本发明涉及疫苗生产
技术领域：
，具体而言，涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法。
背景技术：
：禽流感(avianinfluenza，ai)是由正粘病毒科a型流感病毒引起的一种禽类病毒性疾病，被国际兽医局(oie)确定为类烈性传染病。鸡流感首次报道于1878年(意大利)。1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒的核蛋白，为区别于鸡新城疫，又称真性鸡流感或欧洲鸡流感病毒，实际上就是禽流感病毒(aiv)，其所引起的疾病称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。该病毒广泛分布于世界各地，高致病力毒株可引起70％以上的死亡率；禽流感的每一次爆发，都会给养禽业带来巨大的经济损失，现已成为危害全球养殖业的第一大疫病。1997年的香港禽流感事件造成了18人感染，6人死亡。截止到2008年底，共有15个国家393人感染aiv，其中247人死亡。说明aiv有向人类蔓延的趋势，严重威胁公共卫生安全和人类健康，引起世界范围的高度重视，迫切需求切实有效的禽流感疫苗出现。为防止禽流感发生，我国及其他一些国家，采取了给家禽广泛接种灭活疫苗的防制措施。疫苗免疫是预防禽流感疫情的重要措施和有效途径。高致病性禽流感主要由h5和h7亚型引起。除少数病例外，人禽流感主要由h5n1亚型病毒感染所致。为有效控制高致病性禽流感的发生，我国于2005年实施了强制免疫政策，当年就免疫家禽近69亿羽。我国是世界上的禽类养殖量最大的国家，也是高致病性禽流感的爆发区。今年下半年国家农业部对于禽流感疫苗的免疫做出了新的部署，将h7亚型疫苗纳入强制免疫疫苗的范畴。这就进一步提高了对禽流感疫苗的需求，而本领域目前的重组禽流感病毒灭活疫苗生产工艺还有诸多需要改善的地方。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括：1).驯化mdck细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化h5亚型重组禽流感病毒或h7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的mdck细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮mdck细胞，接种于1l～7l的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个细胞/ml时接入步骤1)中驯化好的病毒进行病毒培养；所述终级反应器为3000l～6000l的生物反应器；3).当cpe达到75％以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；4).将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。本发明规范了禽流感疫苗的生产规范，能够流程化地大量、安全、高效、低成本的生产禽流感疫苗，应用mdck细胞培养流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，而且培养的病毒免疫原性更为稳定。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例中提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统结构示意图。图中：1-连续流离心机；2-中空纤维微滤系统；3-膜包超滤浓缩系统。具体实施方式本发明涉及一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括：1).驯化mdck细胞使其适应全悬浮培养环境；驯化h5亚型重组禽流感病毒或h7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的mdck细胞培养；2).取经摇瓶培养好的悬浮mdck细胞，接种于1l～7l的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个细胞/ml时接入步骤1)中驯化好的病毒进行病毒培养；所述终级反应器为3000l～6000l的生物反应器；3).当cpe达到75％以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；4).将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。其中，上述工艺可用于h5亚型或h7亚型的禽流感疫苗的制备，或者h5+h7亚型的二价灭活疫苗的制备。在一些实施方式中，在步骤2)中，所述逐步放大培养直至终级反应器的过程中，当细胞密度达到6.0×106.0～9.0×106.0个细胞/ml时转入下一级生物反应器；优选的，每级生物反应器的容积相差3～7倍；更优选为5倍。在一些实施方式中，所述h5亚型重组禽流感病毒为re-8株，所述h7亚型重组禽流感病毒为h7-re1株。一、在一些实施方式中，在步骤1)中，所述驯化mdck细胞使其适应全悬浮培养环境的方法包括：mdck细胞用胎牛血清含量为8％的dmem/f12培养基传代培养3次；用胎牛血清含量为5％的dmem/f12培养基传代培养5次；用胎牛血清含量为2％的dmem/f12培养基传代培养5次；用dmem/f12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；用dmem/f12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；用低血清培养基传代培养5次；消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/l进行换液，待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约4.8×105-5.2×105个细胞/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；收集细胞，然后采用低血清培养基与无血清培养基的混合液培养，并逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的mdck细胞。本发明制得的无血清悬浮培养的mdck细胞，培养后，曲线特征为近“s”型曲线，细胞倍增时间20～22小时，性能优异。本发明中低血清培养基和无血清培养基均购自甘肃健顺生物科技有限公司。f12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和dmem以1：1结合，称为dmem/f12培养基，为市售产品。