双特异性磷酸酶9在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及dusp9在治疗脂肪肝中的功能及应用，以及以dusp9作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。

背景技术：

随着现代人生活方式以及环境的改变，肥胖、脂质异常及糖尿病等代谢性疾病已经成为全球性的重大疾病，严重威胁公众的健康及生活质量。非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,nafld)为一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪堆积及变性为病理特征的代谢性疾病，其发病因素包括肥胖、ⅱ型糖尿病、血脂异常及代谢综合征等^[1-3]。nafld是最为常见的慢性肝脏疾病，根据全球大范围统计，nafld的发病率大约为25％，其中10-20％的患者最终发展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,nash)，而约三分之一的nash患者逐步演化为肝硬化，甚至肝癌^[4][5]。此外，伴随着nafld及nash出现的同时，机体也会产生一系列的代谢紊乱综合征，如血脂代谢异常，糖尿病等。然而，目前尚无有效的药物及治疗手段攻克这一临床难题，鉴于此，寻找制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物的新靶点，就显得尤为重要。

双特异性磷酸酶9(dualspecificityphosphatase9，dusp9)属于酪氨酸蛋白磷酸酶家族，最初由muda等于1997年发现，可通过去磷酸化或钝化分裂原活化蛋白激酶(mapk)进而抑制mapk信号通路的活性^[6]。关于dusp9的文献报道也多集中在其对mapk信号通路的调控机制中，dusp9在许多肿瘤如肝癌、胃癌、肾癌等中作为一个抑癌基因发挥作用^[7-11]。但dusp9在脂肪肝中的作用目前暂未报道。

参考文献

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技术实现要素：

解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种dusp9基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因dusp9的新用途，进而把dusp9基因应用于脂肪肝的治疗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明第一方面，提供双特异性磷酸酶9在制备保护肝脏的药物中的应用。

优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。

本发明第二方面，提供双特异性磷酸酶9在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。

本发明涉及的双特异性磷酸酶9在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是双特异性磷酸酶9。

本发明涉及的双特异性磷酸酶9在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是双特异性磷酸酶9作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高双特异性磷酸酶9表达量的试剂。

优选地，提高双特异性磷酸酶9表达量的试剂，给药方式为直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。

所述的双特异性磷酸酶9或dusp9，包括基因或蛋白。所述的dusp9基因在对象体内经转录翻译为双特异性磷酸酶9蛋白产物。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明通过试验确定了双特异性磷酸酶9的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：

本发明以人正常肝脏l02细胞系及dusp9过表达l02细胞系为研究对象，通过棕榈酸酯(pa)及油酸(oa)联合刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型研究dusp9基因的功能，发现dusp9过表达能够显著改善肝脏细胞内脂质堆积，说明dusp9能够保护肝脏细胞免受脂肪样变性。由此说明dusp9在肝脏脂质代谢性疾病中起着保护作用，过表达dusp9基因治疗肝脏脂质代谢性疾病具有潜在的治疗及应用价值。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现dusp9基因的新功能，即dusp9基因具有能够保护脂肪肝疾病的作用。

(2)基于dusp9在保护脂肪肝疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物。由于dusp9是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

附图说明

图1.过表达dusp9稳定细胞株鉴定

图2.过表达dusp9抑制肝细胞脂肪堆积

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本发明中的试验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

实验用细胞及培养

人肝细胞系l02购自中国科学院细胞库(目录号gnhu6)，人胚肾hek293t细胞购自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)。上述细胞采用dmem高糖培养基(含10％fbs，1％青霉素-链霉素)于5％co2的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％dmso的fbs冻存。

dusp9过表达质粒构建

1)pcr扩增dusp9基因，引物为：

正向：5’-tcgggtttaaacggatccatggagggtctgggccgctc-3’；

反向：5’-gggccctctagactcgagctaggtgggggccagctcgaa-3’；

2)pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用dna凝胶回收试剂盒(天根)进行dna片段的回收；

3)将所得dna产物和限制性内切核酸酶、bufferorgreenbuffer、ddh2o混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用axyprep^tmpcrclean-upkit(axygen)回收酶切产物；

4)使用pcr一步定向克隆试剂盒(novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；

5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于37℃培养箱，过夜培养；

6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落pcr阳性克隆；

7)将pcr鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5mllb(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；

