诱导免疫响应(如作为疫苗)的另一风险是在已引入外源dna的患者中引入致病性抗dna抗体，从而会引起不需要的免疫响应。编码抗原或其衍生物的rna分子还可用作疫苗。rna疫苗比dna疫苗具有优势。首先，rna不能整合到宿主基因组中，因此消除了恶性疾病的风险。第二，由于rna的快速降解，外源基因的表达通常寿命短，避免了抗原不受控的长期表达。第三，rna分子仅需递送到胞质以表达编码的抗原，而dna分子必需穿过核膜。然而，与基于dna的疫苗相比，对基于rna的疫苗的关注相对较少。rna和寡核苷酸是亲水的带负电分子，其作为治疗剂或疫苗给予时很易受到核酶降解。此外，rna和寡核苷酸不能主动转运到细胞中。参见，例如vajdy,m.,等,mucosaladjuvantsanddeliverysystemsforprotein-,dna-andrna-basedvaccines(用于基于蛋白、dna和rna的疫苗的粘膜佐剂和递送系统),immunolcellbiol,2004.82(6):第617-27页。ying等(naturemedicine,5卷,第823-827页,1999)描述了自复制rna疫苗，其中递送了编码β-半乳糖苷酶的裸rna并报道了cd8+细胞诱导。montana等(bioconjugatechem.2007,18,第302-308页)描述了用阳离子固体-脂质纳米颗粒作为rna载体以用于基因转移。显示固-液纳米颗粒保护rna分子免于降解，且在微注射rna-颗粒复合物到海胆卵后检测到报道蛋白(荧光素)表达。wo2010/009277公开的纳米脂质肽颗粒(nlpp)包括(a)两亲性肽,(b)脂质，和(c)至少一种免疫原性物质。在某些实施方式中，nlpp还纳入带正电“捕获剂”如阳离子脂质。所述捕获剂用于锚定带负电免疫原性物质(如dna分子或rna分子)。nlpp的制备需要两性肽，其用于溶解所述脂质组分并形成纳米颗粒。因此，需要提供用于核酸分子或其它带负电分子的递送系统。所述递送系统用于基于核酸的疫苗，尤其是基于rna的疫苗。技术实现要素：本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其可用于递送带负电分子如rna分子到细胞。所述乳液分子包括油核心和阳离子脂质。所述阳离子脂质可与所述带负电分子接触，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述阳离子乳液尤其适于向细胞递送核酸分子(如编码抗原的rna分子)和配置基于核酸的疫苗。在一个方面，本发明提供的组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的rna分子，其中，所述颗粒包括(a)25℃时为液相的油核心，和(b)阳离子脂质。优选地，所述阳离子水包油乳液颗粒不是纳米脂质肽颗粒(nlpp)。优选所述油核心4℃时为液相。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述乳液经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述乳液还包含足以使所述乳液等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液还包含表面活性剂，如非离子表面活性剂。示例性非离子表面活性剂包括例如span85(失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯),或其组合。所述阳离子水包油乳液可含约0.01％-约2.5％(v/v)的表面活性剂。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.08％(v/v)吐温80，或约0.5％(v/v)吐温80和约0.5％(v/v)span85。可使用聚乙二醇(peg)或peg-脂质，如peg2000pe、peg5000pe、peg1000dmg、peg2000dmg、peg3000dmg或其组合。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.005％-约1.25％(v/v)表面活性剂。例如，包含与rna-乳液复合物的组合物可包含约0.04％(v/v)吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)，或约0.25％(v/v)吐温80和约0.25％(v/v)span85(失水山梨糖醇三油酸酯)。在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液还包含磷脂。示例性磷脂包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dope)、1,2-二植烷酰-sn-肝油-3-磷脂酰乙醇胺(dpype)或蛋磷脂酰胆碱(蛋pc)。例如，所述阳离子水包油乳液可包括约0.1mg/ml–约20mg/ml(优选约0.1mg/ml–约10mg/ml)dope，或者约0.1mg/ml–约20mg/ml(优选约0.1mg/ml–约10mg/ml)dpype，或约0.1mg/ml–约20mg/ml(优选约0.1mg/ml–约10mg/ml)蛋pc。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包括约0.05mg/ml–约10mg/ml(优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)dope，或者约0.05mg/ml–约10mg/ml(优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)dpype，或约0.05mg/ml–约10mg/ml(优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)蛋pc。在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液在所述乳液的水相中还包括聚合物或表面活性剂。示例性聚合物包括泊洛沙姆如f127(环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物:h(och2ch2)x(och3ch(ch3))y(och2ch2)zoh)。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.05％-约20％(w/v)聚合物或约0.1％-约10％(w/v)聚合物，如0.5％(w/v)或1％(w/v)f127。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.025％-约10％(v/v)聚合物，或约0.5％-约5％(v/v)聚合物，如0.25％(w/v)，或0.5％(w/v)f127。所述乳液可包含具有下述功能的组分：促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、有利于带负电分子(如rna分子)合适的解复合/释放、增加带负电分子的稳定性(如防止rna分子降解)或防止乳液颗粒的聚集。在某些实施方式中，所述油核心可包含选自下述的油：蓖麻油、椰子油、玉米油、棉籽油、月见草油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻子油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油、鲨烯、葵花子油、小麦胚芽油、矿物油或其组合。所述油优选为大豆油、葵花籽油、橄榄油、鲨烯或其组合。所述阳离子水包油乳液可包括约0.2％-约20％(v/v)油，优选约0.08％-约5％(v/v)油、约0.08％(v/v)油、约4％-约5％(v/v)油、约4％油、约4.3％油或约5％油。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.1％-约10％(v/v)油，优选约2％-约2.5％(v/v)油。在一些实施方式中，所述阳离子脂质选自下列：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(dotap)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(dstap)、wo2011/076807(通过引用纳入本文)的表6(112–139页)中公开的脂质e0001-e0118或e0119-e0180、或其组合。特别优选的阳离子脂质包括dotap、dc胆固醇和dda。在一些实施方式中，所述阳离子脂质选自下列：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(dotap)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(dstap)、wo2011/076807(通过引用纳入本文)的表6(112–139页)中公开的脂质e0001-e0118或e0119-e0180、n-[1-(2、3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二油酰-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(doepc)、1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、1,2-二亚油氧基-3-二甲基氨丙烷(dlindma)、或其组合。特别优选的阳离子脂质包括dotap、dc胆固醇、dda、dotma、doepc、dstap、dodac、dodap和dlindma。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约3mg/ml，优选约0.8mg/ml-约1.6mg/mldotap。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.4mg/ml-约1.5mg/ml，优选约0.4mg/ml-约0.8mg/mldotap。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.62mg/ml-约4.92mg/mldc胆固醇。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.31mg/ml-约2.46mg/mldc胆固醇。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml-约1.45mg/mldda。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.365mg/ml-约0.725mg/mldda。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约3mg/ml，优选约0.8mg/ml-约1.6mg/mldotma。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.4mg/ml-约1.5mg/ml，优选约0.4mg/ml-约0.8mg/mldotma。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约3mg/ml，优选约0.8mg/ml-约1.8mg/mldoepc。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.4mg/ml-约1.5mg/ml，优选约0.4mg/ml-约0.9mg/mldoepc。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml-约1.45mg/mldodac。包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物可包含约0.365mg/ml-约0.725mg/mldodac。任选地，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在一个示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述阳离子水包油乳液包含(a)约0.5％(v/v)油，和(b)阳离子脂质。在一个示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述组合物包含(a)约0.25％(v/v)油，和(b)阳离子脂质。在另一个示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心，(b)阳离子脂质，和(c)磷脂。优选的磷脂包括例如dpype、dope和eggpc。所述组合物(带负电分子-乳液复合物)优选包含约0.05mg/ml–约10mg/ml(更优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)dope，或者约0.05mg/ml–约10mg/ml(更优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)dpype，或约0.05mg/ml–约10mg/ml(更优选约0.05mg/ml–约5mg/ml)蛋pc。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dotap，其中所述水包油乳液包含约0.8mg/ml–约3.0mg/mldotap，优选约0.8mg/ml–约1.6mg/mldotap。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲液(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dotap，其中所述组合物包含约0.4mg/ml–约1.5mg/mldotap，如0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml等。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dc胆固醇，其中所述水包油乳液包含约2.46mg/ml–约4.92mg/mldc胆固醇。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dc胆固醇，其中所述组合物包含约1.23mg/ml–约2.46mg/mldc胆固醇。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dda，其中所述水包油乳液包含约0.73mg/ml–约1.45mg/mldda。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dda，其中所述组合物包含约0.365mg/ml–约0.725mg/mldda，如0.725mg/ml。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dotma，其中所述组合物包含约0.4mg/ml–约0.8mg/mldotma。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)doepc，其中所述组合物包含约0.4mg/ml–约1.5mg/mldoepc，优选约0.4mg/ml–约0.9mg/mldoepc。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一示例中，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物，其中，所述颗粒包含(a)油核心和(b)dodac，其中所述组合物包含约0.365mg/ml–约0.725mg/mldodac。在一些实施方式中，所述带负电分子是rna，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。任选地，所述组合物经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。任选地，所述组合物还包含足以使所述组合物等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。带负电分子的示例包括含带负电肽的抗原、编码一种或多种含肽抗原的核酸分子(如rna或dna)、带负电小分子和带负电免疫佐剂。带负电免疫佐剂包括例如免疫刺激寡核苷酸(如cpg寡核苷酸)、单链rna、小分子免疫增强剂(smip)等。带负电小分子包括例如膦酸盐/酯、氟代膦酸盐/酯等。在某些实施方式中，所述带负电分子是编码抗原的核酸分子，如rna分子。在某些实施方式中，rna分子是自复制rna分子，如α病毒衍生的rna复制子。在另一方面，本发明提供含乳液颗粒以及与所述乳液颗粒复合的核酸分子的免疫原性阳离子水包油乳液，所述颗粒包含油核心(优选25℃时为液相)和阳离子脂质，其中所述乳液颗粒的平均直径为约80nm–约180nm且所述乳液的n/p比至少为4:1。在某些实施方式中，所述核酸分子是rna，如自复制rna。优选地，所述免疫原性阳离子水包油乳液经缓冲(如用柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等)且ph为约6.0-约8.0；优选为约6.2-约6.8，并含有不超过30mm无机盐(如nacl)。优选地，所述免疫原性阳离子水包油乳液还包含足以使所述乳液等渗的非离子等张剂如糖、糖醇或其组合。在另一方面，本发明提供制备包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物的方法，所述方法包括：(a)制备阳离子水包油乳液，其中所述乳液包括：(1)约0.2％-约20％(v/v)油,(2)约0.01％-约2.5％(v/v)表面活性剂，和(3)选自下组的阳离子脂质：(i)约0.8mg/ml–约1.6mg/mldotap，(ii)约2.46mg/ml–约4.92mg/mldc胆固醇，和(iii)约0.73mg/ml-约1.45mg/mldda，和(b)向所述阳离子水包油乳液中添加所述带负电分子，从而所述带负电分子与所述乳剂的颗粒复合。在另一方面，本发明提供制备包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物的方法，所述方法包括：(a)制备阳离子水包油乳液，其中所述乳液包括：(1)约0.2％-约20％(v/v)油,(2)约0.01％-约2.5％(v/v)表面活性剂，和(3)选自下组的阳离子脂质：(i)约0.8mg/ml–约1.6mg/mldotap，(ii)约2.46mg/ml–约4.92mg/mldc胆固醇，和(iii)约0.73mg/ml-约1.45mg/mldda，(iv)约0.8mg/ml–约1.6mg/mldotma,(v)约0.8mg/ml–约1.8mg/mldoepc；和(vi)约0.73mg/ml–约1.45mg/mldodac；和(b)向所述阳离子水包油乳液中添加所述带负电分子，从而所述带负电分子与所述乳剂的颗粒复合。在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液通过下述方法制备：(1)组合所述油和所述阳离子脂质，形成所述乳液的油相；(2)提供所述乳液的水相(即连续相)；和(3)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。所述阳离子脂质可在所述油中直接溶解。或者，所述阳离子脂质可溶于任何合适溶剂，如氯仿(chcl3)或二氯甲烷(dcm)。也可使用异丙醇。所述溶解可在所述油相加入所述水相之前蒸发，或在所述油相加入所述水相之后但在均质化之前蒸发。或者，在脂质溶解度可能是问题的情况中，可用仍在所述油相的溶剂(如dcm)制备初级乳液。在该情况中，所述溶剂可在二次均质化前直接从乳液中蒸发。可包括其它任选步骤以：促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、增加带负电分子的稳定性(如防止rna分子降解)、有利于带负电分子(如rna分子)合适的去复合/释放、或阻止乳液颗粒的聚集。例如，聚合物(如f127)或表面活性剂可加入所述乳液的水相。在一个示例性实施方式中，在与所述乳液颗粒复合前f127被加入所述rna分子中。添加f127可增加rna分子的稳定性并进一步减少rna降解。泊洛沙姆聚合物还可促进rna分子的释放并防止乳液颗粒的聚集。最终，泊洛沙姆聚合物还具有免疫调节效果。参见例如westerink等,vaccine.2001dec12；20(5-6):711-23。优选地，rna-阳离子颗粒复合物的rna分子对rna酶降解的抗性比未复合的rna分子强。另一方面，如本文所述，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的药物组合物，并且还包括一种或多种药学上可接受载体，稀释剂或赋形剂。在优选实施方式中，所述药物组合物是疫苗。在另一方面，本发明提供在对象中产生免疫响应的方法，所述方法包括给予需要的对象本文所述的组合物。本发明还涉及本文所述用于治疗的药物组合物，和本文所述药物组合物在生产增强或产生免疫响应的药物中的用途。附图简要说明图1显示用阳离子纳米乳液(cne)颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活。用cne配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道1和2:rna酶消化前(1)和后(2)的小鼠胸腺rna；泳道3和4:rna酶消化前(3)和后(4)用cne01以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道5和6:rna酶消化前(5)和后(6)用cne01以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道7和8:rna酶消化前(7)和后(8)用cne17以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道9：rna酶消化前(9)用cne17以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna。图2显示用cne颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活。用cne配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道10:rna酶消化后(10)用cne17以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道11和12:rna酶消化前(11)和后(12)的小鼠胸腺rna；泳道13和14:rna酶消化前(13)和后(14)用cne12以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道15和16:rna酶消化前(15)和后(16)用cne12以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道17和18:rna酶消化前(17)和后(18)用cne13以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道19和20:rna酶消化前(19)和后(20)用cne13以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna。图3显示用cne颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活。用cne配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道1和2:rna酶消化前(1)和后(2)的小鼠胸腺rna；泳道3和4:rna酶消化前(3)和后(4)用cne01以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道5和6:rna酶消化前(5)和后(6)的用cne01以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道7和8:rna酶消化前(7)和后(8)用cne02以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道9：rna酶消化前(9)用cne02以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna。图4显示用cne颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活，将配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道15和16:rna酶消化前(15)和后(16)的小鼠胸腺rna；泳道17和18:rna酶消化前(17)和后(18)用cne04以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道19和20:rna酶消化前(19)和后(20)用cne04以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道21和22:rna酶消化前(21)和后(22)用cne05以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道23和24：rna酶消化前(23)和后(24)用cne05以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna。图5显示用cne颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活，将配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道1和2:rna酶消化前(1)和后(2)的小鼠胸腺rna；泳道3和4:rna酶消化前(3)和后(4)用cne17以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道5和6:rna酶消化前(5)和后(6)用cne17以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道7和8:rna酶消化前(7)和后(8)用cne27以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道9和10：rna酶消化前(9)和后(10)用cne27以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道11和12:rna酶消化前(11)和后(12)的小鼠胸腺rna；泳道13和14:rna酶消化前(13)和后(14)用cne32以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道15和16:rna酶消化前(15)和后(16)用cne32以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna.。图6显示用cne颗粒复合rna分子后存在rna酶时小鼠胸腺rna的稳定性。所有样品用rna酶孵育30分钟。rna酶用蛋白激酶k灭活，将配置的样品去复合并通过变性凝胶电泳分析rna完整性。未标记泳道含分子量标记。泳道1和2:rna酶消化前(1)和后(2)的小鼠胸腺rna；泳道3和4:rna酶消化前(3)和后(4)用cne35以n/p比10:1复合的小鼠胸腺rna；泳道5和6:rna酶消化前(5)和后(6)用cne35以n/p比4:1复合的小鼠胸腺rna；泳道7:rna酶消化前的小鼠胸腺rna。