本发明提供的mdck悬浮细胞的制备方法，通过大量实验逐渐摸索得到，先通过逐步降低血清含量制得低血清贴壁培养的细胞株，再经过逐步增加培养转速，细胞逐渐失去黏附瓶壁的依赖，同时也协调使用胎牛血清转变为新生牛血清，然后再配合逐渐提升无血清培养基的含量进行驯化摇床培养，制得无血清悬浮培养的mdck细胞。该方法简便，易于工厂化生产。在低血清培养基培养过程中，少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，继续扩增适应培养。然后先以较低的转速进行培养，为了细胞更好的适应摇床培养，进一步地，以转速为20-30r/min进行摇床培养时的细胞密度为0.8×106-1.2×106cells/ml。由于细胞之间也会存在依赖性以及信息的传导，为了使得细胞更好的适应摇床培养，细胞密度也要适当。进一步地，逐渐提高转速为每次提高转速20-30r/min。通过逐渐提高转速，细胞逐渐失去黏附培养基壁的依赖性。为了更好的使得细胞性能稳定，进一步地，每次转速适应培养3-5代。进一步地，最终转速提高到80r/min，细胞完全失去黏附瓶壁的能力。转速提高到80r/min后，再传代5次以上培养，得到性能稳定的低血清悬浮培养的细胞株。一般传代5-6次。mdck细胞的无血清驯化，原因如下：培养基中的血清不利于禽流感病毒的增殖，培养病毒工艺需要换液；获得可在低血清条件下培养的细胞，倍增时间长。低血清悬浮培养的细胞株转变为无血清培养基培养，也需要细胞进一步的逐渐适应，进一步地，逐步提高无血清培养基的含量具体为：首次是低血清培养基与无血清培养基以4:1混合的培养液，然后低血清培养基与无血清培养基依次按照2:1、1:2、0:1进行配比。通过逐步提升无血清培养基的占比进行逐步驯化培养，至得到完全无血清悬浮培养的mdck细胞。由于细胞之间也会存在依赖性以及信息的传导，为了使得细胞更好的适应摇床培养，细胞密度也要适当。进一步地，添加无血清培养基后，细胞密度调整至1.8×106-2.2×106cells/ml进行摇床培养。进一步地，无血清培养基进行摇床培养的转速为80r/min。进一步地，添加无血清培养基后，每次培养基转变适应培养8代以上，一般为8-10代，得到所述无血清悬浮培养的mdck细胞。此后，不再离心换液，保留原培养液，补入新的培养基，进行稀释传代即可。本发明人经过多次试验，均能制备得到无血清悬浮培养的mdck细胞，因此，所属
技术领域：
的技术人员可以重复本发明提供的技术方案，并能够解决申请所要解决的技术问题，达到该技术方案的效果。制得的无血清悬浮培养的mdck细胞，以1.5×106cells/ml的密度接种，72小时达到峰值1.75×107cells/ml左右，曲线特征为近“s”型曲线，此后细胞进入衰退期，细胞密度开始下降。细胞倍增时间20～22小时。可见，本发明培养得到的无血清悬浮培养的mdck细胞性能优异。进一步地，所述无血清悬浮培养的mdck细胞还包括冻存的步骤。进一步地，所述冻存采用的冻存液为dmso：蔗糖：无血清培养基以质量比为1:2:7混合而成。现有的冻存液为dmso：fbs：无血清培养基以质量比为1:1:8混合而成，冻存液配方改变后，即本发明提供的冻存液冻存时对细胞的损伤小，细胞恢复快，在复苏后第2代即可恢复正常的比生长率，并且复苏时细胞仍能保持较高活率，复苏活力在90％以上。二、在一些实施方式中，在步骤1)中，所述驯化h5亚型重组禽流感病毒或h7亚型的重组禽流感病毒种毒的方法包括：101).将h5亚型或h7亚型的重组禽流感鸡胚种毒接种于mdck单层细胞培养，接种量为0.1％-3％，所述重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥107.5eid50，所述mdck单层细胞采用含有tpck-胰酶的dmem培养基培养，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1∶512时收获培养物；102).收获的培养物按照步骤101)接种，以此重复培养，培养至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥107.5eid50，得到驯化的重组禽流感亚型病毒；本发明人发现，重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒直接接种于悬浮细胞培养效果不佳，经过摸索，先将重组禽流感亚型病毒鸡胚种毒接种于mdck单层细胞驯化培养，至重组禽流感亚型病毒增殖速度稳定，病毒含量≥107.5eid50，得到驯化的重组禽流感亚型病毒；以驯化后的重组禽流感亚型病毒接种于悬浮mdck细胞，能有效的增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性，得到的悬浮毒ha≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥108.0eid50，每1ml病毒含量≥108.0tcid50。进一步地，步骤101)中，以mdck细胞贴壁的面积25cm2计，所述mdck单层细胞的量为5.0×106～7.0×106。进一步地，步骤101)中，所述mdck单层细胞通过以下方法制备：取生长70-75h的mdck细胞，胰酶消化，用含8％-12％胎牛血清的dmem培养液吹打分散细胞，得到细胞液；以mdck细胞贴壁的面积25cm2计，接种细胞为5.0×105～7.0×105个，放入co2培养箱中培养，co2的含量为5％±1％，培养温度为37±1℃，培养70-75h，得到所述mdck单层细胞。优选地，步骤101)中，以mdck细胞贴壁的面积25cm2计，添加的含有tpck-胰酶的dmem培养基的体积为5ml；所述含有tpck-胰酶的dmem培养基中，tpck-胰酶的浓度为1～5μg/ml。试验发现，添加tpck-胰酶能有效的增加病毒的增殖速度和效价。进一步地，步骤102)中，接种的次数为11次以上，优选为11-12次。经过11次以上的接种驯化，使得重组禽流感病毒h5亚型增殖性能与效价稳定。三、在一些实施方式中，在步骤2)中，在所述终级反应器中培养细胞时，控制ph＝7.0±0.2；在稳定ph时需要确定细胞培养基中的主要酸性物质，其方法包括：201).培养开始前，测定所述细胞培养基的ph值，记为a值；202).在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的ph值，记为b值；203).摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的ph值，记为c值；204).