8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒dna小提试剂盒)；

9)提取后的质粒可直接用于构建慢病毒包装。

慢病毒载体构建和包装

1)在200μlireducedserummedium中加入转染试剂(peimax，或lipofectamine2000)，轻轻混匀，简短离心；(dnaμg：转染试剂μl＝1:0.5～1:5)

2)在200μlireducedserummedium中加入目的基因质粒1μg、包装质粒(慢病毒常用pmd2.g(addgene，12259)0.5μg和pspax2(addgene，12260)0.75μg)，轻轻混匀，简短离心；

3)将1)和2)体系轻轻混匀，简短离心，室温孵育20min；

4)将混合体系滴加到6孔板中，轻轻混匀。

5)转染6h后，换新鲜培养基；

6)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；

7)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。

westernblot分析

1)制胶

根据目的蛋白大小选择需要的分离胶浓度，一般8％-10％的分离胶可满足大部分实验需求。

2)蛋白提取

细胞用适量ripa(50mmtris-hclph7.4,150mmnacl，1％tritonx-100ornp-40，1％sodiumdeoxycholate，0.1％sds，1mmedta，使用前加蛋白酶或磷酸酶抑制剂)冰上裂解10-30min，超声会提高蛋白提取效率；4℃，12000rpm离心10min，上清即为总蛋白；采用bcaproteinassaykit进行蛋白定量，取30-50μg总蛋白进行westernblot分析。

3)上样及电泳

保证上样量及上样体积一致，恒压电泳，上层胶采用80-90v，下层胶采用100v。

4)转膜

配制转膜液，提前预冷；pvdf膜使用前用甲醇浸泡1-2min；转膜，胶在负极侧，膜在正极侧，海绵、滤纸提前浸泡。(注意事项：胶要平铺均匀，不可拉伸；转膜过程中保证胶泡在缓冲液中；胶与膜之间不能有气泡。)

5)封闭

5％脱脂奶粉(intbst)于震荡摇床室温封闭1h。

6)一抗孵育

4℃孵育过夜。

7)二抗孵育(抗兔二抗来源，购自北京博奥龙免疫技术有限公司，抗兔二抗货号为bf03008/bf03008x)

一抗孵育后膜用tbst洗3遍，每次5min，加一定比例二抗(intbst)室温孵育1h。(根据抗体的特异性选择是否用5％脱脂奶粉(intbst)稀释二抗)

8)显影

9)利用bio-radchemidocxrs+凝胶成像系统检测目的条带。

油红o染色

1)细胞固定：细胞用pbs洗涤2-3次，去除死细胞，加入300μl4％多聚甲醛固定20min；

2)加入1×pbs洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s，弃去异丙醇，晾干；

3)每孔加入500μl油红o染色1min；

4)加入pbs洗涤2-3次，去除背景的红色，在显微镜下观察，拍照。

【实施例1】dusp9过表达对肝细胞脂肪堆积的影响

构建过表达dusp9的慢病毒表达载体，转染hek-293t细胞，包装慢病毒，感染l02细胞构建过表达dusp9的稳定细胞株，同时过表达空载体作为对照(con)，通过westernblot检测稳定细胞株是否表达dusp9，检测结果如图1所示，过表达dusp9的细胞中dusp9高表达，这表明dusp9在稳定细胞株中表达成功；表达成功的l02细胞种板，细胞贴壁后加入棕榈酸酯(pa，终浓度0.4mm)及油酸(oa，终浓度0.8mm)刺激，同时设置加药对照组(加入同等量的bsa)，16h后进行油红o染色。油红o染色结果如图2所示，bsa处理细胞时，con组和dusp9过表达组细胞均无明显着色，而当加入pa+oa刺激后，con组和dusp9过表达组细胞均有明显着色，但与con组相比，dusp9过表达组细胞被油红o染色的细胞数目及着色程度显著减弱。

上述结果表明dusp9过表达能够抑制pa及oa刺激导致肝细胞脂质沉积，dusp9在肝脏脂肪变性的病理过程中起着保护作用，以dusp9作为靶点可能为脂肪性肝损伤这类疾病提供新的治疗思路。

综上所述，dusp9过表达体外能够显著抑制肝脏脂肪堆积，而且dusp9通过抑制mapk信号通路实现对肝脏脂肪变性的保护作用，以dusp9为靶点可能为临床治疗肝脏脂肪代谢性疾病提供新的思路和策略。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>双特异性磷酸酶9在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcgggtttaaacggatccatggagggtctgggccgctc38

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gggccctctagactcgagctaggtgggggccagctcgaa39