图7显示实施例中所用载体的序列。图7a显示质粒a317的序列(seqidno:1)，其编码rsv-f抗原。图7b显示质粒a306的序列(seqidno:2)，其编码分泌型人胎盘碱性磷酸酶(seap)。图7c显示质粒a375的序列(seqidno:3)，其编码rsv-f抗原。图8a显示体内seap试验的结果，使用以10:1n/p比复合cne17的1μgrna复制子a306。图8b是balb/c小鼠在2wp1和2wp2时间点的总igg效价(将复合cne17的rna复制子a317给予所述balb/c)。图9a-9c显示不同缓冲组合物对粒度的影响。图9a显示糖、盐和聚合物f127对以n/p比10:1复合rna的cne17乳液中粒度的影响。图9b显示柠檬酸盐缓冲液对cne17乳液粒度的影响。图9c显示聚合物(f68、f127和peg300)对粒度的影响。发明详述1.概述本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其可用于递送带负电分子如rna分子到细胞。所述乳液颗粒包括油核心和阳离子脂质。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，例如通过静电力和疏水/亲水相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒上。本文所述阳离子乳液尤其适于体内递送核酸分子如rna分子(如编码蛋白或肽的rna，小干扰rna，自复制rna等)到细胞。本发明基于以下发现：阳离子水包油乳液可用于递送带负电分子到细胞中。所述乳液颗粒包含油核心和能与带负电分子相互作用的阳离子脂质。在优选实施方式中，rna分子通过静电力和疏水/亲水相互作用与阳离子水包油乳液的颗粒复合。复合的rna分子相对于游离rna稳定且受到保护免于rna酶介导的降解，并且能被细胞更有效摄入。此外，当递送所述rna以诱导编码蛋白表达时(例如rna疫苗的情况中)，所述编码蛋白的免疫原性可由于所述乳液的佐剂效果而增强。因此，除了更有效递送带负电分子(如编码抗原的rna分子)之外，阳离子乳液还可通过佐剂活性增强免疫响应。例如，如本文所述和示例，发明人使用呼吸道合胞病毒(rsv)免疫的小鼠模型和棉鼠模型评估了一系列阳离子水包油乳液的体内效果。结果证明rna分子与阳离子乳液复合的制剂与游离rna制剂相比产生显著更强的免疫响应。在一些情况中，给予1μg与阳离子水包油乳液复合的rna后获得的针对rna编码蛋白的平均抗体效价与用10倍游离rna(10μg剂量的游离rna)获得的效价相当。除了在宿主中更高的免疫响应，本文所述制剂的另一优势是不同研究中的宿主动物之间和不同宿主动物之间的免疫响应相对于游离(未配置)rna的波动更小。因此，在一个方面，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的rna分子的组合物，其中，所述颗粒包括(a)25℃为液相的油核心，和(b)阳离子脂质。优选地，所述阳离子水包油乳液颗粒不是纳米脂质肽颗粒(nlpp)。优选所述油核心4℃时为液相。阳离子乳液颗粒还可包括表面活性剂(如吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、span85(失水山梨糖醇三油酸酯)或其组合)、磷脂或其组合。所述乳液还可在所述乳液的水相(连续相)中包含聚合物(如f127)。在另一方面，本发明还提供数种具体的阳离子水包油乳液制剂，其可用于递送带负电分子。在另一方面，本发明提供制备包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物的方法。生产本文所述阳离子乳液的一个示例性方案是通过均质化在水相中分散油相。促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、增加带负电分子的稳定性(如防止rna分子降解)有利于带负电分子(如rna分子)合适的去复合/释放、或防止乳液颗粒聚集的其它任选步骤包括例如，在油相中加入二氯甲烷(dcm或亚甲基氯)；在均质化前或后使dcm蒸发；混合所述阳离子脂质和合适的溶剂，形成脂质体悬液；或在所述乳液的水相中添加聚合物(如f127)或表面活性剂。或者，所述阳离子脂质可在所述油中直接溶解。本发明所述阳离子乳液可用于递送带负电分子，如核酸(如rna)。所述组合物可给予需要的对象来产生或增强免疫响应。所述组合物还可与另一免疫原性分子、免疫原性组合物或疫苗共递送以增强经诱导免疫响应的有效性。2.定义如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容中另有明确规定。本文所用的术语“约”指某数值的+/-10％。术语“表面活性剂”是本领域术语，通常指具有优选由水溶剂化的亲水基团(如极性基团)和不能由水良好溶剂化的疏水基团的任何分子。术语“非离子表面活性剂”是本领域已知术语，通常指亲水基团(如极性基团)不电离的表面活性剂分子。术语“聚合物”指由连接在一起的单独化学部分组成的分子，所述部分可相同或不同。如本文所用，术语“聚合物”指尾尾相连而形成线性分子的单独化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的单独化学部分。示例性聚合物包括例如泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。“缓冲液”指阻止溶液ph变化的水溶液。本文所用的“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”指在核苷的含氮碱基(如胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)，腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g))中或其上含一种或多种化学修饰(如取代)的核苷酸。核苷酸类似物还可在核苷的糖部分(如核糖、脱氧核糖、修饰的核糖、修饰的脱氧核醣、6元糖类似物或开链糖类似物)、或磷酸盐中或其上含化学修饰。如本文所述，“糖(saccharide)”涵盖直链或环形的单糖、寡糖或多糖或其组合以形成糖链。寡糖是具有2种或更多单糖残基的糖。糖的示例包括葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、蔗糖和海藻糖。术语"自复制rna"、"rna复制子"或"rna载体"是本领域术语，通常指能在体内，通常在靶细胞内指导其自身扩增或自我复制的rna分子。所述rna复制子直接使用，无需将dna引入细胞并转运到可发生转录的核中。通过使用rna载体直接递送入宿主细胞的胞质，可有效发生异源核酸序列的自主复制和翻译。α病毒衍生的自复制rna可按顺序包含下述元件:顺式复制所需的5'病毒序列(还称为5'cse，在背景中)、表达时编码生物活性α病毒非结构蛋白(如nsp1,nsp2,nsp3,nsp4)的序列，顺式复制所需的3'病毒序列(还称为3'cse，在背景中)，和多腺苷酸束。α病毒衍生的自复制rna还可含病毒亚基因组“连接区域”启动子、来自一种或多种结构蛋白基因或其部分的序列、大小足够产生重组α病毒颗粒的外源核酸分子、以及待表达的异源序列。术语“佐剂”指协助或改良药物作用的任何物质，包括但不限于免疫佐剂，其能增加和/或使对抗原的免疫响应多样化。因此，免疫佐剂包括能增强对抗原免疫响应的化合物。免疫佐剂可增强体液和/或细胞免疫。刺激先天免疫响应的物质包括在本文免疫佐剂的定义中。免疫佐剂还可称为“免疫增强剂”。本文所用的“抗原”或“免疫原”指含能引起免疫学应答的一个或多个表位(如线性的、成构象的或兼有)的分子。本文所用“表位”是给定物质(例如，抗原性分子或抗原性复合物)中确定其免疫学特异性的部分。表位包含在所述抗原的定义范围内。本文所用的术语“抗原”或“免疫原”包括亚基抗原，即与该抗原天然关联的全生物体中分开且单独的抗原。抗体如抗独特型抗体，或其片段以及能模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位也涵盖在本文所用的抗原定义下。“免疫学响应”或“免疫应答”是对象中发展出对抗原或免疫佐剂的体液和/或细胞免疫应答。免疫应答包括先天和适应性免疫应答。先天免疫应答是为免疫系统提供一线防御的快速作用应答。相反，适应性免疫采用选择和克隆扩增含体细胞重排受体基因的免疫细胞(例如t-和b-细胞受体)从而提供特异性和免疫记忆，所述受体基因识别给定病原或疾病(例如肿瘤)的抗原。在其很多效应中，先天免疫应答引起炎性细胞因子的快速突释并活化抗原呈递细胞(apc)如巨噬细胞和树突细胞。为区分病原体和自身组分，先天免疫系统利用多种相对不变的受体检测病原体的特征物，这些特征物称为病原体相关分子模式或pamp。已知实验性疫苗中添加微生物组分导致发生强烈且持续的适应性免疫应答。据报道，这种免疫应答增强的机理涉及模式识别受体(prr)，其在包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、b细胞和一些非免疫细胞如上皮和内皮细胞在内的多种免疫细胞上差异表达。prr的参与导致这类细胞中的一些被活化并分泌细胞因子和趋化因子，以及其他细胞成熟并迁移。这以串联方式产生引起适应性免疫应答确立的炎性环境。prr包括非吞噬细胞受体，如toll样受体(tlr)和核苷酸结合寡聚结构域(nod)蛋白，和诱发吞噬作用的受体如清除受体、甘露糖受体和β-葡聚糖受体。已报道的tlr(与一些已报道配体的示例一起，可在本发明的不同实施方式中用作免疫原性分子)包括下列：tlr1(来自分枝杆菌(mycobacteria)、奈瑟菌(neisseria)的细菌脂蛋白)，tlr2(酵母聚糖酵母颗粒、肽聚糖、脂蛋白、糖脂、脂多糖)，tlr3(病毒双链rna、聚ic)，tlr4(细菌脂多糖、植物产物紫杉醇)，tlr5(细菌鞭毛)，tlr6(酵母聚糖颗粒、脂磷壁质酸、支原体的脂肽)，tlr7(单链rna、咪喹莫特、雷西莫特(resimiquimod)和其他合成化合物如洛索立宾和溴匹立明)，tlr8(单链rna、雷西莫特)和tlr9(cpg寡核苷酸)等。树突细胞被视为在启动原初cd4+辅助t(th)细胞和诱导cd8+t细胞分化成杀伤细胞中一些最重要的细胞类型。据报道，tlr信号传递在确定这些辅助t细胞应答特性中起重要作用，例如tlr信号的特性决定所观察到th应答的具体类型(例如，th1与th2应答)。产生抗体(体液)与细胞免疫的组合作为th1型应答的一部分，而th2型应答主要是抗体应答。已记载不同tlr配体如cpgdna(tlr9)和咪唑喹啉(tlr7,tlr8)在体外刺激免疫细胞产生细胞因子。咪唑喹啉是显示为tlr激动剂的第一种类似药物的小化合物。进一步的信息参见例如a.pashine,n.m.valiante和j.b.ulmer，naturemedicine,11,s63-s68(2005)，k.s.rosenthal和d.h.zimmerman，clinicalandvaccineimmunology,13(8),821-829(2006)及其所引文献。出于本发明的目的，体液免疫应答指由抗体分子介导的免疫应答，而细胞免疫应答是t-淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解t细胞(ctl)的抗原特异性应答。ctl具有针对肽抗原的特异性，肽抗原与主要组织相容性复合体(mhc)编码并在细胞表面表达的蛋白关联呈递。ctl帮助诱导并促进胞内微生物的胞内破坏，或感染此类微生物的细胞裂解。细胞免疫的另一方面涉及辅助t细胞的抗原特异性应答。辅助t细胞协助刺激非特异性效应细胞的功能并集中其活性，所述细胞针对在表面展示mhc分子相关肽抗原的细胞。"细胞免疫应答"也指由活化的t细胞和/或包括cd4+和cd8+t细胞衍生细胞在内的其他白细胞产生细胞因子、趋化因子和其他此类分子。因此，引起细胞免疫应答的组合物如免疫原性组合物或疫苗可通过在细胞表面呈递mhc分子相关抗原而使脊椎动物对象致敏。细胞介导的免疫应答针对在表面呈递抗原的细胞或其附近。此外，可产生抗原特异性t淋巴细胞用于今后保护免疫宿主。特定抗原或组合物刺激细胞介导免疫应答的能力可通过本领域已知的多种试验确定，例如淋巴增殖(淋巴细胞活化)试验、ctl细胞毒性细胞试验，通过测定致敏对象中抗原特异性t-淋巴细胞，或通过测量t细胞响应抗原再刺激的细胞因子生成。这些试验为本领域熟知。参见例如erickson等，(1993)j.immunol.151:4189-4199；doe等，(1994)eur.j.immunol.24:2369-2376。因此，本文所用的免疫应答可刺激ctl生成和/或辅助t细胞产生或激活。感兴趣的抗原还可引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫应答可包括例如以下一种或多种效果：由例如b-细胞生产抗体；和/或特异性针对感兴趣组合物或疫苗中一种或多种抗原的抑制t-细胞和/或γδt-细胞的激活。例如，这些应答可用于中和感染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒性(adcc)来为经免疫宿主提供保护。这些应答可采用本领域熟知的标准免疫试验和中和试验确定。与不同组合物中等量抗原(如将抗原作为可溶蛋白给予)所引起的免疫应答相比，本发明组合物具有更强的引发免疫应答能力时显示对给定抗原的“增强的免疫原性”。因此，例如，因为所述组合物产生更强的免疫应答或因为在给予对象中实现免疫应答所需抗原剂量更低或更少，组合物可显示“增强的免疫原性”。测定所述增强的免疫原性可通过例如将本发明的组合物和抗原对照给予动物并比较二者的试验结果。3.阳离子水包油乳液本文公开的阳离子水包油乳液一般以本领域常见方法描述，通过浓缩用于制备所述乳液的组分。本领域应理解在包括灭菌和其它下游方法在内的乳液生产工艺中，少量油(如鲨烯)、阳离子脂质(如dotap)、或其它组分可能丢失，且这些组分在最终产物(如待给予的包装灭菌乳液)中的实际浓度可稍低于起始含量，有时直至约10％或直至约20％。本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其可用于递送带负电分子如rna分子。所述乳液颗粒包括油核心和阳离子脂质。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，例如通过静电力和疏水/亲水相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒上。本文所述阳离子乳液特别适于体内递送带负电分子如编码抗原的rna分子或小干扰rna到细胞中。例如，本文所述阳离子乳液提供递送编码抗原的rna作为疫苗的优势，所述rna包括自复制rna。所述水包油乳液的颗粒类似有油中央核心的胶束。所述油核心包被有阳离子脂质，其将所述油滴分散在水(连续)相中作为胶束样液滴。所述乳液中可存在一种或多种任选组分，如下述表面活性剂和/或磷脂。例如，一种或多种表面活性剂可用于促进颗粒形成和/或稳定乳液颗粒。在该情况中，所述油核心包被有阳离子脂质以及表面活性剂以形成胶束样液滴。类似地，若所述脂质用作分散油滴的乳化剂，一种或多种脂质(如中性脂质、醇脂或磷脂)还可存在于所述乳液颗粒的表面。水包油乳液的颗粒具有1微米或更小的平均直径(即数量平均直径)。特别需要所述阳离子乳液的平均粒度(即数量平均直径)为约900nm或更小、约800nm或更小、约700nm或更小、约600nm或更小、约500nm或更小、约400nm或更小、300nm或更小、或200nm或更小，例如约1nm-约1μm、约1nm-约900nm、约1nm-约800nm、约1nm-约700nm、约1nm-约600nm、约1nm-约500nm、约1nm-约400nm、约1nm-约300nm、约1nm-约200nm、约1nm-约175nm、约1nm-约150nm、约1nm-约125nm、约1nm-约100nm、约1nm-约75nm、或约1nm-约50nm。特别需要所述阳离子乳液的平均颗粒直径为约180nm或更少、约170nm或更少、约160nm或更少、约150nm或更少、约140nm或更少、约130nm或更少、约120nm或更少、约110nm或更少、或约100nm或更少；例如约80nm-180nm、约80nm-170nm、约80nm-160nm、约80nm-150nm、约80nm-140nm、约80nm-130nm、约80nm-120nm；from约80nm-110nm、或约80nm-100nm。特别优选的平均颗粒直径是约100nm。所述乳液颗粒的大小可通过改变表面活性剂与油的比例(增加比例则降低液滴大小)、均质化的操作压力(增加均质化的操作压力通常降低液滴大小)、温度(提高温度则降低液滴大小)、改变油的类型和其它工艺参数而变化，如下所详述。水相中包括某些类型缓冲液也可影响粒度。在一些情况中，rna疫苗背景下，所述乳液颗粒的大小可影响rna乳液复合物的免疫原性。因此，乳液平均粒度的优选范围为直径约80nm–约180nm。本文所述乳液颗粒可与带负电分子复合。与带负电分子复合前，所述颗粒的总净电荷(通常测量为ζ电势)应为正(阳离子)。颗粒的总净电荷可变化，取决于乳液中阳离子脂质的种类和阳离子脂质的含量、乳液中油的含量(如更高百分比的油通常引起颗粒表面较低电荷)，且可受到乳液中存在的任何其它组分(如表面活性剂和/或磷脂)的影响。在示例性实施方式中，预复合颗粒的ζ电势通常高于10mv。预复合颗粒的ζ电势优选不超过约50mv、不超过约45mv、不超过约40mv、不超过约35mv、不超过约30mv、不超过约25mv、不超过约20mv；约5mv-约50mv、约10mv-约50mv、约10mv-约45mv、约10mv-约40mv、约10mv-约35mv、约10mv-约30mv、约10mv-约25mv,或约10mv-约20mv。ζ电势可受(i)乳液ph，(ii)乳液导电率(如盐度),和(iii)乳液中各种组分浓度(聚合物、非离子表面活性剂等)的影响。cne的ζ电势用马尔文(malvern)nanoserieszetasizer(麻萨诸塞州韦斯特伯勒)测量。样品在水中1:100稀释(粘度:0.8872cp,ri:1.330,电介质常数:78.5)并添加到聚苯乙烯胶乳毛细管细胞中(麻萨诸塞州韦斯特伯勒的马尔文)。ζ电势用2分钟平衡时间在25℃测量并用smoluchowski模型(f(ka)值＝1.5)分析。数据报道为mv。本发明示例性阳离子乳液为cne17。cne17的油核心是鲨烯(4.3％w/v)且阳离子脂质是dotap(1.4mg/ml)。cne17还包括表面活性剂span85((失水山梨糖醇三油酸酯)0.5％v/v)和吐温80((聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)0.5％v/v)。因此，cne17的颗粒包含包被有span85、tween80和dotap的鲨烯核心。显示rna分子在4:1n/p比和10:1n/p比时有效复合cne17颗粒。其它示例性阳离子乳液包括例如cne05(0.5％w/v鲨烯,0.08％吐温80、和1.2mg/mldotap)、cne12(4.3％鲨烯,0.5％span85,0.5％吐温80,和2.46mg/mldc胆固醇)、cne13(4.3％鲨烯,0.5％span85,0.5％吐温80,和1.45mg/mldda)、和本文所述其它乳液。本发明水包油乳液的单独组分为本领域已知，尽管该组合物未以本文所述的方式组合。因此，尽管下面在一般和一些细节方面描述了优选实施方式，但单独组分为本领域熟知，且本文所用术语如油核心、表面活性剂、磷脂等为本领域技术人员充分熟知而不需进一步描述。此外，虽然提供了单独乳液组分的优选含量范围，具体乳液组分的实际比例可能需要调节，从而具有所需大小和物理性质的乳液颗粒可适当地形成。例如，若使用具体含量的油(如5％v/v油)，则表面活性剂的含量应为足以将油滴分散在水相中以形成稳定乳液的水平。将油滴分散在水相中所需的表面活性剂的实际量取决于乳液所用的表面活性剂类型和油核心类型；且油的量还可根据液滴大小而变化(因为这会改变两相之间的表面积)。所需乳液组分的实际含量和相对比例可由技术人员容易地确定。a.油核心阳离子水包油乳液的颗粒包含油核心。优选地，所述油是可代谢的无毒油；更优选约6-约30个碳原子之一，包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃及其相应的酸和醇、其醚和酯、及其混合物。所述油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成制备油，其可被给予所述乳液的对象身体所代谢，且对所述对象无毒。所述对象可为动物，通常是哺乳动物，优选人。在某些实施方式中，所述油核心25℃时为液相。所述油核心25℃时为液相，当保存于25℃时其表现出液体特性(与固体和气体不同；且具有确定体积但没有确定形状)。然而所述乳液可在任何合适温度储存和使用。优选所述油核心4℃时为液相。所述油可为任何长链烷烃、烯烃或炔烃，或其酸或醇的衍生物作为游离酸、其盐或酯如单或双或三酯，例如1,2-丙二醇或类似的多羟基醇的甘油三酯和酯。醇可用单或多官能酸例如乙酸、丙酸、柠檬酸等所酰化。还可使用是油并满足本文所述其它标准的长链醇衍生醚。单独的烷烃、烯烃或炔烃部分及其酸或醇衍生物通常具有约6-约30个碳原子。所述部分可具有直链或支链结构。其可完全饱和或具有一个或多个双键或三键。可使用单或聚酯或醚基油，约6-约30个碳的限制适用于单独脂肪酸或脂肪醇部分，非所有碳计数。特别理想的是所述油可被给予所述乳液的宿主代谢。可使用来自动物、鱼或植物来源的任何合适油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物，和合适的油花生油、大豆油、椰油和橄榄油等。其它合适的种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中还可采用玉米油和其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。获取植物油的技术已良好开发且熟知。这些和其它相似油的组合物可参见例如《默克索引》(themerckindex)，以及食品、营养品和食品技术的源材料。尽管甘油和1,2-丙二醇的约6-约10碳脂肪酸酯不是种籽油中天然产生的，也可以从坚果和种籽油开始，通过对合适材料进行水解、分离和酯化而制备。这些产品以名称neobees市售可得，来自新泽西州boongon迪威臣街416号的pvo国际公司(pvointernational,inc.)化学专业部门，及其它。动物油和脂肪通常由于以甘油三酯存在而在生理温度下为固相且比来自鱼或植物的油有更高的饱和度。然而，脂肪酸可从动物脂肪中通过部分或完全甘油三酯皂化而获得，提供游离脂肪酸。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。分支未饱和萜类鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)为本文特别优选。鲨烯的主要来源是鲨鱼肝油，尽管包括苋菜种籽、米糠、小麦胚芽和橄榄油在内的植物油(主要是植物油)也是合适的来源。还优选角鲨烯的饱和类似物角鲨烷。包括鲨烯和鲨烷在内的鱼油易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。在某些实施方式中，所述油核心包含选自下组的油：蓖麻油、椰子油、玉米油、棉籽油、月见草油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻子油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油、鲨烯、葵花子油、小麦胚芽油和矿物油。在示例性实施方式中，所述油核心包含大豆油、葵花籽油、橄榄油、鲨烯或其组合。鲨烯也可用作油。在示例性实施方式中，所述油核心包括鲨烯、鲨烷或其组合。所述乳液的油组分可以约0.2％-约20％(v/v)的含量存在。例如，阳离子水包油乳液可包含约0.2％-约20％(v/v)油、约0.2％-约15％(v/v)油、约0.2％-约10％(v/v)油、约0.2％-约9％(v/v)油、约0.2％-约8％(v/v)油、约0.2％-约7％(v/v)油、约0.2％-约6％(v/v)油、约0.2％-约5％(v/v)油、约0.2％-约4.3％(v/v)油、约0.3％-约20％(v/v)油、约0.4％-约20％(v/v)油、约0.5％-约20％(v/v)油、约1％-约20％(v/v)油、约2％-约20％(v/v)油、约3％-约20％(v/v)油、约4％-约20％(v/v)油、约4.3％-约20％(v/v)油、约5％-约20％(v/v)油、约0.5％(v/v)油、约1％(v/v)油、约1.5％(v/v)油、约2％(v/v)油、约2.5％(v/v)油、约3％(v/v)油、约3.5％(v/v)油、约4％(v/v)油、约4.3％(v/v)油、约5％(v/v)油、或约10％(v/v)油。或者，阳离子水包油乳液可包含约0.2％-约10％(w/v)油、约0.2％-约9％(w/v)油、约0.2％-约8％(w/v)油、约0.2％-约7％(w/v)油、约0.2％-约6％(w/v)油、约0.2％-约5％(w/v)油、约0.2％-约4.3％(w/v)油、或约4.3％(w/v)油。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.5％(v/v)油。在另一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约4.3％(v/v)油。在另一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约5％(v/v)油。在另一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约4.3％(w/v)鲨烯。如上所述，上述油的百分比根据用于制备乳液的油的起始含量确定。本领域应理解终产物(如待给予的包装灭菌乳液)中油的浓度可稍低，有时直到约10％或约20％。b.阳离子脂质本文所述乳液颗粒包含阳离子脂质，其可与所述带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。可以使用任意合适的阳离子脂质。通常，阳离子脂质含生理条件下带正电的氮原子。合适的阳离子脂质包括苯扎氯铵(bak)、氯化苄乙铵、溴棕三甲铵(其含十四烷基三甲基溴化铵和可能少量的十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵)、十六烷基氯化吡啶(cpc)、十六烷基三甲基氯化铵(ctac)、伯胺、仲胺、叔胺，包括但不限于n,n',n'-聚氧乙烯(10)-n-牛油-l,3-二氨基丙烷、其它季胺盐，包括但不限于十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基-氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基十八烷基溴化铵(ddab)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合的三烷基氯化铵、甲基三辛基氯化铵)、n,n-二甲基-n-[2(2-甲基-4-(l,l,3,3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化铵(debda)、二烷基二甲基铵盐、[l-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-n,n,n,三甲基氯化铵、1,2-二酰基-3-(三甲基铵)丙烷(酰基基团＝二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二酰基-3(二甲基铵)丙烷(酰基基团＝二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、(4'-三甲基铵)丁酸胆固醇酯)、n-烷基吡啶盐(如溴化十六烷基吡啶和氯化十六烷基吡)、n-烷基哌啶盐、二价阳离子bola型电解质(c12me6；c12bu6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、l-α二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(dogs)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(dppes)、脂聚-l(或d)-赖氨酸(lpll、lpdl)、聚(l(或d)赖氨酸偶联n-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有氨基侧基的双十二烷基谷氨酸(c12gluphcnn+)、具有氨基侧基的双十四烷基谷氨酸酯(c14glucnn+)、胆固醇阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基二甲基铵、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基而甲基铵盐、和胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基二甲基铵和3γ-[n-(n',n-二甲基氨基乙氨甲酰基]胆固醇)(dc-胆固醇),1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(dotap)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(dstap)及其组合。