比较a值、b值和c值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：如果c值-b值＞0.2，且a值-c值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；如果c值-b值＞0.2，且a值-c值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质；若c值-b值≤0.2，且a值-c值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。本发明所述方法通过ph值测定和前后ph值的比较即可快速判定细胞培养基中主要酸性物质的种类，与单次测量培养基ph值的方法相比，其能够较准确地辨别主要酸性物质的三种类型，1、二氧化碳；2、乳酸；3、二氧化碳和乳酸。继而，能够为后续有针对性地脱除或中和酸性物质提供准确的应对措施，提高脱除或中和的效率和性价比。优选的，所述方法还包括205).根据步骤204)的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的ph值：当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳；当所述细胞培养基中主要酸性物质为乳酸时，向所述生物反应器中添加碱性物质，中和所述乳酸；当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，之后添加碱性物质，中和所述乳酸。本发明所述方法还包括调节ph值的步骤，其中，所述ph值调节步骤根据培养基中主要酸性物质的不同而选择通入压缩空气和/或添加碱性物质，从而有针对性地减少酸性废物在培养基中积累，有利于细胞的生长和代谢。优选的，所述压缩空气从所述细胞培养基的底层通入；优选地，所述压缩空气还从细胞培养基的表层通入；本发明所述方法优选地以通入压缩空气的方法脱除培养基中的二氧化碳，其中压缩空气的通入，不但能够是二氧化碳从液相的培养基中转移到气相的压缩空气中，同时，代谢废物氨也能够随二氧化碳一起脱离液相加入气相，因此，本发明所述方法能够同时脱除两种代谢废物。另外，与传统添加碱性物质的调节方法相比，本发明所述方法不用产生负产物，有利于提高细胞培养产物的品质。本发明所述方法还进一步限定所述压缩空气的通入方式，其中，优选地，所述压缩空气从培养基的底部通入，该压缩空气通入方式可以延长空气在培养基中的流动路径，增加二氧化碳和氨的转移量；更优选地，本发明所述方法还在液相表层通入压缩空气，可避免底层压缩空气在流动过程中溶解在培养基中，增加底层压缩空气的溢出。更优选地，从底层通入的压缩空气和/或从表层通入的压缩空气的压力为0.015～0.02mpa；最优选地，所述表层持续通入压缩空气，所述底层根据步骤204)的分析结果启动或停止通入压缩空气。本发明所述方法优选地以通入压缩空气的方法脱除培养基中的二氧化碳，其中压缩空气的通入，不但能够是二氧化碳从液相的培养基中转移到气相的压缩空气中，同时，代谢废物氨也能够随二氧化碳一起脱离液相加入气相，因此，本发明所述方法能够同时脱除两种代谢废物。另外，与传统添加碱性物质的调节方法相比，本发明所述方法不用产生负产物，有利于提高细胞培养产物的品质。本发明所述方法还进一步限定所述压缩空气的通入方式，其中，优选地，所述压缩空气从培养基的底部通入，该压缩空气通入方式可以延长空气在培养基中的流动路径，增加二氧化碳和氨的转移量；更优选地，本发明所述方法还在液相表层通入压缩空气，可避免底层压缩空气在流动过程中溶解在培养基中，增加底层压缩空气的溢出。优选的，所述方法在通入压缩空气和/或添加碱性物质的同时，重复所述步骤202)～204)，直至c值-b值≤0.2和/或a值-c值≤0.2。本发明所述方法通过重复所述步骤202)～204)实现对酸性物质的实时监控，从而可以准确地判定ph值调节的终点，避免调节力度过大或过低。在一些具体的实施方式中，为将生物反应器的气压维持在固定值从而增加所述生物反应器培养细胞的安全性，所述方法还包括以下步骤：206)、对所述生物反应器的气压进行监测并及时排除气体从而将所述生物反应器的气压维持在固定值；优选地，所述监测为自动化监测；更优选地，所述自动化监测为实时监测；优选地，所述气体通过排气阀排出，更优选地，所述排气阀为自动排气阀；最优选地，所述自动排气阀的开度大小可调节；优选地，所述生物反应器的固定气压值为0.005～0.010mpa。优选的，为避免排出气体的湿度过大造成空气滤芯堵塞，本发明所述方法还包括在排出气体之前对气体进行冷凝的步骤。优选的，为避免废弃污染环境以及带来安全隐患，本发明所述方法还包括对排出的气体进行废气处理的步骤。优选的，所述生物反应器为大型生物反应器，优选地，所述大型生物反应器的体积为3000～6000l。在一些具体的实施方式中，所述步骤201)中的ph值通过ph计或ph试纸的方式加以测定，优选地，通过ph计的方式加以测定；所述步骤202)中的ph值通过ph计或ph试纸的方式加以测定，优选地，通过ph计的方式加以测定；所述步骤203)中的ph值通过ph计或ph试纸的方式加以测定，优选地，通过ph计的方式加以测定。在一些具体的实施方式中，所述细胞为植物细胞或动物细胞；在一些具体的实施方式中，优选地，所述细胞为动物细胞；在一些具体的实施方式中，更优选地，所述动物细胞为用于生产抗原或病毒的细胞。四、在一些实施方式中，在步骤3)中，所述纯化浓缩的方法具体包括：预处理的重组禽流感病毒经离心，去除大颗粒物质和细胞碎片，得到清液；所述清液使用中空纤维微滤系统处理，得到透过液；所述透过液使用膜包超滤浓缩系统处理，收集循环液，浓缩，即得。本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩方法，预处理的重组禽流感病毒经高速离心去除剩下的细胞碎片和大颗粒物质，中空纤维微滤系统纯化澄清去除小颗粒蛋白，然后经膜包超滤浓缩系统进行浓缩，得到纯化浓缩的重组禽流感病毒。整个过程简单易行，并有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，病毒中杂蛋白含量去除90％以上；在浓缩后病毒保持较高的效价。所用的中空纤维微滤系统和膜包超滤浓缩系统均采用切向流过滤，温和低剪切力，减少对病毒的损伤，保持病毒颗粒完整性良好。进一步地，所述预处理为：低温静置沉淀，然后抽取上清液。此过程可以去除大部分的细胞碎片。优选地，所述离心采用离心机进行。优选地，所述离心机为连续流离心机。连续流离心机是样品液在离心过程中连续导入，沉淀留在离心仓内，上清液不断排出的一种适于大规模制备的离心技术。进一步地，所述离心机的转速为10000-15000转/分。如在不同的实施例中，离心机的转速可以为10000转/分、11000转/分、12000转/分、13000转/分、14000转/分、15000转/分等等。离心过程中取样对浊度进行监测，当离心机在5000转/分时取样测得浊度300-500ntu之间；当离心机转速在10000转/分时离心效果在200-350ntu之间，还是存在一些风险；当把离心机转速调整到15000转/分时离心效果也就是浊度可以达到70-90ntu，完全符合离心纯化要求，保证了离心的效果。优选地，所述中空纤维微滤系统所用的中空纤维柱膜孔径为0.45-1.0μm。如在不同的实施例中，中空纤维柱膜孔径可以为0.45μm、0.50μm、0.55μm、0.60μm、0.65μm、0.70μm、0.75μm、0.80μm、0.90μm、0.95μm、1.0μm等等。经试验发现，进一步地，所述中空纤维微滤系统中空纤维膜柱数为5-8支。中空纤维膜柱的个数太少，小颗粒蛋白去除的效果差，而经过5-8支中空纤维膜柱处理后，小颗粒蛋白去除效果佳；中空纤维膜柱的个数太多，如9支即以上，小颗粒蛋白去除的效果差异不大，但是处理效率低，病毒损失大且成本增高。进一步地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包膜孔径为300-750kd。优选地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包膜孔径为500-700kd，更优选为600-700kd。如在不同的实施例中，膜包膜孔径可以为500kd、550kd、600kd、650kd、700kd等等。进一步地，所述膜包超滤浓缩系统中，膜包数量为10-18块。如在不同的实施例中，膜包数量可以为10块、12块、14块、16块、18块等等。本发明还提供了一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，包括依次连接的连续流离心机、罐a、中空纤维微滤系统、罐b、膜包超滤浓缩系统；其中，罐a与中空纤维微滤系统之间循环连接，罐b与膜包超滤浓缩系统之间循环连接。本发明提供的一种重组禽流感病毒的纯化浓缩系统，纯化浓缩全程为管道化，安全可靠，更好满足密闭无菌要求，工艺简单，重复性好，易于生产工艺放大。在一些实施方式中，所述离心具体包括：301).取所述离心后的细胞源病毒抗原液，对所述细胞源病毒抗原液进行浊度定量检测，记为a值；302).如果a值≤90ntu，则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果合格；若a值＞90ntu，则所述细胞源病毒抗原液的分离纯化效果不合格，继续离心操作，并检测a值，直至a值≤90ntu。所述方法能够相对而言较为准确地对病毒抗原的分离效果进行评估，满足疫苗生产需要，具有快速、简单、实时、性价比高的优点。为减少工作人员的工作量以及人为操作的误差，在一些具体的实施方式中，所述浊度通过浊度计进行自动检测。五、在一些实施方式中，在步骤4)中，所述油乳剂疫苗包括油相和水相，所述油相和所述水相按重量比为1～2:1混合乳化，其中，所述油相包括以下重量份原料：白油93～95份、亲油性表面活性剂5～7份和硬脂酸铝0～0.5份；所述水相包括疫苗抗原水溶液和亲水性表面活性剂，所述疫苗抗原水溶液与所述亲水性表面活性剂的重量比为95～96：4～5。与常规的油乳剂疫苗相比，本发明所述油乳剂疫苗极大地降低硬脂酸铝的用量，甚至省略硬脂酸铝，同时，本发明所述方法还将水相中疫苗抗原水溶液的用量降低。由此得到的油乳剂疫苗的黏度降低、不易分层、疫苗的稳定性高，疫苗的免疫效价高，减少疫苗注射后的副作用，而疫苗抗原水溶液用量的下降可以降低疫苗制备成本。在一些具体的实施方式中，本发明所述油相和所述水相的重量比为1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2.0:1；优选地，本发明所述油相和所述水相的重量比为1.5:1。在一些具体的实施方式中，所述白油的重量份为93份、93.5份、94份、94.5份或95份；优选地，所述白油的重量份数为94份。在一些具体的实施方式中，所述亲油性表面活性剂的重量份为5份、5.5份、6份、6.5份或7份；优选地，所述亲油性表面活性剂的重量份为6份。在一些具体的实施方式中，所述疫苗抗原水溶液的体积份数为95份、95.5份或96份；优选地，所述疫苗抗原水溶液的重量份数为96份。在一些具体的实施方式中，所述亲水性表面活性剂的重量份数为4份、4.5份或5份；优选地，所述亲水性表面活性剂的重量份数为4份。在一些具体的实施方式中，所述亲油性表面活性剂选自司盘60、司盘65、司盘80、司盘83、司盘85、卵磷脂、豆磷脂、单硬脂酸甘油酯或单油酸甘油酯中的至少一种；优选地，所述亲油性表面活性为司盘80。在一些具体的实施方式中，所述亲水性表面活性剂选自吐温20、吐温80或曲拉通；优选地，所述亲水性表面活性剂为吐温80。在一些具体的实施方式中，所述抗原选自禽流感病毒抗原、口蹄疫病毒抗原、新城疫病毒抗原、支气管炎病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原和法式囊病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述抗原为禽流感病毒抗原；更优选地，所述禽流感病毒抗原为细胞源禽流感病毒抗原。在一些具体的实施方式中，所述疫苗为o/w剂型或w/o剂型疫苗。在一些具体的实施方式中，所述疫苗为o/w剂型疫苗，所述o/w剂型疫苗的制备方法如下所示：411)分别按比例配置所述疫苗的油相和水相；412)将油相放入乳化装置中开始搅拌，同时缓慢加入水相，转速为1500～2000r/min，搅拌时间为7～15min；413)搅拌结束后，乳化10～20min，其中，乳化时的剪切速度为4500～5500r/min。在一些具体的实施方式中，所述步骤412)中的转速为1500r/min，1600r/min、1700r/min、1800r/min、1900r/min或2000r/min；所述搅拌时间为7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min；优选地，所述步骤412)中的转速为1800r/min，所述搅拌时间为10min。在一些具体的实施方式中，所述步骤413)的乳化时间为10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min；所述剪切速度为4000r/min、4100r/min、4200r/min、4300r/min、4400r/min、4500r/min、4600r/min、4700r/min、4800r/min、4900r/min或5000r/min；优选地，所述步骤413)的乳化时间为15min，所述剪切速度为5000r/min。硬脂酸铝影响油乳剂的稳定性，本发明所述油乳剂疫苗还对病毒抗原的类型、油相和水相的体积比、各原料的配比以及具体乳化方法进行优化，使得所述油乳剂疫苗在降低、甚至不使用硬脂酸铝的同时，仍然具有好的稳定性。本发明还涉及前述疫苗的破乳方法。在步骤4)中，在进行所述成品质量检验时，需要将一部分待检油乳剂疫苗破乳以检测疫苗质量；所述破乳的方法包括：401).取权利要求1～8任一项所述的疫苗，置于-15～-25℃下，冷冻40～56h；402).