适用于本发明的其它阳离子脂质包括例如美国专利公开2008/0085870(2008年4月10日公开)和2008/0057080(2008年3月6日公开)所述的阳离子脂质。适用于本发明的其它阳离子脂质包括例如wo2011/076807(还公开制备这些阳离子脂质的方法和其使用方法)的表6(112–139页)所述脂质e0001-e0118或e0119-e0180。其它合适的阳离子脂脂质包括n-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二油酰-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(doepc)、1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、1,2-二亚油氧基-3-二甲基氨丙烷(dlindma)。所述乳液可包含本文所述阳离子脂质中两种或更多的组合。在优选实施方式中，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(dotap)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(dstap)、wo2011/076807的表6(112–139页)所公开脂质e0001-e0118或e0119-e0180和其组合。在另一优选实施方式中，所述阳离子脂质选自下组：1,2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(dotap)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(dc胆固醇)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、二棕榈酰(c16:0)三甲基铵丙烷(dptap)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(dstap)、n-[1-(2、3-二油烯氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二油酰-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(doepc)、1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(dodap)、1,2-二亚油氧基-3-二甲基氨丙烷(dlindma)、wo2011/076807的表6(112–139页)所公开脂质e0001-e0118或e0119-e0180、和其组合。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dotap。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约25mg/ml的dotap。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dotap可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.6mg/ml、约0.7mg/ml-约1.6mg/ml、约0.8mg/ml-约1.6mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约24mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.6mg/mldotap，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dc胆固醇。所述阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml-约5mg/ml的dc胆固醇。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dc胆固醇可为约0.1mg/ml-约5mg/ml、约0.2mg/ml-约5mg/ml、约0.3mg/ml-约5mg/ml、约0.4mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.62mg/ml-约5mg/ml、约1mg/ml-约5mg/ml、约1.5mg/ml-约5mg/ml、约2mg/ml-约5mg/ml、约2.46mg/ml-约5mg/ml、约3mg/ml-约5mg/ml、约3.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约5mg/ml、约4.5mg/ml-约5mg/ml、约0.1mg/ml-约4.92mg/ml、约0.1mg/ml-约4.5mg/ml、约0.1mg/ml-约4mg/ml、约0.1mg/ml-约3.5mg/ml、约0.1mg/ml-约3mg/ml、约0.1mg/ml-约2.46mg/ml、约0.1mg/ml-约2mg/ml、约0.1mg/ml-约1.5mg/ml、约0.1mg/ml-约1mg/ml、约0.1mg/ml-约0.62mg/ml、约0.15mg/ml、约0.3mg/ml、约0.6mg/ml、约0.62mg/ml、约0.9mg/ml、约1.2mg/ml、约2.46mg/ml、约4.92mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.62mg/ml-约4.92mg/mldc胆固醇，如2.46mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dda。所述阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml-约5mg/ml的dda。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dda可为约0.1mg/ml-约5mg/ml、约0.1mg/ml-约4.5mg/ml、约0.1mg/ml-约4mg/ml、约0.1mg/ml-约3.5mg/ml、约0.1mg/ml-约3mg/ml、约0.1mg/ml-约2.5mg/ml、约0.1mg/ml-约2mg/ml、约0.1mg/ml-约1.5mg/ml、约0.1mg/ml-约1.45mg/ml、约0.2mg/ml-约5mg/ml、约0.3mg/ml-约5mg/ml、约0.4mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.6mg/ml-约5mg/ml、约0.73mg/ml-约5mg/ml、约0.8mg/ml-约5mg/ml、约0.9mg/ml-约5mg/ml、约1.0mg/ml-约5mg/ml、约1.2mg/ml-约5mg/ml、约1.45mg/ml-约5mg/ml、约2mg/ml-约5mg/ml、约2.5mg/ml-约5mg/ml、约3mg/ml-约5mg/ml、约3.5mg/ml-约5mg/ml、约4mg/ml-约5mg/ml、约4.5mg/ml-约5mg/ml、约1.2mg/ml、约1.45mg/ml等。或者，所述阳离子水包油乳液可包含约20mg/ml、约21mg/ml、约21.5mg/ml、约21.6mg/ml、约25mg/mldda。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml-约1.45mg/mldda，如1.45mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dotma。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约25mg/ml的dotma。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dotma可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.6mg/ml、约0.7mg/ml-约1.6mg/ml、约0.8mg/ml-约1.6mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.35mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约22.5mg/ml、约25mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.6mg/mldotma，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为doepc。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约25mg/ml的doepc。例如，所述阳离子水包油乳液包含的doepc可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、约0.5mg/ml-约3mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.7mg/ml、约0.7mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约22.5mg/ml、约25mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.8mg/mldoepc，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml或1.8mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dstap。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约50mg/ml的dstap。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dstap可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、约0.5mg/ml-约3mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.7mg/ml、约0.7mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约22.5mg/ml、约25mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.6mg/mldstap，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dodac。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约50mg/ml的dodac。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dodac可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、约0.5mg/ml-约3mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.7mg/ml、约0.7mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.15mg/ml、约1.16mg/ml、约1.17mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约22.5mg/ml、约25mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml-约1.45mg/mldodac，如1.45mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为dodap。所述阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml-约50mg/ml的dodap。例如，所述阳离子水包油乳液包含的dodap可为约0.5mg/ml-约25mg/ml、约0.6mg/ml-约25mg/ml、约0.7mg/ml-约25mg/ml、约0.8mg/ml-约25mg/ml、约0.9mg/ml-约25mg/ml、约1.0mg/ml-约25mg/ml、约1.1mg/ml-约25mg/ml、约1.2mg/ml-约25mg/ml、约1.3mg/ml-约25mg/ml、约1.4mg/ml-约25mg/ml、约1.5mg/ml-约25mg/ml、约1.6mg/ml-约25mg/ml、约1.7mg/ml-约25mg/ml、约0.5mg/ml-约24mg/ml、约0.5mg/ml-约22mg/ml、约0.5mg/ml-约20mg/ml、约0.5mg/ml-约18mg/ml、约0.5mg/ml-约15mg/ml、约0.5mg/ml-约12mg/ml、约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.5mg/ml-约5mg/ml、约0.5mg/ml-约4mg/ml、约0.5mg/ml-约3mg/ml、约0.5mg/ml-约2mg/ml、约0.5mg/ml-约1.9mg/ml、约0.5mg/ml-约1.8mg/ml、约0.5mg/ml-约1.7mg/ml、约0.5mg/ml-约1.6mg/ml、约0.6mg/ml-约1.7mg/ml、约0.7mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约1.7mg/ml、约0.8mg/ml-约3.0mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约12mg/ml、约18mg/ml、约20mg/ml、约21.8mg/ml、约22.5mg/ml、约25mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml-约1.6mg/mldodap，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。在一些情况中，可能需要使用溶于油核心的阳离子脂质。例如，dotapdoepc,dodac,和dotma溶于鲨烯或鲨烷。在其它情况中，可能需要使用不溶于油核心的阳离子脂质。例如dda和dstap不溶于鲨烯。确定具体脂质溶于或不溶于油以及由此选择合适的油和脂质组合在本领域认识范围内。例如，溶解度可根据所述脂质和油的结构来预测(如脂质的溶解度可通过其尾部的结构来确定)。例如，具有一个或两个不饱和脂肪链(如油酰尾)的脂质如dotap,doepc,dodac,dotma，可溶于鲨烯或鲨烷；而具有饱和脂肪酸链(如硬脂酰尾)的脂质不溶于鲨烯。或者，可根据溶于给定量油以形成饱和溶液的脂质的量来确定溶解度。如上所述，上述脂质的浓度根据用于制备乳液的初始脂质含量确定。本领域应理解终产物(如待给予的包装灭菌乳液)中油的浓度可稍低，有时直到约20％。c.其它组分本文所述阳离子水包油乳液还可包含其它组分。例如，所述乳液可包含能促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、增加带负电分子稳定性(如阻止rna分子降解)的组分。表面活性剂在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液的颗粒还包含表面活性剂。大量表面活性剂已用于药物科学。这些包括天然衍生的材料如树胶、植物蛋白、基于糖的聚合物如海藻酸盐和纤维素等。在碳主链上具有氢氧根或其它亲水取代基的某些氧聚合物或聚合物具有表面活性剂活性，例如聚维酮、聚乙烯醇和基于醇醚的单和多官能化合物。长链脂肪酸衍生的化合物形成本发明可用的乳化和悬浮剂的第三取代基团。合适表面活性剂的特定例子包括下列：1.水溶性皂如高级脂肪酸(c10-c22)的钠、钾、铵和烷醇铵的盐，尤其是钠和钾牛脂和椰子皂2.可由有机硫磺酸反应产物的水溶性盐代表的阴离子合成非皂表面活性剂，其分子结构中具有含约8-22碳原子的烷基基团和选自磺酸和硫酸酯基团的基团。这些的示例是源自牛脂或椰子油的烷基硫酸钠或钾；烷基苯磺酸钠或钾；烷基甘油醚磺酸钠；椰子油脂肪酸甘油单酯磺酸或硫酸钠；1摩尔高级脂肪醇和约1-6摩尔环氧乙烷的反应产物的硫酸酯的钠或钾盐；烷基苯酚环氧乙烷醚磺酸钠或钾，每分子具有1-10单元的环氧乙烷且其中所述烷基基团含8-12个碳原子；脂肪酸与羟乙基磺酸的酯化以及与氢氧化钠的中和的反应产物；甲基牛磺酸的脂肪酸酰胺的钠或钾盐；和so3-磺化c10-c24α-烯烃的钠和钾盐。3.环氧烷基团与有机疏水化合物缩合产生的非离子合成表面活性剂。通常疏水基团包括环氧丙烷与丙二醇、烷基酚的缩合产物，环氧丙烷和乙二胺的缩合产物，具有8-22碳原子的脂族醇和脂肪酸的酰胺。4.具有半极性特征的非离子表面活性剂，如氧化胺、氧化膦和亚砜。长链氧化叔胺的具体示例包括二甲基十二烷基氧化胺和二(2-羟乙基)-十二烷基胺。氧化膦的具体示例参见1967年2月14日授权的美国专利号3,304,263，且包括二甲基十二烷基氧化膦和二甲基-(2羟基十二烷基)氧化膦。5.长链亚砜，包括对应化学式r1—so—r2的那些，其中r1和r2由烷基基团取代或未取代，前者含约10-约28碳原子，而r2含1-3碳原子。这些亚砜的具体示例包括十二烷基甲基亚砜和3-羟基十三烷基甲基亚砜。6.两性合成表面活性剂如3-十二烷基氨基丙酸钠和3-十二烷基氨基丙烷磺酸钠。7.两性合成表面活性剂，如3-(n,n-二甲基-n-十六烷基胺基)丙烷-1-磺酸盐和3-(n,n-二甲基-n-十六烷基胺基)-2-羟丙烷-1-磺酸盐。此外，所有下述类型的表面活性剂可用于本发明组合物：(a)脂肪酸、松香酸和妥尔油的皂(即碱性盐)；(b)烷基芳烃磺酸盐；(c)烷基硫酸盐，包括具有支链和直链疏水基团以及一级硫酸基团和二级硫酸基团的表面活性剂；(d)疏水与亲水基团之间含中间连接的硫酸盐/酯和磺酸盐/酯，如脂肪酰基化的甲基牛磺酸和硫酸化的脂肪甘油单酯；(e)聚乙二醇的长链酸酯，尤其是妥儿油酯；(f)烷基酚的聚乙二醇醚；(g)长链醇和硫醇的聚乙二醇醚；和(h)脂肪酰基二乙醇氨。由于表面活性剂可用多于一种方法分类，本段所列的许多表面活性剂类别与前述的表面活性剂类别重叠。有许多特别设计且常用于生物条件的表面活性剂。此类表面活性剂分为四种基本类型：阴离子、阳离子、两性离子(两性)和非离子。示例性阴离子表面活性剂包括例如，全氟辛酸盐(pfoa或pfo)、全氟辛烷磺酸盐(pfos)，烷基硫酸盐如十二烷基硫酸钠(sds)或月桂基硫酸铵，月桂醇聚醚硫酸钠(也称月桂基醚硫酸钠，sles)，烷基苯磺酸盐和脂肪酸盐。示例性阳离子表面活性剂包括例如，烷基三甲基铵盐如鲸蜡基三甲基溴化铵(ctab，或十六烷基溴化三甲基铵)，氯化鲸蜡基吡啶(cpc)，聚乙氧基化牛油胺(poea)，苯扎氯铵(bac)和苄索氯铵(bzt)。示例性两性离子(两性)表面活性剂包括例如，十二烷基甜菜碱，椰油酰胺丙基甜菜碱和椰油两性甘氨酸盐。示例性非离子型表面活性剂包括例如，烷基聚(氧化乙烯)、烷基苯酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯)的共聚物[商品名为泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine)]、烷基聚葡萄糖苷(如辛基葡萄糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺mea、椰油酰胺dea，f68(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)和聚山梨醇酯，如吐温(tween)-20(聚山梨醇酯20)、吐温-80(聚山梨醇酯80)、十二烷基二甲基氧化胺和琥珀酸维生素e生育酚丙二醇(维生素etpgs)。一组特别有用的表面活性剂是基于去水山梨糖醇的非离子表面活性剂。这些表面活性剂通过山梨糖醇脱水产生1,4-去水山梨糖醇，然后将其与一种或多种脂肪酸等价物反应来制备。脂肪酸取代的部分还可与环氧乙烷反应产生第二组表面活性剂。制备脂肪酸取代的去水山梨糖醇表面活性剂是通过1,4-去水山梨糖醇和脂肪酸如月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸或相似长链脂肪酸反应，产生1,4-去水山梨糖醇单酯、1,4-去水山梨糖醇倍半酯或1,4-去水山梨糖醇三酯。这些表面活性剂的常用名包括例如去水山梨糖醇单月桂酸酯、去水山梨糖醇单棕榈酯、去水山梨糖醇单硬脂酸酯、去水山梨糖醇单油酸酯、去水山梨糖醇倍半油脂和去水山梨糖醇三油酸酯。这些表面活性剂市售可得，名为或arlacel，通常有区别各种单、双和三酯取代去水山梨糖醇的字母或数字标号。和表面活性剂是亲水的，通常可溶于水或在油中可分散。其还可溶于大多数有机溶剂。在水中其通常不可溶但可分散。通常这些表面活性剂的亲水-亲脂平衡(hlb)数为1.8-8.6。该表面活性剂可通过本领域已知或市售可得的手段容易制备。一组相关表面活性剂包含聚氧乙烯(olyoxyethylene)去水山梨糖醇单酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇三酯。这些材料通过添加环氧乙烷到1,4-去水山梨糖醇单酯或三酯中来制备。添加聚氧乙烯将亲酯去水山梨糖醇单或三酯表面活性剂转变为亲水表面活性剂，后者通常可溶于水或在水中可分散并可在有机液体中以不同程度溶解。这些材料市售可得，商标为用于制备水包油乳液和分散体，或用于溶解油并使无水药膏变为水溶性或可清洗。表面活性剂可与相关去水山梨糖醇单酯或三酯表面活性剂组合以促进乳液稳定性。表面活性剂的hlb值通常落在9.6-16.7。表面活性剂可市售购得。可单独使用或与spans、和tweens表面活性剂联用的第三组非离子表面活性剂是通过环氧乙烷与长链脂肪酸反应制得的聚氧乙烯脂肪酸。该类型最常见的表面活性剂是名为myrjs的固体和硬脂酸的聚氧乙烯衍生物。表面活性剂是亲水的且可溶于水或在水中分散，类似表面活性剂。表面活性剂可与表面活性剂或与或表面活性剂混合物相混合以用于形成乳液。表面活性剂可通过本领域已知或市售可得的方法制备。第四组基于聚氧乙烯的非离子表面活性剂是衍生自月桂酰、乙酰、硬脂酰、和油酰醇的聚氧乙烯脂肪酸醚。这些材料如上通过添加环氧乙烷到脂肪醇中来制备。这些表面活性剂的商品名为表面活性剂可为亲水或亲酯，取决于所述表面活性剂中聚氧乙烯部分的大小。虽然这些化合物的制备在本领域可得，其还可容易地获自商业来源。可潜在使用的其它非离子表面活性剂是例如，聚氧乙烯、多元醇脂肪酸酯、聚氧乙烯醚、聚氧丙烯脂肪醚、含聚氧乙烯的蜂蜡衍生物、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯和脂肪甘油酯、丙三醇脂肪酸酯或12-22碳原子长链脂肪酸的其他聚氧乙烯酸醇或醚衍生物。由于本发明乳液和制剂意在为多相系统，优选选择形成乳液的非离子表面活性剂，其hlb值为约7-16。该值可通过使用单一非离子表面活性剂如表面活性剂来获得，或可通过使用表面活性剂混合物例如与基于去水山梨糖醇单、双或三酯的表面活性剂的混合物来实现；去水山梨糖醇酯聚氧乙烯脂肪酸；与聚氧乙烯羊毛脂衍生的表面活性剂组合的去水山梨糖醇酯；与高hlb聚氧乙烯脂肪醚表面活性剂组合的去水山梨糖醇酯表面活性剂；或聚乙烯脂肪醚表面活性剂或聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸。在某些实施方式中，乳液含单一非离子表面活性剂，尤其是表面活性剂，因为所述乳液使非离子表面活性剂稳定。在示例性实施方式中，乳液含80，或称为聚山梨酯80或聚氧乙烯20去水山梨糖醇单酯。在其它实施方式中，乳液含两种或多种非离子表面活性剂，尤其是表面活性剂和表面活性剂。在示例性实施方式中，乳液含80和85。水包油乳液可包含约0.01％-约2.5％表面活性剂(v/v或w/v)，约0.01％-约2％表面活性剂，0.01％-约1.5％表面活性剂，0.01％-约1％表面活性剂，0.01％-约0.5％表面活性剂，0.08％-约0.5％表面活性剂，约0.08％表面活性剂，约0.1％表面活性剂，约0.2％表面活性剂，约0.3％表面活性剂，约0.4％表面活性剂，约0.5％表面活性剂，约0.6％表面活性剂，约0.7％表面活性剂，约0.8％表面活性剂，约0.9％表面活性剂，或约1％表面活性剂。或者或此外，所述水包油乳液可包含0.05％-约1％、0.05％-约0.9％、0.05％-约0.8％、0.05％-约0.7％、0.05％-约0.6％、0.05％-约0.5％、约0.08％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、或约1％吐温80(聚山梨酯80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油脂)。在一个示例性实施方式中，所述水包油乳液含0.08％吐温80。或者或此外，所述水包油乳液可包含0.05％-约1％、0.05％-约0.9％、0.05％-约0.8％、0.05％-约0.7％、0.05％-约0.6％、0.05％-约0.5％、约0.08％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、或约1％span85(去水山梨糖醇三油脂)。或者或此外，所述水包油乳液可包含上述表面活性剂的组合。例如，可使用吐温80(聚山梨酯80，聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和span85(失水山梨糖醇三油酸酯)的组合。所述乳液可含各种量的吐温80和span85(如上面所示例的那些)，包括等量的这些表面活性剂。例如，所述水包油乳液可含约0.05％吐温80和约0.05％span85、约0.1％吐温80和约0.1％span85、约0.2％吐温80和约0.2％span85、约0.3％吐温80和约0.3％span85、约0.4％吐温80和约0.4％span85、约0.5％吐温80和约0.5％span85、约0.6％吐温80和约0.6％span85、约0.7％吐温80和约0.7％span85、约0.8％吐温80和约0.8％span85、约0.9％吐温80和约0.9％span85或约1％吐温80和约1.0％span85。聚乙二醇(peg)-脂质，如偶联二烷氧基丙基的peg(peg-daa)、偶联二酰甘油的peg(peg-dag)、偶联磷脂酰乙醇胺(pe)(peg-pe)或一些其它磷脂(peg-磷脂)的peg、偶联神经酰胺的peg(peg-cer)、或其组合还可用作表面活性剂(参见例如美国专利号5,885,613；美国专利申请公开号2003/0077829,2005/0175682和2006/0025366)。其它合适的peg-脂质包括例如peg-二烷氧基丙基(daa)脂质或peg-二酰甘油(dag)脂质。示例性peg-dag脂质包括例如peg-二月桂酰甘油(c12)脂质、peg-二肉豆蔻酰甘油(c14)脂质、peg-二棕榈酰甘油(c16)脂质、或peg-二硬脂酰甘油(c18)脂质。示例性peg-daa脂质包括例如peg-二月桂酰丙基(c12)脂质、peg-二肉豆蔻酰丙基(c14)脂质、peg-二棕榈酰丙基(c16)脂质、或peg-二硬脂酰丙基(c18)脂质。peg根据其分子量分类；例如，peg2000平均分子量为约2,000道尔顿，peg5000平均分子量为约5,000道尔顿。peg可从西格玛化学公司(sigmachemicalco.)以及其它公司市售获得，包括例如下列：单甲氧基聚乙烯醇(mepeg-oh)、单甲氧基聚乙烯醇-琥珀酸酯(mepeg-s)、单甲氧基聚乙烯醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mepeg-s-nhs)、单甲氧基聚乙烯醇-氨基(mepeg-nh2)、单甲氧基聚乙烯醇-三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate)(mepeg-tres)、和单甲氧基聚乙烯醇-咪唑基-羰基(mepeg-im)。此外，单甲氧基聚乙烯醇-乙酸(mepeg-ch2cooh)特别用于制备peg-脂质偶联物，包括例如peg-daa偶联物。优选地，pef平均分子量为约1000–约5000道尔顿(如peg1000、peg2000、peg3000、peg4000、peg5000)。peg能任选被烷基、烷氧基、酰基或芳基基团取代。peg可直接偶联脂质或可通过接头部分连接脂质。可使用适用于偶联peg与脂质的任何接头部分，例如含非酯的接头部分和含酯的接头部分。在示例性实施方式中，peg2000pe、peg5000pe、peg1000dmg、peg2000dmg、peg3000dmg、或其组合用作表面活性剂。在某些示例性实施方式中，所述水包油乳液包含约1mg/ml-约80mg/mlpeg2000pe、peg5000pe、peg1000dmg、peg2000dmg、或peg3000dmg。磷脂在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液的颗粒还包含磷脂。磷脂是脂肪酸的酯，其中分子的醇组分包含磷酸基团。磷脂包括甘油磷脂(含甘油)和鞘磷脂(含鞘氨醇)。示例性磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂；和合成磷脂，包含二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和二棕榈酰丝氨酸。可使用下列示例性磷脂。在某些实施方式中，使用中性脂质具有优势。使用磷脂也具有优势，包括两性离子磷脂，例如含一种或多种长度为约12-约22碳(如约12-约14、约12-约16、约12-约18、约12-约20、约12-约22碳)的烷基或烯基基团的磷脂，这些基团可包含例如0-1-2-3个双键。使用两性磷脂可具有优势。优选的磷脂包括例如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dope)、蛋磷脂酰胆碱(蛋pc)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、dppc、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱(plpc)、dpype、或其组合。在某些实施方式中，磷脂是dope。所述阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml-约20mg/ml的dope。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.5mg/ml-约10mg/ml、约0.1mg/ml-约10mg/ml、或约1.5mg/ml-约7.5mg/mldope。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约1.5mg/mldope。在某些实施方式中，磷脂是蛋pc。所述阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml-约20mg/ml的蛋pc。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml-约10mg/ml、约1.0mg/ml-约10mg/ml、或约1.5mg/ml-约3.5mg/ml的蛋pc。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约1.55mg/ml蛋pc。在某些实施方式中，磷脂是dpype。所述阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml-约20mg/ml的dpype。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml-约10mg/ml、约1.5mg/ml-约10mg/ml、或约1.5mg/ml-约5mg/mldpype。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约1.6mg/mldpype。在某些实施方式中，乳液颗粒可包含本文所述表面活性剂和磷脂的组合。d.水相(连续相)水包油乳液的水相(连续相)是缓冲盐溶液(如盐水)或水。缓冲的盐溶液是包含盐(如nacl)的水溶液、缓冲液(如柠檬酸盐缓冲液)，且还能包含渗透压调节剂(如糖)、聚合物、表面活性剂或其组合。若配置乳液用于胃肠道外给药，优选补充最终缓冲液从而张力即渗透压与正常生理液体基本相同，以防止不需要的给药后结果，如给药后肿胀或组合物快速吸收。还优选缓冲所述水相以维持与正常生理条件相当的ph。而且，在某些情况中，可能需要将ph维持在特定水平从而确保某些乳液组分的稳定性。例如，可能需要制备等张(即与身体和血液的正常细胞相同的可渗透溶质(如盐)浓度)和等渗压的乳液。为了控制张力，乳液可包含生理盐如钠盐。例如可使用约0.9％(w/v)的氯化钠(nacl)(生理盐水)。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。非离子等张剂还可用于控制张力。本领域通常已知许多非离子张力调节剂。这些通常为各种类型的碳水化合物(参见例如voet和voet(1990)biochemistry(《生物化学》)(纽约johnwiley&sons公司))。分类为醛醣的单糖如葡萄糖、甘露糖阿拉伯糖和核糖以及分类为酮醣的单糖如果糖、山梨糖和木酮糖可在本发明中用作非离子等张剂。也可使用二糖如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖。此外，醛糖醇(无环多羟基醇，还称为糖醇)如丙三醇、甘露醇和山梨糖醇是本文所用的非离子等张剂。非离子等张调节剂可根据所用试剂以约0.1％-约10％或约1％-约10％的浓度存在。水相可经缓冲。本文可用任何生理上可接受的缓冲液，如水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液等。水性组分的ph优选为6.0-8.0，优选约6.2-约6.8。在示例性实施方式中，所述缓冲液为ph6.5的10mm柠檬酸盐缓冲液。在另一示例性实施方式中，所述水相为无rna酶的水或depc处理水或由其制备的所述缓冲液。在一些情况中，缓冲液中的高盐可干扰并因此避免带负电分子与所述乳液颗粒的复合。在其它情况中，缓冲液中可包括一定量的盐。在示例性实施方式中，所述缓冲液为ph6.5的10mm柠檬酸盐缓冲液。在另一示例性实施方式中，所述水相为无rna酶的水或depc处理水或所述缓冲液由其制备。所述水相还可包含其它组分如改变水相渗透压的分子或稳定复合后带负电分子的分子。优选地，所述水相的渗透压用非离子等张剂调剂，所述等张剂如糖(如棉子糖、蔗糖、右旋糖、果糖、还原帕拉金糖等)、糖醇(如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、丙三醇等)或其组合。若需要，可使用非离子聚合物(如聚(烷基醇)例如聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丁烯醇)或非离子表面活性剂。在一些情况中，若乳液从头制备，无杂质(unadulterated)的水可优选用作乳液的水相。例如，增加盐浓度可能使得更难以达到所需粒度(如小于约200nm)。在某些实施方式中，所述阳离子水包油乳液的水相还包括聚合物或表面活性剂或其组合。在一个示例性实施方式中，所述水包油乳液含泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。泊洛沙姆又称为商品名聚合物。泊洛沙姆聚合物可增加稳定性并增强rna复合后rna分子对rna酶的抗性。或者或此外，所述阳离子水包油乳液可包括约0.1％-约20％(w/v)聚合物、或约0.05％-约10％(w/v)聚合物。例如，所述阳离子水包油乳液可包含约0.1％-约20％(w/v)、约0.1％-约10％(w/v)、约0.05％-约10％(w/v)、或约0.05％-约5％(w/v)聚合物(如泊洛沙姆例如f127)。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约4％(w/v)、或约8％(w/v)f127。这些组合物中使用的水性组分的量为使组合物的值统一所需的量。即水性组分的量足以与上述其它组分100％混合，从而得到组合物体积。4.带负电分子递送带负电分子时，其可与阳离子水包油乳液颗粒复合。带负电分子与乳液颗粒通过下述方式复合：例如带负电分子和颗粒表面上阳离子脂质之间的相互作用，以及带负电分子和颗粒表面的疏水/亲水相互作用。尽管不希望被任何具体理论限制，带负电分子通过非共价、离子电荷相互作用(静电力)与所述阳离子脂质相互作用，而且复合物的强度以及可与颗粒复合的带负电化合物含量与颗粒中阳离子脂质的含量有关。此外，带负电分子和颗粒表面的疏水/亲水相互作用也可发挥作用。带负电分子的示例包括带负电肽、多肽或蛋白、核酸分子(如单或双链rna或dna)、小分子(如小分子免疫增强剂(smip)、膦酸盐、氟代膦酸盐等)等。在优选的方面，带负电分子是rna分子，如编码肽、多肽或蛋白的rna，包括自复制rna分子或小干扰rna。可使用本领域已知的技术形成复合物，其示例在本文中描述。例如，核酸-颗粒复合物可通过例如涡旋混合阳离子乳液与核酸分子来形成。乳液中带负电分子和阳离子脂质的含量可调节或最优化以提供所需结合强度的结合能力。例如，如本文所述和示例，示例性rna-颗粒复合物通过改变rna：阳离子脂质的比例(如“n/p比”所测量)来生产。术语n/p比指可质子化氮原子在阳离子脂质中的含量(摩尔)除以rna上磷酸盐的含量(摩尔)。优选的n/p比为约1:1-约20:1、约2:1-约18:1、约3:1to16:1、约4:1-约14:1、约6:1-约12:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1或约16:1。或者，优选的n/p比为至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约11:1、至少约12:1、至少约13:1、至少约14:1、至少约15:1或至少约16:1。更优选的n/p比为约4:1或更高。各乳液可具有其自身最优或优选的n/p比来产生所需效果(如复合rna的需要表达水平)，这可通过实验确定(例如使用本文所述试验或本领域已知的其他技术，如通过检测rna编码蛋白的表达水平或检测肝素存在时从复合物中释放的rna分子百分比)。通常，n/p比的值应使rna-颗粒复合物被细胞摄取时，至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的rna分子从rna-颗粒复合物中释放。n/p比优选至少4:1。本文所述阳离子水包油乳液尤其适于配置基于核酸的疫苗(如dna疫苗，rna疫苗)。核酸-乳液颗粒复合物的形成有利于宿主细胞摄入核酸，并保护所述核酸分子免受核酸酶降解。然后转染的细胞可表达所述核酸分子编码的抗原，其可产生对所述抗原的免疫应答。与活或减毒病毒类似，基于核酸的疫苗可有效参与mhc-i和mhc-ii通路，能诱导cd8+和cd4+t细胞响应，而以可溶形式存在的抗原如重组蛋白通常仅诱导抗体响应。rna分子的序列可进行密码子优化或去优化以在需要的宿主如人细胞中表达。在某些实施方式中，本文所述的带负电分子为rna分子。在某些实施方式中，rna分子编码抗原(肽、多肽或蛋白)且阳离子水包油乳液适于用作基于rna的疫苗。组合物可包含多于一种编码抗原的rna分子，如2、3、4、5或10种与乳液颗粒复合的rna分子。即所述组合物可含一种或多种不同种类的rna分子，所述rna分子各编码不同抗原。或者或此外，一种rna分子还可编码多于一种抗原，如编码不同或相同抗原的双顺反子或三顺反子rna分子。因此，所述阳离子水包油乳液适用作基于rna的单价或多价疫苗。rna分子的序列可按需修饰，例如用于增加rna表达或复制的效力或提供对于降解的额外稳定性或抗性。例如，rna序列可根据其密码子用途来修饰，例如用于增加rna的翻译效力和半衰期。聚a尾(如具有约30个或更多腺嘌呤残基)可连接rna的3'末端以增加其半衰期。rna的5'末端可用修饰的核糖核苷酸加帽，结构为m7g(5')ppp(5')n(帽0结构)或其衍生物，其可在rna合成中纳入或可在rna转录后用酶促方法工程改造(如通过使用由mrna三磷酸酶、脒基-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的痘苗病毒加帽酶(vce)，其催化n7-单甲基化帽0结构的构建)。帽0结构在维持rna分子的稳定性和翻译效力中有重要作用。rna分子的5'帽还可由2'-o-甲基转移酶修饰，生成帽1结构(m7gppp[m2'-o]n)，其还可增加翻译效力。若需要，rna分子可包括一种或多种修饰的核苷酸。这可与任何5’帽结构附加。哺乳动物rna上发现有多于96种天然产生的核苷酸修饰。参见例如，limbach等，nucleicacidsresearch,22(12):2183-2196(1994)。核苷酸和经修饰核苷酸及核苷的制备为本领域熟知，例如美国专利号4373071,4458066,4500707,4668777,4973679,5047524,5132418,5153319,5262530,5700642，其都通过引用全文纳入本文，并且许多修饰的核苷和修饰的核苷酸市售可得。纳入经修饰核苷和核苷酸中且存在于rna分子中的经修饰核碱基包括：m5c(5-甲基胞苷)、m5u(5-甲基尿苷)、m6a(n6-甲基腺苷)、s2u(2-硫尿核苷)、um(2'-o-甲基尿苷)、m1a(l-甲基腺苷)；m2a(2-甲基腺苷)；am(2-1-o-甲基腺苷)；ms2m6a(2-甲基硫-n6-甲基腺苷)；i6a(n6-异戊烯基腺苷)；ms2i6a(2-甲基硫-n6异戊烯基腺苷)；io6a(n6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6a(2-甲基硫-n6-(cis-羟基异戊烯基)腺苷)；g6a(n6-甘氨酰氨甲酰基腺苷)；t6a(n6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；ms2t6a(2-甲基硫-n6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；m6t6a(n6-甲基-n6-苏氨酰氨甲酰基腺苷)；hn6a(n6-羟基正缬氨酰(norvalyl)氨甲酰基腺苷)；ms2hn6a(2-甲基硫-n6-羟基正缬氨酰氨甲酰基腺苷)；ar(p)(2'-o-核糖基腺苷(磷酸盐))；i(肌苷)；m1i(1-甲基肌苷)；m'im(1,2'-o-二甲基肌苷)；m3c(3-甲基胞苷)；cm(2t-o-甲基胞苷)；s2c(2-硫胞苷)；ac4c(n4-乙酰胞苷)；f5c(5-甲酰基(fonnyl)胞苷)；m5cm(5,2-o-二甲基胞苷)；ac4cm(n4乙酰2to甲基胞苷)；k2c(甲基异吡唑)；m1g(1-甲基鸟苷)；m2g(n2-甲基鸟苷)；m7g(7-甲基鸟苷)；gm(2'-o-甲基鸟苷)；m22g(n2,n2-di甲基鸟苷)；m2gm(n2,2'-o-di甲基鸟苷)；m22gm(n2,n2,2'-o-三甲基鸟苷)；gr(p)(2'-o-核糖基鸟苷(磷酸盐))；yw(怀丁苷(wybutoxosine))；o2yw(过氧化怀丁苷)；ohyw(羟基怀丁苷)；ohyw*(未修饰的羟基怀丁苷)；img(丫苷)；mimg(甲基鸟苷)；q(辫苷)；oq(环氧辫苷)；galq(半乳糖基-辫苷)；manq(甘露糖-辫苷)；preqo(7-氰基-7-脱氮(deaza)鸟苷)；preqi(7-氨甲基-7-脱氮鸟苷)；g*(古嘌苷)；d(二氢尿苷)；m5um(5,2'-o-di甲基尿苷)；s4u(4-硫尿苷)；m5s2u(5-甲基-2-硫尿苷)；s2um(2-硫-2'-o-甲基尿苷)；acp3u(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5u(5-羟基尿苷)；mo5u(5-甲氧基尿苷)；cmo5u(尿苷5-氧乙酸)；mcmo5u(尿苷5-氧乙酸甲酯)；chm5u(5-(羧基羟基甲基)尿苷))；mchm5u(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5u(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5um(s-甲氧基羰基甲基-2-o-甲基尿苷)；mcm5s2u(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2u(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5u(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2u(5-甲基氨甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2u(5-甲基氨甲基-2-seleno尿苷)；ncm5u(5-氨甲酰基甲基尿苷)；ncm5um(5-氨甲酰基甲基-2'-o-甲基尿苷)；cmnm5u(5-羧基甲基氨甲基尿苷)；cnmm5um(5-羧甲基氨甲基-2-l-o甲基尿苷)；cmnm5s2u(5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿苷)；m62a(n6,n6-二甲基腺苷)；tm(2'-o-甲基肌苷)；m4c(n4-甲基胞苷)；m4cm(n4,2-o-二甲基胞苷)；hm5c(5-羟基甲基胞苷)；m3u(3-甲基尿苷)；cm5u(5-羧基甲基尿苷)；m6am(n6,t-o-二甲基腺苷)；rn62am(n6,n6,o-2-三甲基腺苷)；m2'7g(n2,7-二甲基鸟苷)；m2'2'7g(n2,n2,7-三甲基鸟苷)；m3um(3,2t-o-二甲基尿苷)；m5d(5-甲基二氢尿苷)；f5cm(5-甲酰基-2'-o-甲基胞苷)；m1gm(1,2'-o-二甲基鸟苷)；m'am(1,2-o-二甲基腺苷)伊立(irino)甲基尿苷)；tm5s2u(s-牛磺(taurino)甲基-2-硫尿苷))；img-14(4-de甲基鸟苷)；img2(异鸟苷)；ac6a(n6-乙酰腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(c1-c6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(c2-c6)-烯基尿嘧啶、5-(c2-c6)-炔基尿嘧啶、5-(羟基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(c1-c6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(c2-c6)-烯基胞嘧啶、5-(c2-c6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、n2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(c2-c6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮嘌呤、7-氮杂-7-取代的嘌呤、7-氮杂-8-取代的嘌呤、氢(脱碱基残基)、m5c、m5u、m6a、s2u、w、或2'-o-甲基-u。许多这些经修饰核碱基和其对应的核糖核苷酸市售可得。参见例如wo2011/005799，其通过引用全文纳入本文。本发明所用的rna理想上仅包括核苷之间的磷酸二酯连接，但在一些实施方式中其可含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯连接。在一些实施方式中，rna分子不包括修饰的核苷酸，如不包括修饰的核碱基，且rna分子中所有核苷酸均为常规标准核糖核苷酸a、u、g和c，除了可包括的任选5'帽，例如7-甲基鸟苷。在其他实施方式中，所述rna可包括含7-甲基鸟苷的5'帽，且第1、2或3个5'核糖核苷酸可在核糖的2'位置被甲基化。a.自复制rna在一些方面，阳离子水包油乳液含自复制rna分子。在某些实施方式中，所述自复制rna分子源自或基于α病毒。自复制rna分子为本领域熟知且可通过使用源自例如α病毒的复制元件并用编码感兴趣蛋白的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来生产。自复制rna分子通常是(+)链分子，其递送到细胞后能直接翻译，且该翻译提供rna依赖性rna聚合酶，所述酶然后从该递送rna中生成反义和正义转录本。因此所递送rna引起多种子rna生成。这些子rna以及共线亚基因组转录本自身翻译以提供编码抗原的原位表达，或可转录以进一步提供与该递送rna同义的转录本，其经翻译提供抗原的原位表达。此转录序列的总体结果是引入的复制子rna数量大幅扩增，因此编码的抗原变为细胞的主要多肽产物。用自复制rna转染的细胞在经历细胞凋亡死亡之前简短生成抗原。此类死亡可能是需要的双链(ds)rna中间物的结果，这在超活化的树突细胞中也观察到。因此，自复制rna的免疫原性增强可能是促炎dsrna生成的结果，所述促炎dsrna模仿rna病毒感染宿主细胞。有利地，细胞器被自复制rna分子用于产生指数式增长的编码基因产物，如蛋白或抗原，其可在细胞中聚集或从细胞分泌。通过自复制rna分子过表达蛋白可利用免疫刺激佐剂效应，包括通过rna复制和扩增以及翻译的产物(其诱导转染细胞的凋亡)刺激toll样受体(tlr)3、7和8和非tlr通路(如rig-1,md-5)。所述自复制rna通常含至少一种或多种选自下组的基因：病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非结构性病毒蛋白，还含有5’-和3’-末端顺式激活复制序列和(如果需要)编码所需氨基酸序列(如感兴趣的抗原)的异源序列。引导所述异源序列表达的亚基因组启动子可包括在所述自复制rna中。如果需要，所述异源序列(如感兴趣的抗原)可与所述自复制rna中的其他编码区域进行框内融合和/或可在内部核糖体进入位点(ires)的控制下。在某些实施方式中，所述自复制rna分子未包封在病毒样颗粒中。本发明的自复制rna分子可设计成使所述自复制rna分子不能诱导感染性病毒颗粒生成。这可通过例如省略所述自复制rna中病毒颗粒生成所需的一种或多种编码结构蛋白的病毒基因实现。例如，所述自复制rna分子基于α病毒如辛德毕斯病毒(sin)、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒(vee)时，可省略一种或多种编码病毒结构蛋白如衣壳或包膜糖蛋白的基因。如果需要，本发明的自复制rna分子可设计成诱导减毒或强毒的感染性病毒颗粒生成，或生成能进行一轮后续感染的病毒颗粒。以此方式实现自复制的一种合适系统为使用基于α病毒的复制子。α病毒包括披盖病毒科的一组遗传、结构和血清学上相关的节肢动物媒介病毒。α病毒属内已鉴定26种已知的病毒和病毒亚型，包括辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、西门利克森林病毒(semlikiforestvirus)、罗斯河病毒(rossrivervirus)和委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus)。因此，本发明的自复制rna可纳入源自西门利克森林病毒(sfv)、辛德毕斯病毒(sin)、委内瑞拉马脑炎病毒(vee)、罗斯河病毒(rrv)、东部马脑炎病毒或其它属于α病毒科病毒的rna复制酶。基于α病毒的“复制子”表达载体可用于本发明。复制子载体可以数种形式利用，包括dna、rna和重组复制子颗粒。这类复制子载体源自包括例如下列的α病毒：辛德毕斯病毒(xiong等(1989)science243:1188-1191；dubensky等,(1996)j.virol.70:508-519；hariharan等(1998)j.virol.72:950-958；polo等(1999)pnas96:4598-4603)、西门利克森林病毒(liljestrom(1991)bio/technology9:1356-1361；berglund等(1998)nat.biotech.16:562-565)、和委内瑞拉马脑炎病毒(pushko等(1997)virology239:389-401)。α病毒来源的复制子通常整体特征非常相似(如结构、复制)，单独α病毒可表现一些独特的具体特性(如受体结合、干扰素敏感性和疾病分布)。因此，也可使用采用不同病毒科制备的嵌合α病毒复制子。基于α病毒的rna复制子通常为(+)链rna，其引起细胞递送后复制酶(或复制酶-转录酶)的翻译。这些复制酶翻译为自切割产生复制复合物的聚蛋白，所述复合物形成所述(+)链递送rna的基因组(-)链拷贝。这些(-)链转录本可自身转录以得到所述(+)链亲本rna的其他拷贝和产生编码所述抗原的亚基因组转录本。因此所述亚基因组转录本的翻译引起所述感染细胞原位表达抗原。合适的α病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。rna复制子优选包括来自小核糖核酸病毒、外衣病毒、冠状病毒、副粘病毒、黄热病毒或α病毒(如辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒或罗斯河病毒)的rna基因组，其已用编码感兴趣产物的选定异源核酸序列替代一种或多种结构蛋白基因进行修饰。优选的复制子编码(i)能从复制子转录rna的rna-依赖性rna聚合酶和(ii)抗原。所述聚合酶可为α病毒复制酶例如包括一种或多种α病毒蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。尽管除了所述非结构复制酶聚蛋白，天然α病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但优选复制子不编码α病毒结构蛋白。因此优选的复制子可引起细胞中基因组rna拷贝的自生成，但不引起含rna的病毒粒子生成。不能生成这些病毒粒子说明所述优选复制子不像野生型α病毒，其自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的α病毒结构蛋白在优选的复制子中缺失，且他们的位置被编码感兴趣抗原的基因占据，从而所述亚基因组转录本编码抗原而不是所述结构α病毒病毒粒子蛋白。