冷冻结束后，取出所述疫苗，置于室温下融化；403).将融化后的疫苗置于-15～-25℃下，继续冷冻18～30h；404).冷冻结束后，取出所述疫苗，置于室温下融化，之后离心得到破乳成功后的水相。与常规的水浴法或者丙酮沉淀法相比，本发明所述方法操作简单、在不使用化学试剂的情况下就能够成功地对前述疫苗进行破乳，有效地从前述疫苗中析出水相，析出水相的量足够使用一些微量方法对其进行检测，并且，本发明所述方法特别适合油包水型细胞源禽流感病毒疫苗。在一些具体的实施方式中，步骤401)所述冷冻的温度为-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或-25℃；冷冻时间为40h、42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h、56h或58好；优选地，步骤(1)所述冷冻的温度-20℃，冷冻时间为48h。在一些具体的实施方式中，步骤403)所述冷冻的温度为-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或-25℃；冷冻时间为18h、20h、22h、24h、26h、28h或30h；优选地，步骤(3)所述冷冻的温度-20℃，冷冻时间为24h。在一些具体的实施方式中，步骤404)所述离心的离心力为3000～4000g，离心时间为10～20min。在一些具体的实施方式中，步骤404)所述离心的离心力为3000g、3100g、3200g、3300g、3400g、3500g、3600g、3700g、3800g、3900g或4000g；所述离心时间为10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min；优选地，步骤404)所述离心的离心力为3500g，离心时间为15min。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1mdck细胞的驯化与冻存一种mdck悬浮细胞的制备方法，步骤如下：贴壁培养型mdck细胞由西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心(简写gsacc)从atcc引进，引进时间：2011年2月，atcc编号：ccl-34，代次：p56，保存号：58860056。在gsacc扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为:gsacc2b0000090。用含10％的fbs的dmem/f12培养液复苏mdck细胞，生长致密后传代。挑选生长良好的细胞，逐步驯化培养，具体如下：用胎牛血清含量为8％的dmem/f12培养基传代培养3次；用胎牛血清含量为5％的dmem/f12培养基传代培养5次；用胎牛血清含量为2％的dmem/f12培养基传代培养5次；用dmem/f12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；用dmem/f12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，用低血清培养基传代培养5次；消化、离心，得到的细胞以细胞密度为1.2×106cells/ml、转速为30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/l进行换液；待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约5.2×105cells/ml，并逐步提高摇床转速，先提高转速30r/min，再提高转速20r/min，每次转速适应培养3-5代，最终转速提高到80r/min；转速提高到80r/min共传代6次，得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株，冷冻保藏；复苏低血清培养的细胞，稳定培养4代后，挑选生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为4:1混合的培养液培养，适应培养5代。挑选生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为2:1混合的培养液培养，适应培养5代；挑选生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用低血清培养基与无血清培养基按体积比为1:2混合的培养液培养，适应培养5代；挑选p120代生长良好的细胞，离心1000r/min5min，弃原培养液，调整细胞密度为2.2×106cells/ml，用无血清培养基培养，适应培养8代得到生长稳定的无血清悬浮培养的mdck细胞。此后，不再离心换液，保留原培养液，补入新的培养基，进行稀释传代即可。制得的无血清悬浮培养的mdck细胞，以1.5×106cells/ml的密度接种，72小时达到峰值1.75×107cells/ml，曲线特征为近“s”型曲线，此后细胞进入衰退期，细胞密度开始下降。细胞倍增时间21小时。将上述方法制得的无血清悬浮培养的mdck细胞进行冻存的方法包括：组1：采用的冻存液为：dmso：fbs：无血清培养基以质量比为1:1:8混合而成。组2：采用的冻存液为：dmso：蔗糖：无血清培养基以质量比为1:2:7混合而成。经多次培养，测定发现，冻存液配方改变后，即组2提供的冻存液冻存时对细胞的损伤小，细胞恢复快，在复苏后第2代即可恢复正常的比生长率，并且复苏时细胞仍能保持较高活率，复苏活力在90％-95％。组1冻存复苏活力在70％-75％。实施例2h5亚型重组禽流感病毒以及h7亚型的重组禽流感病毒种毒的驯化方法重组禽流感亚型病毒种毒接种于mdck单层细胞培养的驯化，步骤如下：1.mdck细胞制备：取生长72hmdck细胞，以0.25％edta-胰酶消化，25cm2单层细胞胰酶使用量为0.5ml，(若为75cm2单层细胞，胰酶使用量为1.5ml，以此类推)，37℃作用3min。待90％左右的细胞圆缩，用dmem培养液(含10％胎牛血清)吹打分散细胞，细胞计数。依据计数结果传代，25cm2单层接种细胞为5.0×105～7.0×105个，75cm2单层接种细胞为1.5×106～2.1×106个，以此类推。置37℃、co2培养箱(co2浓度为5％)中培养。生长72h后，细胞计数，25cm2单层细胞数为5.0×106～7.0×106，75cm2单层细胞数为1.5×107～2.1×107个，以此类推。2.选取重组禽流感病毒h5亚型re-8株、h7亚型h7-re1株种毒，种毒标准为ha不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥107.5eid50。生长72hmdck细胞以pbs清洗2次，加入适宜体积维持液(含1～5μg/mltpck-胰酶的dmem培养基)，25cm2单层细胞维持液体积为5ml，75cm2单层细胞维持液体积为15ml，以此类推。