本发明使用的复制子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码抗原。在一些实施方式中，所述rna可具有额外的(下游)开放阅读框用于例如编码其他抗原或编码辅助多肽。优选的复制子具有5'帽(如7-甲基鸟苷)，其常可提高rna的体内翻译。在一些实施方式中，可能需要选择复制子的5'序列以确保与所编码复制酶的相容性。复制子可具有3'聚a尾。其还可在3'末端附近包括聚a聚合酶识别序列(如aauaaa)。复制子可具有各种长度，但其通常为5000-25000核苷酸长度，如8000-15000核苷酸或9000-12000核苷酸。复制子通常可通过体外转录(ivt)制备。ivt可使用细菌中质粒形式产生和增殖或合成产生(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(pcr)工程改造方法)的(cdna)模板。例如，dna依赖性rna聚合酶(如噬菌体t7、t3或sp6rna聚合酶)可用于从dna模板转录复制子。合适的加帽和聚a加成反应可按需使用(尽管所述复制子的聚a通常在dna模板内编码)。这些rna聚合酶可对转录的5'核苷酸有严格的要求，且在一些实施方式中这些要求必须与所编码复制酶的要求匹配，以确保ivt-转录rna能有效作为其自身编码复制酶的底物发挥作用。具体示例包括基于辛德毕斯病毒的质粒(psin)如美国专利号5,814,482和6,015,686，以及国际公开号wo97/38087、wo99/18226和wo02/26209所述的psincp。此类复制子的构建在美国专利号5,814,482和6,015,686中一般描述。在其他方面，所述自复制rna分子源自或基于α病毒以外的病毒，优选正链rna病毒，更优选小rna病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。合适的野生型α病毒序列熟知且可从序列保藏所如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)获得。合适α病毒的代表性示例包括奥拉病毒(atccvr-368)、贝巴鲁病毒(atccvr-600、atccvr-1240)、犰狳病毒(atccvr-922)、基孔肯雅病毒(atccvr-64、atccvr-1241)、东方马脑脊髓炎病毒(easternequineencephalomyelitisvirus)(atccvr-65、atccvr-1242)、摩根堡病毒(atccvr-924)、格塔病毒(atccvr-369、atccvr-1243)、克泽拉格齐病毒(atccvr-927)、马亚罗(mayaro)(atccvr-66)、马亚罗病毒(atccvr-1277)、米德尔堡病毒(middleburg)(atccvr-370)、穆坎博病毒(atccvr-580、atccvr-1244)、恩杜姆病毒(ndumu)(atccvr-371)、皮春纳病毒(atccvr-372、atccvr-1245)、罗斯河病毒(atccvr-373、atccvr-1246)、西门利克森林病毒(atccvr-67、atccvr-1247)、辛德比斯病毒(atccvr-68、atccvr-1248)、托纳特(atccvr-925)、特里尼蒂病毒(atccvr-469)、乌纳病毒(atccvr-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(atccvr-69、atccvr-923、atccvr-1250atccvr-1249、atccvr-532)、西马脑脊髓炎病毒(atccvr-70、atccvr-1251、atccvr-622、atccvr-1252)、沃达罗河病毒(atccvr-926)和y-62-33(atccvr-375)。本发明的自复制rna分子比用经修饰核苷酸制备的其它rna类型(如mrna)更大。通常，本发明的自复制rna分子含至少约4kb。例如，自复制rna可含至少约5kb、至少约6kb、至少约7kb、至少约8kb、至少约9kb、至少约10kb、至少约11kb、至少约12kb或多于12kb。在某些示例中，自复制rna为约4kb–约12kb、约5kb－约12kb、约6kb－约12kb、约7kb－约12kb、约8kb－约12kb、约9kb－约12kb、约10kb－约12kb、约11kb－约12kb、约5kb－约11kb、约5kb－约10kb、约5kb－约9kb、约5kb－约8kb、约5kb－约7kb、约5kb－约6kb、约6kb－约12kb、约6kb－约11kb、约6kb－约10kb、约6kb－约9kb、约6kb－约8kb、约6kb－约7kb、约7kb－约11kb、约7kb－约10kb、约7kb－约9kb、约7kb－约8kb、约8kb－约11kb、约8kb－约10kb、约8kb－约9kb、约9kb－约11kb、约9kb－约10kb或约10kb－约11kb。本发明的自复制rna分子可包括一种或多种类型的修饰核苷酸(如假尿苷、n6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷)。自复制rna分子可编码单一异源多肽抗原，或任选地两种或更多异源多肽抗原，所述多肽抗原表达为氨基酸序列时以各自序列保持其特性的方式连接在一起(如顺序连接)。然后自复制rna产生的异源多肽可生成为融合多肽或以产生分开多肽或肽序列的方法进行工程改造。本发明的自复制rna可编码一种或多种含一定范围表位的多肽抗原。优选能引起辅助t细胞响应或细胞毒性t细胞响应或二者的表位。本文所述自复制rna分子可进行工程改造以从两个或更多开放阅读框表达多核苷酸序列，从而使蛋白共表达，例如两种或更多抗原以及细胞因子或其它免疫调节剂，这可增强免疫应答的生成。该自复制rna分子可能特别有用，例如用于同时生成各种基因产物(如蛋白)，如作为二价或多价疫苗。本发明的自复制rna分子可用任何合适方法制备。本领域已知生产含修饰核苷酸的rna分子的数种合适方法。例如，含修饰核苷酸的自复制rna分子可通过用合适的dna依赖性rna聚合酶转录(如体外转录)编码自复制rna分子的dna来制备，所述酶例如t7噬菌体rna聚合酶、sp6噬菌体rna聚合酶、t3噬菌体rna聚合酶等，或能将经修饰核苷酸有效纳入rna分子的这些聚合酶的突变体。转录反应包含核苷酸和修饰的核苷酸，和支持所选聚合酶的活性的其它组分，如合适的缓冲液和合适的盐。将核苷酸类似物纳入自复制rna可经工程改造以(例如)改变该rna分子的稳定性、增加对rna酶的抗性、引入合适宿主细胞后确立复制(rna的“感染性”)、和/或诱导或降低先天和获得性免疫应答。合适的合成方法可单独使用，或与一种或多种其它方法(如重组dna或rna技术)联用来生产本发明的自复制rna分子。合适的离体合成方法为本领域熟知且可适用于具体应用。示例性方法包括例如用合适保护基团如cem的化学合成(masuda等,(2007)nucleicacidssymposiumseries51:3-4)、β-氰基乙基亚磷酰胺方法(beaucagesl等(1981)tetrahedronlett22:1859)；核苷酸氢亚磷酸酯方法(gareggp等(1986)tetrahedronlett27:4051-4；froehlerbc等(1986)nuclacidres14:5399-407；gareggp等(1986)tetrahedronlett27:4055-8；gaffneybl等(1988)tetrahedronlett29:2619-22)。能运行这些化学法或其适用于市售可得的自动核酸合成仪。其它合适的合成法在uhlmann等(1990)chemrev90:544-84和goodchildj(1990)bioconjugatechem1:165中公开。核酸合成还可用本领域熟知和常规的合适重组方法进行，包括多核苷酸和该多核苷酸所编码基因产物的克隆、加工和/或表达。通过随机片段化的dna改组以及基因片段和合成多核苷酸的pcr重组装是能用于设计和工程改造多核苷酸序列的已知技术示例。可采用定点诱变来改变核酸和编码蛋白，例如插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体、引入突变等。转录、翻译和表达核酸序列的合适方法为本领域已知且常见。(一般参见，currentprotocolsinmolecularbiology(《新编分子生物学实验指南》),卷2,ausubel等编,格林出版集团和威力出版公司(greenepublish.assoc.&wileyinterscience),第13章,1988；glover,dnacloning(《dna克隆》),卷ii,华盛顿哥伦比亚特区的irl出版社出版(irlpress),第3章,1986；bitter,等,methodsinenzymology(《酶学方法》)153:516-544(1987)；themolecularbiologyoftheyeastsaccharomyces(《酿酒酵母分子生物学》),strathern等编,冷泉港出版社(springharborpress),卷i和ii,1982；和sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆：实验室指南》),冷泉港出版社,1989)。自复制rna分子中一种或多种经修饰核苷酸的存在和/或含量可用任何合适的方法确定。例如，自复制rna可消化为单磷酸(如使用核酸酶p1)并去磷酸化(如使用合适的磷酸酶如ciap)，得到的核苷酸用反向hplc分析(例如使用ymcpackods-aq柱(5微米,4.6x250mm)并用30％b(0-5分钟)-100％b(5–13分钟)梯度且在100％b(13-40)分钟洗脱，流速(0.7毫升/分钟),uv检测(波长:260nm),柱温(30℃)。缓冲液a(20mm乙酸–乙酸铵ph3.5),缓冲液b(20mm乙酸–乙酸铵ph3.5/甲醇[90/10]))。任选地，本发明的自复制rna分子可包括一种或多种修饰的核苷酸从而所述自复制rna分子在引入或进入宿主细胞(如人类细胞)后相比不含修饰核苷酸的对应自复制rna分子具有更小的免疫调节活性。若需要，自复制rna分子可经筛选或分析以用本领域技术人员已知的各种体外或体内测试方法确定其治疗和预防特性。例如，含自复制rna分子的疫苗可就其对感兴趣的具体淋巴细胞类型的增殖或效应功能诱导的影响进行测试，所述淋巴细胞类型如b细胞、t细胞、t细胞系和t细胞克隆。例如，可分离免疫小鼠的脾细胞并分析细胞毒性t淋巴细胞裂解自体靶细胞的能力，所述靶细胞含编码多肽抗原的自复制rna分子。此外，可用elisa通过测量th1(il-2和ifn-γ)和/或th2(il-4和il-5)细胞因子的增殖和生成或在直接cd4+t细胞中通过胞质细胞因子染色和流式细胞术来分析t辅助细胞分化。编码多肽抗原的的自复制rna分子还可就其诱导体液免疫应答的能力进行测试，例如通过诱导b细胞产生对感兴趣抗原特异的抗体所证实。这些试验可用例如来自免疫个体的外周b淋巴细胞进行。该试验方法为本领域技术人员已知。能用于表征本发明自复制rna分子的其它试验可涉及检测靶细胞对编码抗原的表达。例如，facs可用于检测细胞表面或胞内的抗原表达。facs选择的另一优势是可就不同表达水平进行分选；有时可能需要较低的表达。鉴定表达具体抗原的细胞的其它合适方法涉及用单克隆抗体在平板上淘选或用包被有单克隆抗体的磁珠捕获。b.抗原在某些实施方式中，本文所述带负电分子是编码抗原的核酸分子(如rna分子)。合适的抗原包括但不限于细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原、植物抗原、癌抗原或其组合。合适的抗原包括来自病原体如病毒、细菌、真菌、原生动物、植物或肿瘤的蛋白和肽。病毒抗原和免疫原可由自复制rna分子编码，包括但不限于来自下述病毒的蛋白和肽：正粘病毒如流感病毒a、b和c；副粘病毒科病毒、如肺炎病毒(rsv)、副粘病毒(piv)、偏肺病毒和麻疹病毒(如麻疹)；肺炎病毒如呼吸道合胞病毒(rsv)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒；副粘病毒如1-4型副流感病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒、尼帕病毒、亨尼帕病毒和新城疫病毒；痘病毒科，包括正痘病毒(orthopoxvirus)如花(variolavera)(包括但不限于，重型天花(variolamajor)和轻型天花(variolaminor))；偏肺病毒、如人偏肺病毒(hmpv)和禽偏肺病毒(ampv)；麻疹病毒如麻疹；小核糖核酸病毒、如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝rna病毒、副肠孤病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒；肠道病毒、如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型柯萨奇病毒a、1-6型柯萨奇病毒b、1-9、1-27和29-34型艾柯(echo)病毒和肠道病毒68-71型、布尼亚病毒、包括正布尼亚病毒(orthobunyavirus)如加利福尼亚脑炎病毒；白蛉病毒(phlebovirus)如裂谷热病毒；内罗病毒(nairovirus)如克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congohemorrhagicfever)；嗜肝rna病毒如甲肝病毒(hav)；披膜病毒(风疹病毒)、如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒；抗黄病毒、如蜱媒脑炎(tbe)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、开萨诺森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、国春夏脑炎病毒、波瓦生脑炎病毒的抗原；瘟病毒、如牛病毒性腹泻(bvdv)、经典猪瘟(csfv)或边界病(bdv)；肝dna病毒、如乙肝病毒、丙肝病毒；弹状病毒、如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(vsv)、杯状病毒、如诺沃克病毒、和诺沃克样病毒、如夏威夷病毒和雪山病毒；冠状病毒，如sars、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(ibv)、小鼠肝炎病毒(mhv)、和猪传染性肠胃炎病毒(tgev)；逆转录病毒如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒；呼吸道肠道病毒、如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒、或科罗拉多壁虱热病毒(coltivirus)；细小病毒、如细小病毒b19；丁肝病毒(hdv)；戊肝病毒(hev)；庚肝病毒(hgv)；人疱疹病毒、如单纯疱疹病毒(hsv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、人疱疹病毒6(hhv6)、人疱疹病毒7(hhv7)、和人疱疹病毒8(hhv8)；乳头状多瘤空泡病毒、如乳头瘤病毒和多瘤病毒、腺病毒和沙粒病毒。在一些实施方式中，抗原引起针对感染鱼的病毒的免疫应答，如：传染性鲑鱼贫血病毒(isav),鲑鱼胰腺疾病病毒(spdv),传染性胰腺坏死病毒(ipnv),斑点叉尾鮰病毒(ccv),与鱼淋巴囊肿病毒(fldv),传染性造血组织坏死病病毒(ihnv),锦鲤疱疹病毒,鲑鱼小rna样病毒(又称为大西洋鲑鱼小rna样病毒),陆封鲑鱼病毒(lsv),大西洋鲑鱼轮状病毒(asr),鳟鱼草莓病病毒(tsd),银鲑鱼肿瘤病毒(cstv),或鱼病毒性出血性败血症病毒(vhsv)。在一些实施方式中，所述抗原引起针对来自疟原虫属的寄生虫的免疫应答，所述寄生虫如恶性疟原虫(p.falciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、三日疟原虫(p.malariae)或卵圆疟原虫(p.ovale)。因此本发明可用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，所述抗原引起针对来自鱼虱科的寄生虫的免疫应答，特别是来自疮痂鱼虱属和鱼虱属的那些，如海虱例如鲑疮痂鱼虱(lepeophtheirussalmonis)或智利鱼虱(caligusrogercresseyi)。自复制rna分子编码的细菌抗原和免疫原包括但不限于来自下述的蛋白和肽：脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、粘膜炎莫拉菌(moraxellacatarrhalis)、百日咳博德特菌(bordetellapertussis)、伯克霍尔德氏菌(burkholderiasp.)(如鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderiamallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderiapseudomallei)和洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia))、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、破伤风梭菌(clostridiumtetani(破伤风))、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinums(肉毒杆菌))、白喉棒状杆菌(cornynebacteriumdiphtheriae(白喉))、绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、伯内特科克斯立克次体(coxiellaburnetii)、布鲁氏菌(brucellasp.)(如流产布鲁氏菌(b.abortus)、狗布鲁氏菌(b.canis)、马耳他布鲁氏菌(b.melitensis)、木鼠布鲁氏菌(b.neotomae)、羊布鲁氏菌(b.ovis)、猪布鲁氏菌(b.suis)和鳍足类海洋布鲁氏菌(b.pinnipediae,))、弗朗西斯氏菌(francisellasp.)(如新凶手弗朗西斯氏菌(f.novicida)、蜃楼弗朗西斯氏菌(f.philomiragia)和土拉热弗朗西斯氏菌(f.tularensis))、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、淋病奈瑟球菌(neiserriagonorrhoeae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、苍白密螺旋体(treponemapallidum(梅毒))、杜氏嗜血菌(haemophilusducreyi)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(yersiniaenterocolitica)、大肠杆菌(e.coli)如产毒性大肠杆菌(etec),肠聚集性大肠杆菌(eaggec),弥散性粘着大肠杆菌(daec),肠致病性大肠杆菌(epec),肠外致病性大肠杆菌(expec；如尿致病性大肠杆菌(upec)和脑膜炎/败血症-相关大肠杆菌(mnec)),和/或肠出血性大肠杆菌(ehec)、炭疽杆菌(bacillusanthracis(炭疽))、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis(鼠疫))、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、立克次体(rickettsia)、单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphi(伤寒))、布氏疏螺旋体(borreliaburgdorfer)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、克雷伯菌(klebsiella)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)等。可由自复制rna分子编码的真菌抗原和免疫原包括但不限于来自皮肤真菌的蛋白和肽，包括：絮状表皮霉菌(epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(microsporumaudouini)，犬小孢子菌(microsporumcanis)，扭曲小孢子菌(microsporumdistortum)，马小孢子菌(microsporumequinum)，石膏样小孢子菌(microsporumgypsum)，矮小小孢子菌(microsporumnanum)，同心性毛癣菌(trichophytonconcentricum)，马毛癣菌(trichophytonequinum)，鸡毛癣菌(trichophytongallinae)，石膏样毛癣菌(trichophytongypseum)，(trichophytonmegnini)，须癣毛癣菌(trichophytonmentagrophytes)，(trichophytonquinckeanum)，红色毛癣菌(trichophytonrubrum)，许兰毛癣菌(trichophytonschoenleini)，断发毛癣菌(trichophytontonsurans)，疣状毛癣菌(trichophytonverrucosum)，疣状毛癣菌(t.verrucosum)白变种、盘状变种、赭黄变种，紫色毛癣菌(trichophytonviolaceum)和/或蜜块状毛癣菌(trichophytonfaviforme)；或来自烟曲霉(aspergillusfumigatus)、黄曲霉(aspergillusflavus)、黑曲霉(aspergillusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、土曲霉(aspergillusterreus)、聚多曲霉(aspergillussydowi)、黄曲菌(aspergillusflavatus)、灰绿曲霉(aspergillusglaucus)、头状芽裂殖菌(blastoschizomycescapitatus)、白假丝酵母(candidaalbicans)、烯醇酶假丝酵母(candidaenolase)、热带假丝酵母(candidatropicalis)、光滑假丝酵母(candidaglabrata)、克柔假丝酵母(candidakrusei)、近平滑假丝酵母(candidaparapsilosis)、类星形假丝酵母(candidastellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(candidakusei)、帕拉克斯假丝酵母(candidaparakwsei)、葡萄牙假丝酵母(candidalusitaniae)、伪热带假丝酵母(candidapseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(candidaguilliermondi)、卡氏枝孢霉(cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatidis)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、棒地霉(geotrichumclavatum)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、微孢子虫(microsporidia)、脑炎微孢子虫属(encephalitozoonspp)、肠间隔微孢子虫(septataintestinalis)和毕氏肠微孢子虫(enterocytozoonbieneusi)；较不常见的是短粒虫属(brachiolaspp.)、微胞子虫属(microsporidiumspp.)、微孢子虫属(nosemaspp.)、皮里虫属(pleistophoraspp)、气管普孢虫属(trachipleistophoraspp.)、条孢虫属(vittaformaspp.)、巴西芽生菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、苜蓿腐酶(pythiumninsidiosum)、皮屑芽胞菌(pityrosporumovale)、酿酒酵母(sacharomycescerevisae)、布拉酵母(saccharomycesboulardii)、粟酒酵母(saccharomycespombe)、尖端赛多孢子菌(scedosporiumapiosperum)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)、白吉利丝孢酵母(trichosporonbeigelii)、弓形虫(toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉菌(penicilliummarneffei)、马拉色菌属(malasseziaspp.)、着色真菌属(fonsecaeaspp.)、王氏霉菌属(wangiellaspp.)、孢子丝菌属(sporothrixspp.)、蛙粪霉属(basidiobolusspp.)、耳霉属(conidiobolusspp.)、根霉属(rhizopusspp.)、毛霉属(mucorspp.)、犁头霉属(absidiaspp.)、被孢霉属(mortierellaspp.)、小克银汉霉属(cunninghamellaspp.)、瓶霉属(saksenaeaspp.)、链格孢菌属(alternariaspp.)、弯孢菌属(curvulariaspp.)、长蠕孢菌属(helminthosporiumspp.)、镰胞菌属(fusariumspp.)、曲霉属(aspergillusspp.)、青霉属(penicilliumspp.)、链核盘菌属(monoliniaspp.)、丝核菌属(rhizoctoniaspp.)、拟青霉属(paecilomycesspp.)、皮司霉属(pithomycesspp.)和枝孢属(cladosporiumspp.)。可由自复制rna分子编码的原生动物抗原和免疫原包括但不限于来自痢疾内变形虫(entamoebahistolytica)、贾第鞭毛虫(giardialambli)、小隐孢子虫(cryptosporidiumparvum)、卡宴环孢子球虫(cyclosporacayatanensis)和弓形虫(toxoplasma)的蛋白和肽。可由自复制rna分子编码的植物抗原和免疫原包括但不限于来自蓖麻(ricinuscommunis)的蛋白和肽。合适的抗原包括来自例如下述病毒的蛋白和肽：人体免疫缺陷病毒(hiv),甲肝病毒(hav),乙肝病毒(hbv),丙肝病毒(hcv),单纯疱疹病毒(hsv),巨细胞病毒(cmv),流感病毒(flu),呼吸道合胞病毒(rsv),细小病毒,诺如病毒,人乳头瘤病毒(hpv),鼻病毒,黄热病毒,狂犬病病毒,登革热病毒,麻疹病毒,流行性腮腺炎病毒,风疹病毒,水痘-带状疱疹病毒,肠道病毒(如肠道病毒71),埃博拉病毒,和牛性腹泻病毒。优选地，抗原物质选自下组：hsv糖蛋白gd,hiv糖蛋白gp120,hiv糖蛋白gp40,hivp55gag,和来自pol和tat区域的糖蛋白。在本发明其它优选实施方式中，抗原是源自细菌的蛋白或肽，所述细菌例如幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、霍乱弧菌(vibriocholerae(霍乱))、白喉棒状杆菌(c.diphtheriae(白喉))、破伤风梭菌(c.tetani(破伤风))、脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)、百日咳博德特菌(b.pertussis)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)等。可由本发明自复制rna分子编码的hiv抗原描述于1990年3月9日提交的美国申请序列号490,858和公开的欧洲申请号181150(1986年5月14日),以及美国申请序列号60/168,471；09/475,515；09/475,504；和09/610,313,其公开内容通过引用全文纳入本文。本发明自复制rna分子可编码的巨细胞病毒抗原描述于美国专利号4,689,225,1989年6月16日提交的美国申请序列号367,363和pct公开wo89/07143，其公开内容通过引用全文纳入本文。本发明自复制rna分子可编码的丙肝病毒抗原描述于pct/us88/04125,公开的欧洲申请号318216(1989年5月31日),1988年11月18日提交的公开日本申请号1-500565,加拿大申请583,561,和epo388,232,其公开内容通过引用全文纳入本文。一组不同的hcv抗原描述于1990年3月16日提交的欧洲专利申请90/302866.0和1989年12月21日提交的美国申请序列号456,637和pct/us90/01348，其公开内容通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，抗原源自变应原，如花粉变应原(树、草本、杂草和草花粉变应原)；昆虫或蜘蛛变应原(吸入、唾液和毒液变应原如螨虫变应原、蟑螂和蠓变应原、膜翅目昆虫毒液变应原)；动物毛发和头皮屑变应原(来自例如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)；和食物变应原(如麸朊)。来自树、草和草本的重要花粉变应原源自分类目壳斗目,木犀目,松杉目和悬铃木目，包括但不限于白桦(桦属)，赤杨(桤木)，榛子(榛属)，鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)，柳杉(柳杉属和圆柏属)，悬铃木(法国梧桐)，禾本目包括黑麦属、猫尾属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、子虉草属、黑麦属和高粱属的草，菊目和荨麻目包括草本植物豚草属、蒿属和欧蓍草属。其它重要的吸入变应原是来自尘螨属和欧尘螨属的屋尘螨、仓储螨如害嗜鳞螨、食甜螨和食酪螨，来自蟑螂、蠓和跳蚤例如德国小蠊、大蠊、摇蚊和猫栉头蚤的那些，以及来自哺乳动物如猫、狗和马的那些，毒液变应原包括源自针昆虫或咬虫的那些如源自膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科(apidae))、黄蜂(胡蜂科(vespidea))和蚂蚁(蚁总科(formicoidae))。在某些实施方式中，肿瘤免疫原或抗原或者癌免疫原或抗原可由自复制rna分子编码。在某些实施方式中，肿瘤免疫原和抗原是含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。适用于本文的肿瘤免疫原和抗原包括各种分子，如(a)含多肽的肿瘤抗原，包括多肽(长度范围可以是(例如)8-20个氨基酸，虽然超出此范围以外的长度也常见)、脂多肽和糖蛋白。在某些实施方式中，肿瘤免疫原是例如：(a)与癌细胞相关的全长分子，(b)相同的同源物和修饰形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)相同的片段。肿瘤免疫原包括例如：cd8+淋巴细胞识别的i型-限制性抗原或cd4+淋巴细胞识别的ii型-限制性抗原。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于(a)睾丸癌抗原如ny-eso-1、ssx2、scp1以及rage、bage、gage和mage家族多肽，如gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6和mage-12(例如，可用于检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、nsclc瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/ras(例如，与黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、cdk4(例如，与黑色素瘤有关)、mum1(例如，与黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(例如，与头颈癌有关)、cia0205(例如，与膀胱癌有关)、hla-a2-r1701、β联蛋白(例如，与黑色素瘤有关)、tcr(例如，与t-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、bcr-abl(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、磷酸丙糖异构酶、kia0205、cdc-27和ldlr-fut，(c)过量表达抗原，例如半乳糖凝集素4(例如，与结直肠癌有关)、半乳糖凝集素9(例如，与霍奇金病有关)、蛋白酶3(例如，与慢性髓细胞性白血病有关)、wt1(例如，与多种白血病有关)、碳酸酐酶(例如，与肾癌有关)、醛缩酶a(例如，与肺癌有关)、prame(例如，与黑色素瘤有关)、her-2/neu(例如，与乳腺癌、结肠癌、肺癌与卵巢癌有关)、甲胎蛋白(例如，与肝细胞癌有关)、ksa(例如，与结直肠癌有关)、胃泌素(例如，与胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白、muc-1(例如，与乳腺癌和卵巢癌有关)、g-250(例如，与肾细胞癌有关)、p53(例如，与乳腺癌和结肠癌有关)和癌胚抗原(例如，与乳腺癌、肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如mart-1/melana、gp100、mc1r、黑素细胞-刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/trp1和酪氨酸酶相关蛋白-2/trp2(例如，与黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如pap、psa、psma、psh-p1、psm-p1、psm-p2，例如与前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和b细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15、hom/mel-40、h-ras、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、eb病毒抗原、ebna、人乳头瘤病毒(hpv)抗原，包括e6和e7、乙肝和丙肝病毒抗原、人t细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、tsp-180、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、mn-23h1、tag-72-4、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、p16、tage、psca、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、β-hcg、bca225、btaa、ca125、ca15-3(ca27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\kp1、co-029、fgf-5、ga733(epcam)、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90(mac-2结合蛋白\亲环蛋白c相关蛋白)、taal6、tag72、tlp、tps等。c.用于带负电分子的水溶液带负电分子(如rna)通常以水溶液或可容易在水溶液中溶解的形式提供(如冻干)。水溶液可为水或包含盐(如nacl)的水溶液、缓冲液(如柠檬酸盐缓冲液)、渗透压或张力调节剂(如糖)、聚合物、表面活性剂或其组合。若所述制剂旨在体内给予，优选所述水溶液为保持与正常生理条件相容性ph的生理上可接受缓冲液。而且，在某些情况中，可能需要将ph维持在特定水平从而确保制剂中某些组分的稳定性。例如，可能需要制备等张和/或等渗的水溶液。高渗和低渗溶液在注射时有时会引起并发症和不想要的影响，如组合物和生理液体之间不同离子浓度引起的给药后肿胀或组合物快速吸收。为了控制张力，乳液可包含生理盐如钠盐。例如可使用约0.9％(w/v)的氯化钠(nacl)(生理盐水)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。在示例性实施方式中，水溶液含10mmnacl和其它盐或非离子等张剂。如前所述，非离子等张剂还可用于控制张力。水溶液可经缓冲。本文可用任何生理上可接受的缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。水溶液的ph优选为6.0-8.0，优选约6.2-约6.8。在一些情况中，缓冲液中可包括一定量的盐。在其它情况中，缓冲液中的盐可干扰并因此避免带负电分子与所述乳液颗粒的复合。所述水溶液还可包含其它组分如改变水溶液渗透压的分子或稳定复合后带负电分子的分子。例如，可用非离子等张剂调节渗透压，所述等张剂通常为碳水化合物但也可为聚合物。(参见例如，voet和voet(1990)biochemistry(纽约johnwiley&sons公司)。合适的非离子等张剂示例包括糖(如棉子糖、蔗糖、右旋糖、果糖、还原帕拉金糖等)、糖醇(如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、丙三醇等)或其组合若需要，可使用非离子聚合物(如聚(烷基醇)例如聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丁烯醇)或非离子表面活性剂。这些类型的试剂尤其是糖和糖醇也是冷冻保护剂，能在冻干时保护rna和其它带负电分子。在示例性实施方式中，所述缓冲液包括约560nm–600mm棉子糖、蔗糖、山梨糖醇或右旋糖。在一些情况中，优选制备含带负电分子的水溶液作为高渗溶液，并用无杂质的水或低渗溶液制备阳离子乳液。当乳液和带负电分子组合时，所述混合物变为等张的。例如，含rna的水溶液可为2x高渗溶液，且阳离子乳液可用10mm柠檬酸盐缓冲液制备。rna溶液和乳液1:1(v/v)混合时，组合物变为等渗。根据乳液与含带负电分子的水溶液的所需相对含量(如1:1(v/v)混合,2:1(v/v)混合,1:2(v/v)混合等)，可容易确定实现等张混合物所需的水溶液的张力。相似地，具有生理渗透压的组合物可能理想地用于体内给予。生理渗透压为约255mosm/kg水-约315mosm/kg水。有时，优选制备含带负电分子的水溶液作为高渗溶液，并用无杂质的水或低渗溶液制备阳离子乳液。当乳液和带负电分子组合时，实现生理渗透压。根据乳液与含带负电分子的水溶液的所需相对含量(如1:1(v/v)混合,2:1(v/v)混合,1:2(v/v)混合等)，可容易确定实现等渗混合物所需的水溶液的渗透压。在某些实施方式中，含带负电分子的水溶液还包括聚合物或表面活性剂或其组合。在一个示例性实施方式中，所述水包油乳液含泊洛沙姆。具体地，发明人发现与阳离子乳液颗粒复合前添加f127到rna水溶液中引起rna分子的稳定性增加和对rna酶的抗性增强。还发现添加普朗尼克(pluronic)f127到rna水溶液中会降低rna/cne复合物的粒度。泊洛沙姆聚合物还可有利于合适的rna分子去复合/释放，防止乳液颗粒聚集，和具有免疫调节效应。可用的其它聚合物包括例如f68或peg300。或者或此外，含带负电分子的水溶液可包括约0.05％-约20％(w/v)聚合物。例如，阳离子水包油乳液可包括约0.05％-约10％(w/v),如0.05％、0.5％、1％或5％的聚合物(如泊洛沙姆例如f127,f68,或peg300)。缓冲系统可包括两种或更多上述分子(盐、缓冲液、糖、聚合物等)的任何组合。在优选的实施方式中，所述缓冲液包括560mm蔗糖、20mmnacl,和2mm柠檬酸盐，其可与本文所述阳离子水包油乳液混合，产生包含280mm蔗糖、10mmnacl和1mm柠檬酸盐的最终水相。5.制备方法在另一方面，本发明提供制备包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的组合物的方法，所述方法包括：制备阳离子水包油乳液，其中所述乳液包括：(1)约0.2％-约20％(v/v)油,(2)约0.01％-约2.5％(v/v)表面活性剂，和(3)阳离子脂质；向所述阳离子水包油乳液中添加所述带负电分子，从而所述带负电分子与所述乳剂的颗粒复合。生成阳离子水包油乳液的一种示例性方法通过包含以下的过程：(1)组合所述油和所述阳离子脂质，形成所述乳液的油相；(2)提供水相来形成所述乳液的水相；和(3)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。可用任何合适方法实现均质化，例如使用市售的均质机(如ikat25均质机,可获自vwr国际公司(vwrinternational)(宾夕法尼亚州西切斯特))。阳离子脂质可溶于合适的溶剂，如氯仿(chcl3)、二氯甲烷(dcm)、乙醇、丙酮、四氢呋喃(thf)、2,2,2三氟乙醇、丙烯腈、乙酸乙酯、己烷、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)等，并直接添加到乳液的油组分中。或者，所述阳离子脂质可添加到合适的乳剂中形成脂质体悬液；然后所述脂质体悬液可加入所述乳液的油组分。所述阳离子脂质还可在所述油中直接溶解。需要将所述油加热到约30℃–约65℃温度以有利于所述脂质的溶解。可测量阳离子脂质(如dotap)的所需含量且可溶于溶剂、水或直接溶于油中以达到本文所述和示例的所需终浓度。溶剂如氯仿(chcl3)或二氯甲烷(dcm)可在所述水相和油相组合前或均质化前例如通过蒸发从油相中移除。或者，在脂质溶解度可能是问题的情况中，可用仍在所述油相中的溶剂(如dcm)制备初级乳液。在该情况中，所述溶剂可在二次均质化前从初级乳液中移除(如能进行蒸发)。若乳液含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可根据本领域常规实践包括在油相或水相中。例如，span85可溶于油相(如鲨烯)，吐温80可溶于水相(如在柠檬酸盐缓冲液中)。在另一方面，本发明提供制备包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子(如rna)的组合物的方法，所述方法包括：(i)提供本文所述阳离子水包油乳液；(ii)提供含带负电分子(如rna)的水溶液；和(iii)组合(i)的水包油乳液和(iii)的水溶液，从而所述带负电分子与乳液颗粒复合。例如，阳离子水包油乳液可与含带负电分子(如水性rna溶液)的水溶液以任何需要的相对量组合，如约1:1(v/v)、约1.5:1(v/v)、约2:1(v/v)、约2.5:1(v/v)、约3:1(v/v)、约3.5:1(v/v)、约4:1(v/v)、约5:1(v/v)、约10:1(v/v)、约1:1.5(v/v)、约1:2(v/v)、约1:2.5(v/v)、约1:3(v/v)、约1:3.5(v/v)、约1:4(v/v)、约1:1.5(v/v),或约1:1.10(v/v)等。复合后组合物(如rna-乳液复合物)的各组分浓度可根据复合前水包油乳液和含所用带负电分子(如水性rna溶液)的水溶液的相对量而容易确定。例如，阳离子水包油乳液与含带负电分子的水溶液(如水性rna溶液)以1:1(v:v)比例组合时，所述油和阳离子脂质的浓度变为复合前乳液的一半。因此，若含4.3％(w/v)鲨烯、1.4mg/mldotap、0.5％v/vspan85和0.5％v/v吐温80(本文称为“cne17”)的乳液与含560mm蔗糖,20mmnacl,2mm柠檬酸盐,和1％(w/v)pluronicf127的水性rna溶液以1:1(v:v)组合，则复合后组合物含2.15％(w/v)鲨烯、0.7mg/mldotap、0.25％v/vspan85、0.25％v/v吐温80、280mm蔗糖、10mmnacl、1mm柠檬酸盐和0.5％(w/v)pluronicf127。可包括其它任选步骤以促进颗粒形成、改善带负电分子和阳离子颗粒之间的复合、增加带负电分子的稳定性(如防止rna分子降解)、有利于带负电分子(如rna分子)的合适去复合/释放、或防止乳液颗粒的聚集。例如，聚合物(如f127)或表面活性剂可加入含带负电分子(如rna)的水溶液中。在一个示例性实施方式中，在与所述乳液颗粒复合前将f127加入所述rna分子中。所述乳液颗粒的大小可通过改变表面活性剂与油的比例(增加比例则降低液滴大小)、操作压力(增加操作压力则降低液滴大小)、温度(提高温度则降低液滴大小)、和其它工艺参数而变化。实际粒度还随着所用的具体表面活性剂、油和阳离子脂质以及所选的具体操作条件而变化。乳液颗粒大小可通过使用筛选仪器来鉴定，如库尔特公司(coultercorporation)生产的市售亚微米颗粒分析仪(n4md型)，且参数可用上述指南而变化，直到颗粒的平均直径小于1μm、小于0.9μm、小于0.8μm、小于0.7μm、小于0.6μm、小于0.5μm、小于0.4μm、小于0.3μm、小于0.2μm或小于0.1μm。所述颗粒的平均直径优选为约400nm或更小、约300nm或更小、约200nm或更小、约180nm或更小、约150nm或更小、或约140nm或更小、约50nm-180nm、约60nm-180nm、约70-180nm、或约80nm-180nm、约80nm-170nm、约80nm-160nm、约80nm-150nm、或约80nm-140nm。在一些情况中，需要所述阳离子乳液的平均粒度为200nm或更小以用于灭菌过滤。在其它情况中，不需要灭菌过滤且所述阳离子乳液的平均粒度能大于200nm。制备阳离子水包油乳液(复合前乳液)或带负电分子-乳液复合物的可选过程包括例如灭菌、粒度选择(如移除大颗粒)、填充、包装和标记等。例如，若配制复合前乳液或带负电分子-乳液复合物用于体内给药，其可灭菌，例如通过灭菌级的滤器过滤(如通过0.22微米滤器)。其它灭菌技术包括热方法或放射灭菌方法或使用脉冲光来产生灭菌组合物。本文所述阳离子水包油乳液可用于生产疫苗。灭菌和/或临床级阳离子水包油乳液可用与mf59相似的方法制备。参见例如，ott等，methodsinmolecularmedicine(《分子医学方法》)，2000,卷42，211-228,收录于vaccineadjuvants(《疫苗佐剂》),(o’hagan编辑)，胡马纳出版公司(humanapress)。例如，与mf59生产方法相似，可组合乳液的油相和水相且在内联均质器中加工以产生粗乳液。然后粗乳液可加入微流化床中，其中可进一步加工获得稳定的亚微米乳液。粗乳液可重复通过微流化床的相互作用室直到获得需要的粒度。然后过滤(如氮气下通过0.22μm滤器)散装乳液以移除大颗粒，产生能填充入合适容器(如玻璃瓶)的散装乳液。对于存在水包油乳液时就自储存证明长期稳定性的疫苗抗原，抗原和乳液可组合并灭菌过滤(如通过0.22μm滤膜)。组合的单一药瓶疫苗可填充入单一剂量的容器中。对于未证实长期稳定性的疫苗抗原，乳液可作为单独药瓶提供。在该情况中，散装乳液可过滤灭菌(如通过0.22μm滤膜)、填充、包装在最终单一剂量药瓶中。任选在散装乳液或混合疫苗的小样品上进行质量控制，只有在样品通过质量控制检测后才将散装或混合疫苗包装成药剂。6.药物组合物和给药另一方面，如本文所述，本发明提供包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的带负电分子的药物组合物，并且还包括一种或多种药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。在优选的实施方式中，药物组合物是能用作疫苗的免疫原性组合物。或者，本文所述组合物可用于递送带负电分子到细胞。例如，核酸分子(如dna或rna)可递送到细胞以用于各种目的，如诱导所需基因产物(如蛋白)生成、调节基因表达、用于基因治疗等。本文所述组合物还可用于递送核酸分子(如dna或rna)到细胞以用于治疗目的，如治疗疾病如癌症或增殖性紊乱、代谢疾病、心血管疾病、感染、过敏，诱导免疫应答等。例如，核酸分子可递送到细胞以抑制靶基因表达。该核酸分子包括例如反义寡核苷酸、双链rna如小干扰rna等。双链rna分子如小干扰rna可引起rna干扰，其使对应靶基因特异沉默(基因敲除)。反义寡核苷酸是与选定序列互补的单链dna或rna。通常，反义rna可通过结合某些信使rna链来阻止其蛋白翻译。反义dna可用于靶向特异、互补(编码或非编码)rna。因此，本文所述阳离子乳液用于递送反义寡核苷酸或双链rna以治疗，例如通过抑制肿瘤靶标生成来治疗癌症。本文提供的药物组合物可以单独或与一种或多种其他治疗试剂联合给药。给药的方法包括但不限于口服给药、直肠给药、胃肠外给药、皮下给药、静脉内给药、玻璃体内给药、肌肉内给药、吸入、鼻内给药、局部给药、眼部给药或耳部给药。本文所述组合物的治疗有效量根据所示疾病、疾病严重度、对象年龄和相对健康状况、给予的化合物效力、给药方式和所需治疗等而不同。在其它实施方式中，本发明所述药物组合物可与一种或多种其它治疗剂联合给药。其他治疗试剂可包括但不限于抗生素或抗细菌剂，止吐剂，抗真菌剂，消炎剂，抗病毒剂，免疫调节剂，细胞因子，抗抑郁药，激素，烷化剂，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，抗有丝分裂剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞生长抑制剂，抗入侵剂，抗血管新生剂，生长因子功能抑制剂，病毒复制抑制剂，病毒酶抑制剂，抗肿瘤剂，α干扰素，β干扰素，利巴韦林，激素，和其他toll样受体调节剂，免疫球蛋白(ig)，和调节ig功能的抗体(例如抗ige(奥马珠单抗))。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗传染病，包括但不限于：本文公开的病原体引起的疾病，包括病毒疾病如生殖器疣、寻常疣、脚底疣、狂犬病、呼吸道合胞病毒(rsv)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革病毒、黄热病、单纯疱疹病毒(仅举示例来说，hsv-i、hsv-ii、cmv、或vzv)、传染性软疣、牛痘、天花、慢病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(丙肝病毒、乙肝病毒、甲肝病毒)、巨细胞病毒(cmv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、鼻病毒、肠病毒(如ev71)、腺病毒、冠状病毒(如sars)、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、乳多空病毒、嗜肝dna病毒、黄病毒、逆转录病毒、沙粒病毒(仅举例来说，lcm、胡宁病毒、马丘博病毒、瓜纳瑞托病毒(guanaritovirus)和拉沙热)和纤丝病毒(仅举例来说，埃博拉病毒或马尔堡病毒)。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗细菌、真菌和原生动物感染，包括但不限于：疟疾、肺结核和鸟分枝杆菌病,麻疯病；卡氏肺囊虫肺炎(pneumocystiscarnii),隐孢子虫病,组织胞浆菌病,弓形体病,锥虫病感染,利什曼病,埃希氏菌属(escherichia)、肠细菌属(enterobacter)、沙门氏菌属(salmonella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、克氏杆菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、链球菌属(streptococcus)和衣原体属(chlamydia)的细菌引起的感染，和真菌感染如念珠菌病(candidiasis)、曲霉病(aspergillosis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、隐球菌脑膜炎(cryptococcalmeningitis)。某些实施方式中，本文提供的药物组合物用于治疗呼吸疾病和/或紊乱、皮肤病、眼睛疾病和/或紊乱、泌尿生殖系统疾病和/或紊乱，包括同种异体移植物排斥，自身免疫和过敏，癌症，或损伤或老化皮肤如疤痕和皱纹。另一方面，发明提供在所需对象如哺乳动物中产生或增强免疫应答的方法，包括给予有效量的本文所公开组合物。所述免疫应答优选为保护性，并优选涉及抗体和/或细胞介导免疫。本方法可用于诱导初级免疫应答和/或加强免疫应答。在某些实施方式中，本文所述组合物可用作药物，如用于引起或增加需要对象如哺乳动物中的免疫应答。在某些实施方式中，本文所述组合物也可以用于生产引起或增强需要对象如哺乳动物中免疫应答的药物。本发明还提供了一种预填充有本发明所述组合物和疫苗的递送装置。所述哺乳动物优选人，但可以是如牛、猪、鸡、猫或狗，因为本文包括的病原体在广泛的物种中可能有问题。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)、青少年或成人；当疫苗用于治疗性用途时，人优选为青少年或成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如，以评估其安全性、剂量、免疫原性等。检测治疗性处理功效的一种方式包括在给予本发明所述组合物或疫苗后监测病原体感染。检测预防性处理功效的一种方式包括监测针对抗原的全身免疫应答(如监测igg1和igg2a生成水平)和/或粘膜免疫应答(如监测iga生成水平)。通常，在免疫后但在刺激前测定抗原特异性血清抗体应答，而在免疫后且刺激后测定抗原特异性粘膜抗体应答。另一评价本文所述组合物或疫苗(其中核酸分子(如rna)编码蛋白抗原)的免疫原性的方法是重组表达蛋白抗原以通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌。蛋白质和患者样品间的阳性反应表明患者已经产生对受试蛋白的免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或蛋白抗原内的表位。所述组合物的功效还可通过攻击感兴趣病原体感染的合适动物模型来体内确定。可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外初次和粘膜加强、粘膜初次和胃肠道外加强等给予各剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。包括一种或多种抗原或者与一种或多种抗原联用的本文所述组合物可用于治疗儿童和成人。因此，人类对象可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受所述组合物的对象优选老年人(如>50岁，>60岁并优选>65岁)，年轻人(如<5岁)，住院病人、保健护理人员、武装部队和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述组合物不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。