以0.1％～3％接毒量接种加入维持液的mdck细胞，密封瓶口置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(cpe)达到80％以上，ha效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。3.测定培养物ha，病毒含量(tcid50、eid50)，选取ha≥1∶512、每1ml病毒含量≥107.0tcid50，每0.1ml病毒含量≥107.0eid50的培养物作为新一代细胞毒。4.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72hmdck细胞，加入维持液，选取步骤3的新一代细胞毒以感染复数moi10-3～10-4接种生长良好的mdck单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(cpe)达到80％以上，ha效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。5.测定培养物ha，病毒含量(tcid50、eid50)，选取ha≥1∶512、每1ml病毒含量≥107.5tcid50，每0.1ml病毒含量≥107.5eid50的培养物作为二代细胞毒。6.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72hmdck细胞，加入维持液，选取步骤5的二代细胞毒以感染复数moi10-3～10-5接种生长良好的mdck单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(cpe)达到80％以上，ha效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。7.测定培养物ha病毒含量(tcid50、eid50),选取ha≥1∶512、每1ml病毒含量≥107.5tcid50，每0.1ml病毒含量≥108.0eid50的培养物作为三代细胞毒。8.选取步骤1制备的细胞，以步骤2的方法处理72hmdck细胞，加入维持液，选取步骤7的三代细胞毒以感染复数moi10-3～10-6接种生长良好的mdck单层细胞进行病毒培养。置37℃中培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变率(cpe)达到80％以上，ha效价不低于1∶512时收获培养物。-70℃以下保存。9.测定培养物ha，病毒含量(tcid50、eid50)，选取ha≥1∶512、每1ml病毒含量≥108.0tcid50，每0.1ml病毒含量≥108.0eid50的培养物作为四代细胞毒。10.按照上述方法传代至12代，重组禽流感病毒h5亚型re-8株、h7亚型h7-re1株在mdck细胞上的生长情况如表1和表2所示。表1re-8株测毒结果表2h7-re1株测毒结果不同代hatcid50eid50v11:512107.67107.5v21:512107.67107.83v31:512108.0108.17v41:512108.33108.17v51:1024108.67108.5v61:1024108.5108.37v71:1024108.33108.17v81:1024108.33108.0v91:1024108.17108.0v101:1024108.33108.37v111:1024108.33108.37v121:1024108.33108.37从表1和表2可以看出，重组禽流感病毒h5亚型re-8株、h7-re1株在贴壁mdck细胞上，经过三代以上的驯化，即可达到得到的病毒的性能温度，并且增加种毒的侵染以及增殖能力。实施例3mdck细胞培养以及病毒液的制备悬浮mdck细胞种毒制备：s1.悬浮细胞制备按常规方法从液氮中复苏实施例1中冻存的悬浮mdck细胞，用吸管将细胞液加入到500ml三角摇瓶中，加入ph为7.2±0.2的过滤除菌的无血清细胞培养液至100ml。将摇瓶置于co2摇床内，37℃，80～100转/分进行培养扩繁。s2.反应器放大培养取经摇瓶培养的悬浮mdck细胞，以1.0×106.0～2.0×106.0个/ml的细胞密度接种到5l反应器培养，转速80～100转/分、温度37℃、溶氧30％～60％、ph7.2±0.2。待细胞密度≥6.0×106.0个/ml时，流加细胞培养液，使细胞起始密度调整为1.0×106.0～2.0×106.0个/ml，调整反应器控制参数(转速80～100转/分、温度37℃、溶氧30％～60％、ph7.2±0.2)继续培养。待细胞密度达到6.0×106.0～9.0×106.0个/ml时，转至下一级适宜的反应器培养，使细胞接种密度为1.0×106.0～2.0×106.0个/ml。以此方法可逐级放大(5倍放大)，终极反应器可放大至6000l反应器。s3.病毒接种将细胞密度达到8.0×106.0～1.0×107.0个/ml，转入灭菌并预孵病毒培养液的反应器中，调整细胞密度为3.0×106.0～4.0×106.0个/ml，搅拌均匀后将实施例2驯化后的重组禽流感h5亚型re-8株或h7亚型h7-re1株生产用细胞毒按moi感染复数10-3～10-4接种于生长良好的悬浮mdck细胞，细胞活力90％以上，同时加入浓缩的tpck-胰酶，使其终浓度为1μg/ml～5μg/ml。调整反应器培养参数转速80～100转/分、ph值7.4±0.2、溶氧30％～60％、温度36±0.5℃进行病毒培养。s4.在培养细胞和接毒过程中，维持ph7.2±0.2时，需要确定细胞培养基的主要酸性物质并调节培养基ph；该方法包括：(1)、在培养开始前，测定细胞培养基的基础ph值，记为a值。(2)、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的ph值，记为b值。(3)、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的ph值，记为c值。(4)、比较a值、b值和c值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：如果c值－b值＞0.2，且a值－c值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。如果c值－b值＞0.2，且a值－c值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质。若c值－b值≤0.2，且a值－c值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。(5)、根据步骤(4)的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的ph值：当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳。当所述细胞培养基中主要酸性物质为乳酸时，向所述生物反应器中添加1mol/lnaoh溶液以中和所述乳酸。当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，添加1mol/lnaoh溶液以中和所述乳酸。其中，所述压缩空气的通入方式如下所示：从细胞培养基的底层和表层分别通入压缩空气，所述压缩空气的压力均为0.015mpa，所述压缩空气均经过两级空气过滤器净化。(6)、在通入压缩空气和/或添加碱性物质的同时，重复所述步骤(2)～(4)，直至c值－b值≤0.2和/或a值－c值≤0.2。(7)、对生物反应器内的气压实施自动化实时监测，当气压值大于0.01mpa时，通过自动排气阀将废气排出，从而将反应器的气压维持在0.005～0.01mpa；所述废气在排出前经过冷凝装置冷凝，防止废弃湿度过大造成滤芯堵塞，所述废气在排出后经废气处理装置处理以保证排出气体的生物安全性。对比例3-1参照实施例3-s4所述方法测定细胞培养基的ph值并加以调整，区别仅在于，对比例3-1仅测定培养前所述培养的ph值，记为a值，以及培养过程中所述培养基的ph值，记为b值；如果a值－b值＞0.2则添加1mol/l的naoh溶液调节ph值，直至a值－b值≤0.2。对比例3-2参照实施例3-s4所述方法测定细胞培养基的ph值并加以调整，区别仅在于，对比例3-2在通入压缩空气时仅从反应器的底部通入。s5.测定细胞培养基的ph值，之后加入6000l大小生物反应器(参数设定：温度设定37±0.5℃、ph设定7.0±0.2、do设定40～60％和适宜的搅拌速度)，培养悬浮型mdck细胞，并在细胞密度达到要求后接入h5或h7亚型禽流感病毒种子液进行培养以制备h5或h7亚型禽流感疫苗。在培养过程中，取细胞培养基(共100次)。参照实施例3-s4所述方法测定其ph值并确定所述培养基中的主要酸性物质类型。同时，通过高效液相色谱检测培养基中的乳酸含量，采用二氧化碳电极法测定培养基中的二氧化碳含量，对上述方法的检测结果进行验证。其中，本实施实施例所述方法对二氧化碳检测的准确性达92％，对乳酸含量检测的准确性达94％，整体检测准确率(即，在同一份样品中，对二氧化碳和乳酸的检测结果均正确)为88％。根据上述检测结果可知，本发明实施例所述方法在判断培养基中主要酸性物质的类型时具有较高的准确性，符合规模化生产要求。使用6000l大小的发酵罐培养悬浮型mdck细胞，并接种h5或h7亚型禽流感病毒种子液以制备h5或h7亚型禽流感病毒疫苗。在培养过程中，分别采用实施例3-s4和对比例3-1、3-2所述方法检测并调整细胞培养基的ph值。在培养结束后，以h5亚型疫苗为例，分别统计采用实施例3-s4和对比例3-1、3-2所述方法后，疫苗的产量、品质、naoh溶液(1mol/l)的用量以及产生成本。具体检测结果如表3所示。表3不同ph检测、调整方法对h5亚型抗原生产的影响实施例3-s4对比例3-1对比例3-2病毒抗原产量5542l5627l5438l病毒效价ha＝1:1024ha＝1:256ha＝1:512naoh溶液用量126l285l173l生产成本68元/l272元/l136元/ls6.病毒液的收获接毒培养72～96小时，当细胞病变达75％以上时收获病毒液并取样。测定病毒液ha、tcid50、eid50。re-8株及h7-re1株悬浮毒ha≥1:1024，每0.1ml病毒含量≥108.0eid50，每1ml病毒含量≥108.0tcid50。s7.悬浮种毒也可作为生产用种毒，代次应控制在3代以内。具体测定数据如表4所示。表4不同代生产的悬浮种毒上述得到的1代悬浮种毒进行了免疫原性测定，具体方法为：用3～4周龄spf鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗0.3ml，取条件相同的spf鸡5只，不接种作为对照，同等条件下隔离饲养。接种后21日，各滴鼻接种禽流感病毒强毒株病毒液0.1ml(含100ld50)，连续观察10日。对照鸡应全部死亡，免疫鸡应全部健活；攻毒后第5日，采集每只免疫鸡泄殖腔棉拭子，进行病毒分离。免疫鸡病毒分离应全部为阴性。表5攻击hpiv的排毒情况结果表明，细胞源禽流感疫苗与鸡胚源禽流感疫苗具有相同的免疫原性。实施例4病毒液检验对实施例3收获的病毒液进行质量检验。1、无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均应无细菌、霉菌生长。2、ha效价按现行《中国兽药典》附录进行检验，re-8株病毒液ha效价不低于1∶512、h7-re1株病毒液ha效价不低于1∶256时方可用于制苗。实施例5病毒液浓缩对实施例4通过检验的病毒液进行浓缩：包括以下步骤：1)对待处理重组禽流感病毒(细胞源)h7n9h7-re1株(或h5n1re-8株)低温静置沉淀，然后抽取上清液，得到预处理的重组禽流感病毒，测定，ha效价为29；eid50为108.0/0.1ml；tcid50为108.1/1ml。2)使用连续流离心机1处理病毒，去除病毒中大颗粒物质①用连续流离心机1，设定转速为15000转/分。在连续离心的同时，通过浊度计检测离心后液体的浊度，如果浊度大于70ntu，则将离心后的上清液再次进行离心处理，直至离心后的液体浊度小于70ntu。②收集离心后的清液，弃去重液，清液进入图1中罐a。③送样品检测ha、eid50、tcid50和内毒素。在连续流离心机1离心后ha、eid50、tcid50和内毒素指标均没有发生改变，无损失。3)中空纤维微滤系统2处理收集的清液①用于禽流感病毒纯化用中空纤维柱膜孔径是0.9μm，用于禽流感病毒纯化中空纤维系统中空纤维膜柱数是6支。②收集透过液，进入图1中罐b。③送样品检测ha、eid50、tcid50和内毒素。经过中空纤维系统再次澄清后的ha效价为28，eid50为107.6/0.1ml，病毒回收率94％，tcid50为107.5/1ml，病毒回收率92％，内毒素<5eu。4)使用膜包超滤浓缩系统3处理收集的透过液①用于禽流感病毒浓缩用膜包膜孔径是300kd，用于禽流感病毒浓缩用膜包超滤系统中膜包数量是18块。②收集循环液，弃去透过液对病毒进行浓缩，最终浓缩液在图1中罐b。③送样品检测ha、eid50、tcid50和内毒素。经过膜包超滤系统浓缩后的病毒ha效价为210.5，eid50为108.0/0.1ml，病毒回收率92％，tcid50为108.0/1ml，内毒素<5eu。另外，测定蛋白含量，预处理的重组禽流感病毒中杂蛋白含量为101.3mg/ml，纯化浓缩后杂蛋白含量为4.96mg/ml，杂蛋白去除率为95.10％。通过本发明提供的纯化浓缩方法，设备间采用全管道化连接，能够安全、快速、稳定、有效的将重组禽流感病毒进行纯化浓缩。