包括一种或多种抗原或者与一种或多种抗原联用的本文所述组合物可与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、mmr疫苗、水痘疫苗、mmrv疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、dtp疫苗、偶联的b型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价a-c-w135-y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时给药。在某些实施方式中，本文提供的组合物包括或任选包括一种或多种免疫调节剂如佐剂。示例性佐剂包括但不限于th1佐剂和/或th2佐剂，其在下文中进一步讨论。在某些实施方式中，用于本文所提供免疫原性组合物的佐剂包括但不限于：1.含矿物质的组合物；2.油乳剂；3.皂苷制剂；4.病毒体和病毒样颗粒；5.细菌或微生物衍生物；6.生物粘着剂和粘膜粘着剂；7.脂质体；8.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；9.聚磷腈(pcpp)；10.胞壁酰肽11.咪唑并喹诺酮化合物。12.氨基硫脲化合物；13.色胺酮化合物；14.人免疫调节剂；15.脂肽；16.苯并萘啶；17.微粒18.免疫刺激多核苷酸(如rna或dna；如含cpg的寡核苷酸)实施例现已总体描述了本发明，参考以下实施例更易于理解本发明，这些实施例只是用于说明本发明的某些方面与实施方案，而非意在限制本发明。实施例1：阳离子水包油乳液的开发开发三种类型的阳离子纳米乳液(cne)用于递送自复制rna。1型乳液是“mf59”样乳液。这些乳液从mf59相同组分制备，除了添加阳离子脂质。2型乳液是在mf59中用磷脂替代司盘85和吐温80的乳液。3型乳液是杂交乳液，其通过脂质或其它表面活性剂而稳定且在乳液的水相中具有额外的聚合物或表面活性剂。三种不同脂质用于制备1型乳液：1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(氯化盐)(dotap)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]盐酸胆固醇(dc胆固醇)和二甲基双十八烷基铵(溴化盐)(dda)。dotap用于制备2型和3型乳液。术语n/p比指阳离子脂质中氮的含量相对rna上磷酸的含量。在测试的阳离子脂质中，氮是携带电荷的元素。可在rna主链上发现磷酸盐。n/p电荷比为10/1表明就rna上每个带负电磷酸盐而言，所存在阳离子脂质中有10个带正电氮。1型cne：吐温80、司盘85、鲨烯和柠檬酸盐缓冲液的比例在此类乳液中没有改变。这些乳液以与mf59相同的浓度制备。无论何种脂质浓度，每剂量的阳离子脂质总量保持恒定。例如，用0.8mg/mldotap乳液以n/p比10/1在乳液中递送10μg剂量rna需要2x稀释。因此递送的鲨烯含量为mf59免疫期间正常给予的量的一半。或者，用1.6mg/mldotap以n/p比10/1在乳液中递送10μg剂量rna需要4x稀释。在本实施例中，制备17种不同的1型乳液制剂。能制备入乳液的阳离子脂质的范围如下所列：表1dotap0.8mg/ml多至1.6mg/mldc胆固醇0.62mg/ml多至2.46mg/mldda0.73mg/ml多至1.64mg/mldotap浓度为0.8mg/ml多至1.6mg/ml的制剂都产生稳定乳液。dc胆固醇浓度为0.62mg/ml多至2.46mg/ml的制剂都产生稳定乳液。dda浓度为0.73mg/ml多至1.64mg/ml的制剂都产生稳定乳液。2型cne：2型cne的鲨烯百分比不同。与mf59的另一区别是这些乳液在水中制备而非柠檬酸盐缓冲液。这些乳液用1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dope)和磷脂酰胆碱(蛋pc)作为脂质稳定剂来制备用dope和蛋pc以及dotap、dc胆固醇或dda以1型乳液研究中的最佳浓度制备。单独系列的乳液仅用dotap作为稳定剂制备。这些乳液含各种含量的鲨烯(0.43％w/w多至4.3％w/w的mf59浓度)。3型cne：与dotap/蛋pc乳液复合前添加f127(泊洛沙姆)到rna中与不添加泊洛沙姆的样品相比对rna酶的稳定性更高。这表明该聚合物在使rna更好复合油滴中的作用。仅dotap乳液的乳化步骤中添加少量吐温80(0.08％w/w)产生更小的液滴尺寸。制备阳离子乳液的方法：角鲨烯、去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)获自西格玛公司(美国密苏里州圣路易斯)。二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dope)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙基)-氨甲酰基]盐酸胆固醇(dc-胆固醇hcl)购自阿凡提脂质公司(avantilipids)。.l-α-溶血磷脂胆碱(蛋,鸡)和1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(dotap)购自类脂公司(lipoid)(德国路德维希(ludwigshafengermany))。配制阳离子纳米乳液(cne)与带电mf59相似，如先前所述并略作修改(ott,singh等，2002)。简单地说，油可溶性组分(即角鲨烯、司盘85、阳离子脂质、脂质表面活性剂)在烧杯中结合，脂质组分溶于氯仿(chcl3)或二氯甲烷(dcm)。得到的脂质溶液直接加入到油和司盘85中。对于乳液亚组(cne01,02,17)，溶剂可在通风橱中室温蒸发2小时，然后与水相组合并均质化所述样品。对于剩余乳液(cne12,13,27,32,35)，油相与水相组合并用ikat25均质仪以24krpm立即均质化2分钟，从而提供均一的原料。cne05通过制备脂质体母液来制备。脂质体通过蒸发10mg/mldotap氯仿溶液来制备，用旋转蒸发仪(buchi型号r200)以300毫托压力于50℃持续30分钟。将所述样品在labconco冻干机中放置过夜来保证残留的氯仿蒸发。脂质膜经水合并通过添加1.0ml过滤的去离子蒸馏水来分散，并置于50℃以确保脂质完全悬浮。得到的脂质体直接加入鲨烯并立即用ikat25均质仪以24krpm乳化2分钟。然后，乳液在通风橱初级乳化后于搅拌板中室温静置2-3小时。初级乳液穿过具有冰浴冷却旋管的微射流(microfluidezer)m110s均质机3-5次，均质化压力为约15k–20kpsi(马萨诸塞州牛顿市的微射流公司(microfluidics))。从单元中移出20ml批料样品并存于4℃。表2描述乳液组分。表2添加脂质到乳液油相中的一个方法是添加二氯甲烷(dcm或亚甲基氯)到油相中。一旦加入，dcm可被完全蒸发。蒸发后，乳液随后穿过微流化床。或者，在脂质溶解度是问题的情况中，初级乳液可用仍存在于有机相中的dcm来制备。在该情况中，所述dcm可在二次均质化前直接从乳液中蒸发。含脂质作为稳定剂的乳液的替代方法是制备脂质膜并重水合所述膜，从而脂质形成脂质体。然后将所述脂质体加入油相中并进行如标准mf59的过程。实施例2：制备rna-颗粒复合体1.材料和方法rna合成编码α病毒复制子的质粒dna(自复制rna)用作体外合成rna的模板。各复制子含rna复制所需的遗传元件但缺少编码颗粒装配所需基因产物的序列。α病毒基因组的结构基因用编码异源蛋白(其表达由α病毒亚基因组启动子驱动)的序列替代。将所述复制子递送给真核细胞后，正义链rna翻译产生4种非结构性蛋白，它们一起复制基因组rna并转录大量编码异源蛋白的亚基因组mrna。由于缺少α病毒结构蛋白的表达，复制子不能产生感染性颗粒。噬菌体t7启动子定位于所述α病毒cdna上游以促进所述复制子rna体外合成，且位置紧邻聚(a)尾下游的丁型肝炎病毒(hdv)核酶通过其自切割活性产生校正的3’末端。实施例所用四种质粒的序列示于图7a-7b。所述hdv核酶下游的质粒dna用合适的限制性内切核酸酶线性化后，用t7或sp6噬菌体衍生dna依赖性rna聚合酶体外合成失控(run-off)转录本。按照生产商(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司(ambion))提供的说明，在终浓度7.5mm(t7rna聚合酶)或5mm(sp6rna聚合酶)的各三磷酸核苷(atp、ctp、gtp和utp)存在时于37℃进行转录2小时。转录后，用turbodna酶(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)消化模板dna。用licl沉淀所述复制子rna并在无核酸酶的水中重建。如用户手册所述，未加帽的rna通过牛痘加帽酶(vce)用scriptcapm7g加帽系统(威斯康星州麦迪逊的艾比森得(epicentre)生物技术公司)在转录后加帽。用licl沉淀转录后加帽的rna并在无核酸酶的水中重建。或者，加帽复制子可通过用6mm(用于t7rna聚合酶)或4mm(用于sp6rna聚合酶)不可逆帽结构类似物m7g(5’)ppp(5’)g(neb公司(newenglandbiolabs),马萨诸塞州贝弗利)来补充转录反应并降低三磷酸鸟苷的浓度到1.5mm(用于t7rna聚合酶)或1mm(用于sp6rna聚合酶)。然后转录物可用turbodna酶(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司(ambion))消化，之后用licl沉淀并在75％乙醇中清洗。通过测量260nm下的光密度确定rna样品的浓度。体外转录本的完整性通过变性琼脂糖凝胶电泳来确认是否存在全长构建体。rna复合从所述阳离子脂质浓度计算溶液中氮的量，例如dotap每分子有1个可质子化的氮。所述rna浓度用于计算溶液中磷酸盐的量，所用估值为每微克rna约3nmol磷酸盐。通过改变rna：脂质的量可调节n/p比。rna以一定范围的氮/磷酸盐比(n/p)复合cne。n/p比的计算通过计算每毫升乳液中可质子化氮的摩尔数来进行。为了计算磷酸盐的数量，每微克rna使用恒定3nmol磷酸盐。确定值后，将合适比例的乳液加入rna。用这些值将所述rna稀释到合适的浓度，并在轻微涡旋时直接加入等体积乳液中。该溶液能在室温静置约2小时。一旦复合后，将得到的溶液稀释到合适的浓度并在1小时内使用。凝胶电泳进行变性凝胶电泳评估rna和阳离子制剂的结合以及存在rna酶a时的稳定性。如下铸制凝胶：将2g琼脂糖(伯乐(bio-rad),加州赫尔克里斯)加入180ml水中并在微波炉中加热直至溶解，然后冷却至60℃。20ml10x变性凝胶缓冲液(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)随后加入所述琼脂糖溶液。倒出凝胶并室温放置至少45分钟。然后将所述凝胶加入凝胶槽，并加入1xmops电泳缓冲液(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)以覆盖所述凝胶数微米。rna酶保护试验通过用6.4maurna酶a/每微克rna(得克萨斯州奥斯汀的安碧公司)室温孵育30分钟来完成rna酶消化。用蛋白激酶k(德国达姆施塔特的诺瓦基(novagen)公司)55℃孵育样品10分钟来灭活rna酶。rna酶灭活后的样品用样品与25:24:1苯酚:氯仿:异戊醇的1:1混合物去复合。然后样品颠倒数次混合，然后置于离心机中12krpm离心15分钟。从有机相中移除水相并用于分析rna。上样(460ng/孔)前，所有样品用甲醛上样染料孵育，65℃变性10分钟并冷却至室温。安碧millennium标记用于估算rna构建体的分子量。在130v跑胶。根据生产商指南(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)在水中用0.1％sybr金通过室温摇晃1小时来染色凝胶。凝胶图像用伯乐chemidocxrs成像系统(加州赫尔克里斯)摄制。所有研究用克隆泰克公司(clonetech，加利福尼亚州芒廷维尤)的小鼠胸腺rna。肝素结合实验如上所述复合rna。rna/cne复合物与各种浓度的硫酸肝素(马萨诸塞州沃德希尔市阿法埃莎公司(alfaaesar，wardhill，ma))室温孵育30分钟。得到的溶液离心15-20分钟。离心管用结核菌素注射器刺穿并移除下层。然后分析溶液的rna浓度，按照生产商指导使用quant-itribogreenrna分析试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。在伯腾(biotek)synergy4(佛蒙特州威努斯基(winooski,vt))荧光酶标仪上分析样品。游离的rna值用标准曲线计算。粒度试验乳液的粒度用zetasizernanozs(英国伍斯特郡的马文仪器公司(malverninstruments,worcestershire,uk))根据生产商说明来测量。颗粒大小报道为含多分散性指数(pdi)的z-平均值(zave)。所有样品于测量前在水中稀释。此外，乳液的粒度用horibala-930粒度仪(horiba科学仪器事业部(horibascientific)，美国)来测量。样品于测量前在水中稀释。ζ电势根据生产商说明用zetasizernanozs测量，使用稀释的样品。分泌型碱性磷酸酶(seap)试验为了评估抗原生产的动力学和量，与和不与制剂一起肌肉内给予小鼠编码seap的rna复制子。8-10周龄且体重为约20g的3或5只雌性balb/c小鼠组用以所示n/p比复合有seap编码复制子rna的cne免疫。裸rna在无rna酶的1xpbs中配制。将100μl剂量给予各小鼠四头肌(每位点50μl)。注射后第1、3和6天取血液样品。收集后立即从血液中分离血清，使用前储存在-30℃。化学发光seap试验phospha-light系统(应用生物系统公司(appliedbiosystems)，马萨诸塞州贝德福德)用于分析血清。小鼠血清在1xphospha-light稀释缓冲液中1:4稀释。样品置于用铝封箔密封的水浴中并65℃热灭活30分钟。冰上冷却3分钟并平衡到室温后，将50ulphospha-light试验缓冲液加入孔并将样品室温放置5分钟。然后，加入含1:20(化学发光碱金属磷酸盐底物)的50ul反应缓冲液，并在室温孵育20分钟后测量发光。发光在bertholdcentrolb960发光计(田纳西州橡树岭(oakridge,tn))上测量，每孔1秒整合。各样品中seap的活性进行一式两份测量并显示这两次测量的均值。电穿孔电穿孔是递送质粒dna疫苗的非常有效的方法，该技术用于递送自复制rna。用异氟烷麻醉小鼠，双后腿几乎刮光以暴露肢上待处理的区域。用1/2cc胰岛素注射器将30ul剂量的疫苗注射到所述后腿的四头肌中。用dna递送系统(圣迭戈的因诺公司(inovio))电穿孔所述肌肉。仪器参数如下：60v,各在60ms的2次脉冲。将另一剂量相似地递送到第二肢，然后电穿孔。病毒复制子颗粒(vrp)为了就实现体内报告基因或抗原表达来对比rna疫苗和传统rna载体方法，我们通过perri等描述的方法使用bhk细胞生产的病毒复制子颗粒(vrp)。本系统中，抗原(或报告基因)复制子由源自委内瑞拉马脑炎病毒(veev)基因组的α病毒嵌合复制子(vcr)组成，所述基因组经工程改造以包含辛德毕斯病毒的3’末端序列(3’utr)和辛德毕斯病毒包装信号(ps)(参见perri等jvirol77:10394-10403(2003)的图2)。通过将这些复制子与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺陷性辅助rna一起共同电穿孔入幼仓鼠肾(bhk)细胞来将其包装在vrp中(参见perri等的图2)。然后收获所述vrp并用标准方法滴定，并在培养液体或其他等渗缓冲液中接种到动物内。2.水包油乳液的粒度分析制造后，分析乳液的粒度和ζ电势。表3和4总结了以n/p比4:1和10:1复合前和后获得的数据粒度和ζ电势数据。在nanozs粒度仪上测量时，所有测试制剂的乳液粒度均小于160nm。复合后，一些粒度没有显著增加，特别是4:1n/p比时。这可能是由于多个乳液滴之间的rna聚集和桥连。horriba数据一般与nanozs测量良好匹配，除了少数情况(cne02和cne32)，其中似乎有不能在nanozs上分析的更大颗粒群。除了cne02和cne32，所有cne在horiba粒度仪上测量时尺寸均小于190nm。尺寸上的低变化性表明加工方法稳健，不论所添加的阳离子脂质的数量和类型。特别理想的是平均粒度低于200nm尺寸以允许灭菌过滤。所有测试的样品通过该标准。表3：粒度数据ζ电势的可变性稍高于粒度数据(表4)。这与我们的预期一致，因为这些制剂中的许多差异是阳离子脂质浓度变化。例如，cne01、cne02和cne17分别各含0.8、1.6和1.2mg/mldotap。这些批次的ζ电势与以下预期一致：复合前具有最小ζ电势15.9mv的cne01，然后是复合前ζ电势为33.4mv的cne17，最后是ζ电势为43mv的cne02。复合后ζ电势与复合前ζ电势一般变化不大，这可能是由于乳液中电荷过量。表4：ζ电势3.rna酶稳定性试验：为了评估乳液保护免受rna酶降解的能力，开发体外试验用来筛选制剂。图1显示10:1和4:1n/p比时cne01和cne17的rna酶保护试验结果。10:1比例的cne01比4:1能更好地保护rna。cne17在10:1时显示较好保护。图2显示n/p比4:1时cne17也能保护rna。cne12和13在两种电荷比时也保护rna(与cne17类似)(图2)。图3显示与图1相似的结果，cne01在4:1n/p比时保护不佳。cne02在两种测试n/p比时针对rna酶的保护确实很好(图3和4)。cne04没有保护rna免受rna降解，但cne05能在两种测试电荷比保护rna(图5)。cne27显示很少的rna酶保护，而cne32显示稍多的保护，但总体低于前述制剂。cne35(图6)能稍稍保护rna免受rna酶降解。总体上5种不同制剂能阻止rna体外降解。4.体内seap筛选：表达分泌型碱性磷酸酶(seap)的a306复制子能用于确定给予α病毒载体后体内蛋白表达水平。每组5只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)表达seap的vrp(5x105iu)、裸露自复制rna(a306,1μg)、用电穿孔递送的自复制rna(a306+ep,分别为1和0.1μg)和用cne17、cne05和cne35以n/p比10:1配制的如前所述生成的自复制rna(1μg或0.1μga306)。第0天肌肉内免疫后第1、3和6天的血清seap水平(相对光单元,rlu)示于表5。数据用每组5只个体小鼠的算术平均效价表示。表5组剂量(μg)第1天第3天第6天vrp5x10^5iu161,42846,59435,998a30612,99235,000228,614cne1714,61554,108570,484cne170.12,50914,772157,386a306+ep12,04718,208173,176a306+ep0.11,7458,24956,927cne0511,8311,7485,171cne3511,7121,81111,005表5显示rna在cne17中配制时血清seap水平相对类似剂量的裸rna对照增加。rna在cne中配制时seap表达相对vrp对照增加，但表达的动力学非常不同。用电穿孔递送相对裸rna对照会引起seap表达增加，但这些水平相比rna用cne17配制时的seap表达水平较低。cne05和cne35降低蛋白表达水平。5.n/p比对seap表达的影响(cne17)表达分泌型碱性磷酸酶(seap)的a306复制子能用于确定给予α病毒载体后体内蛋白表达水平。每组5只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)裸露自复制rna(a306,1μg)、用cne17以n/p比6:1、7:1、8:1、10:1、12:1、13:1、14:1、16:1如前所述配制生成的自复制rna(a306，1μg)。第0天肌肉内免疫后第1、3和6天的血清seap水平(相对光单元,rlu)示于表6。数据表示为每组5只个体小鼠的算术平均效价。硫酸肝素结合相比第6天seap表达的相关性示于表7。分别指示6x、8x和10x硫酸肝素时rna从复合物中释放的百分比。表6：血清seap水平(cne17)组a306剂量(μg)第1天第3天第6天a30611,2353,2715,215cne176:116,18917,960131,321cne177:112,83640,736266,217cne178:115,73726,823316,274cne1710:118,01831,988333,184cne1712:117,77523,412295,218cne1713:119,21724,236247,262cne1714:117,31726,072279,585cne1716:1115,01417,141144,582表7：肝素结合和第6天seap表达(cne17)表6和7显示rna以n/p比10:1配制时血清seap水平相对类似剂量的裸rna对照增加。测试的其他n/p比相较10:1n/p比表现出较低蛋白表达量，但都显示比裸rna更高的响应。应强调裸rna的平均seap值波动显著，如表5和8所示例，在一个实验中表达约为35000，另一个为5000。第6天的蛋白表达水平与肝素释放良好相关。6.n/p比对seap表达的影响(cne13)表达分泌型碱性磷酸酶(seap)的a306复制子能用于确定给予α病毒载体后体内蛋白表达水平。每组5只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)裸露自复制rna(a306,1μg)、用cne13以n/p比6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1如前所述配制生成的自复制rna(1μga306)。第0天肌肉内免疫后第1、3和6天的血清seap水平(相对光单元,rlu)示于表8。数据表示为每组5只个体小鼠的算术平均效价。硫酸肝素结合相比第6天seap表达的相关性示于表9。分别指示6x、8x和10x硫酸肝素时rna从复合物中释放的百分比。表8：血清seap水平(cne13)组a306剂量(μg)第1天第3天第6天a30611,50742,405138,978cne1318:115,425169,9711,104,679cne1316:113,58468,118586,874cne1314:115,19956,314745,815cne1312:113,609212,7721,462,864cne1310:115,538200,5061,103,004cne138:116,03895,870872,715cne136:114,11623,000291,485表9：肝素结合和第6天seap表达(cne13)表8和9显示rna以所有测试n/p比配制时血清seap水平相对类似剂量的裸rna对照增加。第6天的蛋白表达与肝素释放良好相关。7.n/p比对seap表达的影响(cne01)表达分泌型碱性磷酸酶(seap)的a306复制子能用于确定给予α病毒载体后体内蛋白表达水平。每组5只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)裸露自复制rna(a306,1μg)、用cne01以n/p比4:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1如前所述配制生成的自复制rna(1μga306)。第0天肌肉内免疫后第1、3和6天的血清seap水平(相对光单元,rlu)示于表10。数据表示为每组5只个体小鼠的算术平均相对光单元(rlu)。硫酸肝素结合相比第6天seap表达的相关性示于表11。分别指示6x、8x和10x硫酸肝素时rna从复合物中释放的百分比。表10：血清seap水平(cne01)表11：肝素结合和第6天seap表达(cne01)表10和11显示rna以所有测试n/p比配制时血清seap水平相对类似剂量的裸rna对照增加。实施例3：用不同油评估蛋白表达水平用不同油但在cne17的碱制剂中制备一系列乳液，即5％油,0.5％吐温80,0.5％司盘85和1.4mg/mldotap。下表12概括各组的油变化。油的分类也列于表12。以10:1n/p比测试乳液并如上所述复合。每组5只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)表达seap的vrp(5x105iu)、裸露自复制rna(a306,1μg)、用电穿孔递送的自复制rna(a306+ep,1和0.1μg)、和用cne36,cne37,cne38和cne41如前所述配制生成的自复制rna(1μga306)。第0天肌肉内免疫接种后第1、3和6天的血清seap水平(相对光单元,rlu)示于表13。数据表示为每组5只个体小鼠的算术平均rlu。表12表13组剂量(μg)第1天第3天第6天a306+ep11,40349,969179,916cne3611,5063,28883,268cne3711,3871,1271,594cne3811,7912,22847,705cne4111,3692,11360,039vrp5x10^5iu105,82938,54656,155a30611,2126,00795,380a306+mf5911,2191,65611,667如表13所示，cne17显示本研究中最高水平的表达。所有其他乳液低于1μg剂量的裸rna。cne36产生最高新油表达，然后是cne41和cne38。直接添加入mf59的1μg剂量rna减弱响应。example4:cne17提高小鼠模型中rsv-f抗原的免疫原性1.方法鼠免疫原性研究本实验使用表达rsv表面融合糖蛋白(rsv-f)的a317复制子。8-10周龄、体重约20g的balb/c小鼠以每组10只动物进行双侧肌肉内免疫接种。所有动物在第0天和第21天于两后腿四头肌内各注射等体积(50μl/腿)的表达rsv-f的vrp(1x106iu)、裸露自复制rna(a317,1μg)和用电穿孔递送的自复制rna(10μga317+ep)，或在cne17中配制的自复制rna(0.1μg或1μga317)。第14天(2wp1)、35天(2wp2)和49天(4wp2)收集血清用于抗体分析。当需要检测t细胞应答时，在第35天或49天从每组5只小鼠中收获脾脏用于t细胞分析。小鼠t细胞功能实验：细胞内细胞因子免疫荧光实验收集来自相同免疫的balb/c小鼠的2-5个脾脏，并制备单细胞悬浮液用于培养。建立2种抗原刺激培养物和2种未刺激培养物用于各脾细胞库。抗原刺激的培养物含1x106脾细胞、rsvf肽85-93(1x10-6m)、rsvf肽249-258(1x10-6m)、rsvf肽51-66(1x10-6m)、抗cd28mab(1mcg/ml)和布雷菲德菌素a(brefeldina)(1:1000)。未刺激的培养物不含rsv肽，其他和所述刺激的培养物相同。37℃培养6小时后，加工培养物用于免疫荧光。清洗细胞，然后用荧光标记的抗cd4和抗cd8单克隆抗体(mab)染色。再次清洗细胞，然后用细胞固定/细胞通透剂(cytofix/cytoperm)固定20分钟。然后用perm洗涤缓冲液清洗该固定细胞，随后用荧光标记的ifn-g、tnf-a、il-2和il-5特异性mab染色。清洗染色细胞，然后在lsrii流式细胞仪上分析。用flowjo软件分析所得数据。分别分析cd4+8-和cd8+4-t细胞子集。在给定样品的各子集中，检测细胞因子阳性细胞％。rsvf抗原特异性t细胞％计算为抗原刺激的培养物中细胞因子阳性细胞％和未刺激的培养物中细胞因子阳性细胞％的差异。用标准方法(statisticalmethods(《统计方法》)第7版，g.w.snedecor和w.g.cochran)确定抗原特异性细胞％的95％置信界限。小鼠t细胞功能实验：分泌细胞因子实验分泌细胞因子实验的培养物与用于胞内细胞因子免疫荧光实验的相似，除了省略布雷菲德菌素a。37℃过夜培养后收集培养物上清液，并用msd公司(mesoscalediscovery)的小鼠th1/th2细胞因子试剂盒分析多种细胞因子。每种培养物中各细胞因子的量从标准曲线中确定，所述标准曲线用生产商提供的经纯化重组细胞因子产生。2.cne17提高小鼠模型中rsv-f抗原的免疫原性第14、35和49天的f-特异性血清igg效价示于表14,15和16。第35天和49天rsv血清中和效价示于表17，第49天的t细胞响应示于表18和19。表14：第14天的小鼠f特异性血清igg效价第14天(2wp1)收集血清用于抗体分析。数据表示为个体动物和每组10只个体小鼠的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表15：第35天的小鼠f特异性血清igg效价第35天(2wp2)收集血清用于抗体分析。数据表示为个体动物和每组10只个体小鼠的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表16：第49天的小鼠f特异性血清igg效价第49天(4wp2)收集血清用于抗体分析。数据表示为个体动物和每组10只个体小鼠的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表17：rsv血清中和效价第35天(2wp2)和49天(4wp2)收集血清用于抗体分析。数据表示为个体小鼠的60％空斑减少中和效价和每组10只个体小鼠的几何平均效价。若个体动物效价<40(检测界限)，则赋予其效价20。na＝无分析表18：第49天(4wp2)rsvf特异性cd4+脾t细胞的频率。显示的是净(抗原特异的)细胞因子阳性频率(％)±95％置信半区间。粗体显示的净频率表示统计上显著性>0的经刺激应答。表19：第49天(4wp2)rsvf特异性cd8+脾t细胞的频率。显示的是净(抗原特异的)细胞因子阳性频率(％)±95％置信半区间。粗体显示的净频率表示统计上显著性>0的经刺激应答。如表14-19所示，cne17制剂相对于所述裸rna对照显著提高了免疫原性，如由增加的f特异性igg效价(4wp2时增加5倍)、中和效价、和cd4及cd8t细胞应答所测得。rna电穿孔相对于所述裸rna对照提高免疫原性，但显著低于cne17递送。重要的是，cne17组引发的免疫响应比裸rna的波动小许多。例如，1μg裸露自复制rna组的第14天样品产生的抗体效价为529–5110，而1μg剂量的cne17配制的rna样品产生的抗体效价为1927–5731。此外，cne17组中的所有动物产生稳定的响应且加强良好。相反，裸rna组的中的一些动物没有显著加强。实施例5：大鼠模型中rna颗粒复合物的免疫原性1.方法rsvf三聚体亚基疫苗所述rsvf三聚体是含rsvf胞外域的重组蛋白，该rsvf胞外域缺失所述融合肽区域以阻止结合其他三聚体。如尺寸排阻色谱所观察，得到的构建体形成均匀的三聚体，且具有与电子显微镜观察到的融合后f构型一致的预期表型。所述蛋白在昆虫细胞中表达并用融合所述构建体c末端的his标记纯化，然后用常规技术进行尺寸排阻色谱。得到的蛋白样品表现出超过95％的纯度。对于f亚基疫苗的体内评价，使用ph6.3且用氯化钠调节至与150mm等渗的10mm组氨酸缓冲液将100μg/ml三聚体蛋白吸附在2mg/ml明矾上。通过2-8℃温和搅拌过夜使f亚基蛋白吸收到明矾上。棉鼠的疫苗接种和攻击雌性棉鼠(刚毛棉花鼠(sigmodonhispidis))获自哈伦实验室(harlanlaboratories)。所有实验依照诺华动物保护和使用委员会批准和进行。在第0天和第21天，动物组肌肉内免疫接种(肌内(i.m.)100μl)指定的疫苗。第一次免疫后3周和第二次免疫后2周收集血清样品。第一次免疫后4周用1x105pfursv鼻内(i.n.)攻击免疫或未免疫接种的对照动物。3％异氟烷麻醉下用精密蒸发器进行血液收集和rsv攻击。rsvf-特异性elisa通过酶联免疫吸附实验(elisa)分析个体血清样品中rsvf特异igg的存在。用溶于pbs的1°g/ml纯化rsvf(delp23-furdel-截短未切割)在4℃过夜包被elisa板(maxisorp96孔，纽恩克公司(nunc))。清洗(含0.1％吐温-20的pbs)后，在37℃用溶于pbs的superblock封闭缓冲液(赛默科技公司(thermoscientific))封闭板至少1.5小时。然后清洗所述板，加入实验稀释剂(含0.1％吐温-20和5％山羊血清的pbs)中实验或对照棉鼠的血清连续稀释物，并将板在37℃孵育2小时。清洗后，用马辣根过氧化物酶(hrp)偶联的鸡抗棉鼠igg(icl公司(immunologyconsultantslaboratory,inc)，实验稀释剂中1:5,000稀释)在37℃孵育所述板1小时。最后，清洗所述板并在各孔中加入100μltmb过氧化物酶底物溶液(kpl公司(kirkegaard&perrylaboratories,inc))。通过添加100μl1mh3po4终止反应，并用读板仪读取450nm的吸光度。对各血清样品，通过非线性回归(gp公司(graphpadprism))产生光密度(od)与血清稀释度倒数的对数曲线。效价定义为约0.5od时血清稀释度的倒数(根据来自rsv感染棉鼠的标准、合并血清归一化，效价定义为1:2500，其包括在每个板上)。微中和实验用空斑减少中和试验(prnt)检测血清样品中是否存在中和抗体。将hi血清的2倍连续稀释物(在含5％hi-fbs的pbs中)加入等体积的预先滴定达到约115pfu/25μl的rsvlong中。37℃和5％co2下孵育血清/病毒混合物2小时以发生病毒中和，然后将25μl该混合物(含约115pfu)接种到96孔板中hep-2细胞的双重孔上。37℃和5％co2下2小时后，用0.75％甲基纤维素/emem5％hi-fbs覆盖所述细胞并孵育42小时。通过用免疫染色检测合胞体形成然后自动计数来确定感染性病毒颗粒的数量。中和效价定义为相对对照(无血清)，产生每孔至少60％合胞体数量减少的血清稀释度的倒数。病毒负荷通过空斑实验检测肺中的病毒负荷。具体地说，rsv感染后5天收集肺，将一个右叶放入含25％蔗糖的2.5ml达氏修正伊氏培养基(dmem，英杰公司)并用组织匀化器破碎。来自这些样品的无细胞上清保存于-80℃。为了分析感染性病毒，澄清的肺匀浆稀释物(含5％热灭活的胎牛血清hi-fbs的pbs中)以200μl/孔的体积接种在12孔板的融合hep-2细胞单层上。周期性温和摇动(37℃,5％co2)2小时后移除接种物，用1.5ml溶于补充有5％hi-fbs、谷氨酰胺和抗体的eagle极限必需培养基(emem,龙沙公司(lonza))中的1.25％seaplaque琼脂糖(龙沙公司)覆盖细胞。孵育3-4天后，再次用1ml溶于含0.1％中性红(西格玛公司)的emem(西格玛公司)中的1.25％琼脂糖覆盖细胞。一天后在光盒协助下计数空斑。棉鼠肺病理学rsv攻击5天后收集肺，用10％中性缓冲福尔马林(nbf)通过温和鼻内灌注然后浸没固定来收集并固定各动物的4个叶。组织经常规加工以制备显微镜检验所用的苏木精和伊红染色切片。用先前发表标准[princega,等,2001]的改良来评价发现，参数如下：细支气管周炎(peribronchiolitis)、肺泡炎、支气管炎、血管周围细胞浸润和间质性肺炎。损伤按4分半定量表分级。最小(+)变化包括一或很少小灶点；轻度(++)变化由小-中等大小灶点组成；中度(+++)变化含频繁和/或中等大小灶点；和显著(++++)变化显示影响大多数/所有组织的大量到融合的灶点。2.棉鼠rsv攻击研究本实验使用表达rsv表面融合糖蛋白(rsv-f)的a317复制子。棉鼠(刚毛棉花鼠(sigmodonhispidus))以每组8只动物形式在第0天和第21天进行双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)裸露自复制rna(a317,1μg或10μg)、用cne17配制的自复制rna(a317,0.1μg或1μg)、表达rsv-f的vrp(5x106iu)、f-三聚体/明矾亚基(10μg)、或福尔马林灭活的rsv疫苗(5200fi-pfu)。在第14天(2wp1)和35天(2wp2)收集血清用于抗体分析。第49天用1x105pfursv鼻内攻击所有动物并在第54天(5dpc)收集肺用于检测病毒负荷和肺病理学。第14和35天的f-特异血清igg效价示于表20；来自所选组的8只动物在2wp2时的个体抗体效价示于表21；第14和35天的rsv血清中和效价示于表22；rsv攻击后5天的肺病毒效价示于表23；和rsv攻击后5天的肺泡炎分值示于表24。表20：棉鼠(刚毛棉花鼠)的f-特异血清igg效价疫苗剂量f-特异性iggf-特异性igg2wp12wp2裸a31710μg1981599裸a3171μg78526cne171μg4084918cne170.1μg3252512vrp5x106iu9615864f-三聚体/明矾10μg3526111893fi-rsv5200fi-pfu172074无55每组8只动物，第0天和第21天肌肉内免疫后。在第14天(2wp1)和35天(2wp2)收集血清用于抗体分析，第49天用1x105pfursv鼻内攻击所有动物。第54天(5dpc)收集肺用于检测病毒负荷和肺病理学。数据表示为每组8只个体棉鼠的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表21：2wp2时的个体抗体效价所选组的8只动物的个体抗体效价(裸rna和cne配制的rna)表22：棉鼠(刚毛棉花鼠)的rsv血清中和效价每组8只动物，第0天和第21天肌肉内免疫后。在第14天(2wp1)和35天(2wp2)收集血清用于分析。数据表示为60％空斑减少中和效价。4只棉鼠/组的2个库的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表23：rsv攻击5天后棉鼠(刚毛棉花鼠)的肺病毒效价每组8只动物，第0天和第21天肌肉内免疫后。在第14天(2wp1)和35天(2wp2)收集血清用于分析。数据表示为60％空斑减少中和效价。4只棉鼠/组的2个库的几何平均效价。若个体动物效价<25(检测界限)，则赋予其效价5。表24：rsv攻击5天后棉鼠(刚毛棉花鼠)的肺泡炎每组8只动物，第0天和第21天肌肉内免疫后。第49天用1x105pfursv鼻内攻击所有动物。第54天(5dpc)收集肺用于检测病毒负荷和肺病理学。损伤按4分半定量表分级。最小(1)变化包括一个或很少小灶点；轻度(2)变化由小-中等大小灶点组成；中度(3)变化含频繁和/或中等大小灶点；和显著(4)变化显示影响大多数/所有组织的大量到融合的灶点。本研究显示棉鼠rsv模型中复制子rna的免疫原性和保护能力。未配制的复制子rna在一次疫苗接种后诱导血清f特异性igg和rsv中和抗体，且这些响应被第二次疫苗接种加强。此模型中cne17有效，在第二次免疫接种后使1μg复制子rna的f特异性igg效价加强约9倍且中和效价加强4倍。此外，不论剂量(0.1或1μg)，cne17都降低使用裸rna时观察到的显著免疫响应变化，且所有动物响应疫苗接种。所有复制子rna疫苗提供保护免受鼻rsv攻击，使rsv攻击5天后肺病毒负荷降低超过3个数量级。cne配制的1μg复制子rna所产生免疫应答的程度和保护能力在5x106vrp引发的应答的2倍之内。实施例6：粒度对免疫原性的影响本实施例显示粒度影响cne/rna制剂的免疫原性。粒度试验和体内seap试验的操作方案如实施例2所述。鼠免疫原性研究的操作方案如实施例3所述。图8a显示体内seap试验的结果(算术平均)。图8b显示balb/c小鼠中个体动物在2wp1和2wp2时间点的总igg效价。rna与cne17复合将粒度从约220nm增加到约300nm(数据未显示)。如图8a和8b所示，随着粒度增加，seap的表达水平下降，且宿主免疫响应也降低。实施例7：评估替代性阳离子脂质对免疫原性的影响1.材料和方法制备cne用下述阳离子脂质制备一系列乳液：dlindma,dotma,doepc,dstap,dodac,和dodap。表25描述乳液组分。根据实施例1所述操作方案制备cne。根据实施例2所述操作方案制备rna/cne复合物。表25鼠免疫原性研究以10:1n/p,12:1n/p或18:1n/p比测试乳液(见表26)。如前面实施例2所述复合rna复制子和乳液。每组5-10只动物的balb/c小鼠在第0天双侧肌肉内免疫接种(50μl/腿)裸露自复制rna(a317,1μg)、rv01(15)(含40％dlindma、10％dspc、48％chol、2％pegdmg2000的脂质体中配制的1μga317)、用cne13,cne17,cmf37,cmf38,或cmf42配制的自复制rna(a317,1μg)。2.cne配制的rna提高小鼠模型中rsv-f抗原的免疫原性第14和35天balb/c小鼠组的总血清igg效价(几何均值效价)示于表26(组1-8)。cmf37(dotma)-配制的rna良好增强宿主免疫响应且igg效价与cne17(dotap)相当。cmf38(doepc)-配制的rna引起比cne17稍高的igg效价，但这种提高统计上并不显著。dstap-配制的rna没有显著提高宿主免疫响应，且低igg效价可能是由于dstap在鲨烯中的低溶解度。cne13-配制的rna引起的igg效价比脂质体(dda)配制的rna高约1.5倍。cmf43(dodac)-配制的rna诱导的总抗体效价低于cne17(表28，组7和8)。表26组1-8中每组有5只动物，且组9-12中每组有10只动物。实施例8：评估缓冲液组成对免疫原性的影响本实施例中，制备各种基于cne17但有不同缓冲液组分的乳液。表27显示缓冲液改良的乳液组成。表27体外结合试验显示降低柠檬酸盐缓冲液浓度引起rna结合更紧密(数据未显示)。鼠免疫原性研究的结果显示添加糖到cne17中不能显著影响cne17-配制的rna的免疫原性(表26，组9-12)。添加山梨醇和右旋糖观察到igg效价稍稍增加。表28概括了用不同缓冲系统制备cne17-配制的rna时鼠免疫原性研究的结果。表28*va375复制子,**va317复制子。复制子在hepes缓冲液中转录(安碧)，然后(i)licl沉淀,(ii)tris缓冲液中加帽,和(iii)licl沉淀。所有组中每组有8只动物。不同缓冲液组成也影响粒度。如图9所示，添加糖(蔗糖)降低rna/cne复合物的粒度(图9a)；添加低浓度nacl(10mm)也降低rna/cne复合物的粒度(图9a)。柠檬酸盐缓冲液不影响rna/cne复合物的粒度(图9b)。聚合物对粒度的影响示于图9c。具体地，添加0.5％普朗尼克(pleuronic)f127到rna缓冲液使rna/cne复合物的粒度减小到复合前尺寸(无rna的cne颗粒)。优选缓冲体系：280mm蔗糖,10mmnacl,和1mm柠檬酸盐；或280mm蔗糖,10mmnacl,1mm柠檬酸盐,和0.5％(w/v)普朗尼克(pluronic)f127中cne17的总抗体效价和中和抗体效价示于表28(组4和5)。实施例9：评估peg-脂质对免疫原性的影响本实施例中，用peg-脂质制备一系列乳液。表29显示这些基于peg-脂质的乳液组成。表29对于所有乳液，使用溶于dcm的10mg/mldotap母液，且所述溶剂在第一次均质化后蒸发。鼠免疫原性研究如实施例7所述进行。表30显示2wp1and4wp2时间点收集的抗体效价。显示cne13组的平均个体动物效价和几何平均效价。如表30所示，用peg-脂质制备的乳液有效诱导针对rsv-f抗原的免疫响应，但总体抗体效价相比cne17-配制的rna则水平较低。此外，增加peg-脂质的浓度引起抗体效价下降。表30*va317复制子,组1-10中每组有5只动物且组11具有每组10只动物。可根据说明书内所引用参考文献的讲述最充分理解本说明书。说明书内的实施方式提供本发明实施方式的说明，并且不会对本发明范围构成限制。技术人员容易认识到本发明也包括许多其他实施方式。本公开引用的所有发表物和专利通过引用全文纳入本文。通过引用纳入的材料与本说明书冲突或不一致时，本说明书取代任何此类材料。本文引用任何参考文献并不视作承认这些文献是本发明的在先技术。本领域技术人员应了解或能够确定仅采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在下列实施方式的范围内。序列表<110>诺华股份有限公司（novartisag）<120>阳离子水包油乳液<130>085448-0094<140>pct/us2011/043108<141>2011-07-06<150>61/361,892<151>2010-07-06<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>12463<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/note="人工序列描述:合成多核苷酸"<400>1ataggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacg60ttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttg120aggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatc180tggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaa240gtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagat300gtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaagg360aaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctcgccgccgtcatgagcgacc420ctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggc480aagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaag540ccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgttta600agaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaa660cggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgt720ccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcga780ccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcact840tacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacg900tcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgcta960cgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagaggg1020tctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatac1080tggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgta1140tagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccg1200tagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaa1260ggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggc1320acaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcg1380atttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaa1440caagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgagg1500acgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagt1560tgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatg1620tagacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataa1680aggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcagg1740ctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtga1800taacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtgg1860tgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccacca1920ttgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggag1980gagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcg2040aatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctag2100ggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaa2160cacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcag2220gcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaaga2280aagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatg2340ccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtata2400ttgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagac2460ctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcc2520tgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgcc2580gttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaa2640cgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagc2700aggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattaca2760aaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatg2820ccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacg2880tcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatgga2940taaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaag3000cagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttcc3060agaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggca3120tagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcact3180cagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccg3240gtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccc3300cgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacc3360cacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgc3420gcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttag3480tcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagg3540gcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggt3600tgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatg3660tgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatc3720agcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatc3780tgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaa3840gcatcattggtgctatagcgcggcagttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcct3900cacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattgggtacgatcgcaaggcccgtacgc3960acaatccttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacg4020aagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaag4080gagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgc4140tgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgac4200tggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagttt4260cggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtca4320acgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccggga4380acaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatg4440cagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtgg4500ctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctg4560atgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagca4620caagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaa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