在每个环节均会送样品检测ha、eid50、tcid50和内毒素等相关指标，在料液处理量大幅提升的同时，病毒回收率也非常稳定。对比例5-1同实施例5，区别仅在于，离心机的转速为5000r/min，当上清液的浊度小500ntu时，停止离心。对比例5-2同实施例5，区别仅在于，离心机的转速为10000r/min，当上清液的浊度小200ntu时，停止离心。表6不同方法的纯化结果离心液浊度(ntu)杂蛋白去除率实施例56487％对比例5-147346％对比例5-229757％综上所述，本发明通过对重组禽流感病毒进行高速离心、中空纤维微滤系统2二次澄清和膜包超滤系统浓缩，合理搭配各装置达到对重组禽流感病毒纯化浓缩的目的，有效降低病毒中的杂质含量和杂蛋白含量，病毒中杂蛋白含量可以去除90％以上，并在浓缩后使病毒保持较高的效价，内毒素含量差异变化不明显，符合规定。实施例6疫苗的灭活与半成品检验1.灭活将浓实施例5缩处理的病毒液抽滤至灭活罐中，加入终浓度0.05％的甲醛溶液，边加边搅拌，37℃灭活24小时(以容器内温度达到37℃开始计时)，不断搅拌。灭活完毕后病毒液泵入储备罐，取样并迅速降温至2～8℃，保存备用。2.半成品检验2.1、无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。2.2、ha效价浓缩后灭活前分别测定病毒液的ha效价，re-8株病毒液ha效价不低于1∶512、h7-re1株病毒液ha效价不低于1∶256时方可用于制苗。2.3、灭活检验下列方法任择其一。2.3.1、鸡胚法用10日龄spf鸡胚20枚，将灭活的re-8株、h7-re1株病毒液各尿囊腔接种10枚，每胚0.1ml。36～37℃孵育72小时，2～8℃冷却，收获鸡胚尿囊液，测定ha效价，应为阴性；并盲传1代，测定ha效价，若为阴性，则灭活完全。2.3.2、细胞法灭活的re-8株、h7-re1株病毒液按dmem维持液(附注1)的1％接种至生长良好的mdck单层细胞，培养72～96小时，收获培养液，测定ha效价，应为阴性；再盲传2代，测定ha效价，若均为阴性，则灭活完全。2.4、保存2～8℃保存，应不超过2个月。实施例7-1疫苗的制备按以下方法制备油乳剂疫苗：制备油相：称取白油94份、司盘806份和硬脂酸铝0.5份，先在白油中加入司盘80，搅拌均匀后加入硬脂酸铝，加热使其充分混合，之后降温至20℃；制备水相：取h5型禽流感病毒抗原(感染h5型禽流感病毒的细胞)水溶液，与吐温80混合均匀，其中所述h5型禽流感病毒抗原水溶液与吐温80的重量比为96:4，之后，将所述水相的温度调整为20摄氏度；制备油包水型疫苗：将油相放入乳化装置中开始搅拌，同时缓慢加入水相，转速为1800r/min，搅拌时间为10min，油相和水相的重量比为3:2，搅拌结束后，启动乳化泵开始乳化，时间持续15min，乳化时的剪切速度为5000r/min，乳化结束后即得油包水型疫苗制剂。实施例7-2破乳方法一种破乳方法，所述破乳方法包括以下步骤：吸取实施例1所述疫苗12ml放入15ml离心管中，置于-20℃冰箱，冷冻48h后取出，室温下融化后，再置于-20℃下冷冻24小时，室温下融化，以3500g离心15分钟，得到的水相即为破乳产物。对比例7-1参照实施例7所述方法制备油乳剂疫苗，区别仅在于，其中所述油相中白油、司盘80和硬脂酸铝的质量比为93:5:2，所述水相中h5型禽流感病毒抗原水溶液与吐温80的重量比为97:3。对比例7-2一种对实施例7所述油乳剂疫苗进行破乳的方法，所述方法为水浴法，具体步骤如下所示：吸取12ml疫苗放入15ml离心管中，置50±5℃水浴90分钟，然后在4℃条件下，以10000g离心10分钟，观察破乳情况。对比例7-3一种对实施例7所述油乳剂疫苗进行破乳的方法，所述方法为丙酮沉淀方法，具体步骤如下所示：疫苗摇匀后，取100μl疫苗，按1:9加入900μl丙酮，立即混匀，室温放置10分钟，4℃,以10000g离心15分钟，弃上清，再加入400μl丙酮洗沉淀两次，室温干燥约20分钟，加50μl去离子水复溶，观察破乳情况。检测实施例7-1和对比例7-1不同批次下油乳剂疫苗的黏度、剂型、稳定性和抗体效价，其具体检测结果如表7所示。表7油乳剂疫苗的黏度、剂型、稳定性和抗体效价比较比较实施例7-2与对比例7-2、7-3的破乳效果，具体检测结果如表8所示。表8不同方法的破乳效果比较结果方法破乳情况实施例7-2冻融法析出水相1.5ml对比例7-2水浴法未出现水相对比例7-3丙酮沉淀法未出现水相实施例8成品检验1性状外观乳白色或微黄色乳状液。剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水中，除第一滴外应呈油滴状不扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以转速3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。4安全检验用3～4周龄的spf鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2.0ml，连续观察14日，应全部健活，且不出现因注射疫苗引起的局部或全身不良反应。5效力检验下列方法任择其一。5.1血清学方法用3～4周龄spf鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗0.3ml，取条件相同的spf鸡5只，不接种作为对照，同等条件下隔离饲养。接种后21日，分别采血，分离血清，分别用国家禽流感参考实验室提供的h5亚型禽流感病毒re-8株抗原和h7亚型禽流感病毒h7-re1株抗原测定hi抗体效价。对照鸡hi抗体效价均应不高于1：4，免疫鸡re-8株、h7-re1株hi抗体效价几何平均值(gmt)均应不低于1∶64。5.2免疫攻毒法5.2.1用3～4周龄spf鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗0.3ml，取条件相同的spf鸡5只，不接种作为对照，同等条件下隔离饲养。接种后21日，各滴鼻接种a型禽流感病毒ck/gz/4/13(h5n1)株病毒液0.1ml(含100ld50)，连续观察10日，对照鸡应全部死亡，免疫鸡应全部健活。攻毒后第5日，采集每只免疫鸡的喉头和泄殖腔棉拭子，进行病毒分离(附注4)。免疫鸡病毒分离应均为阴性，并盲传1代，若均为阴性，最终判断为阴性。5.2.2用3～4周龄spf鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗0.3ml，取条件相同的spf鸡5只，不接种作为对照，同等条件下隔离饲养。接种后21日，各滴鼻接种a型禽流感病毒ck/gx/sd098/17(h7n9)株病毒液0.1ml(含100ld50)，连续观察10日，对照鸡应全部死亡，免疫鸡应全部健活。攻毒后第5日，采集每只免疫鸡的喉头和泄殖腔棉拭子，进行病毒分离(附注4)。免疫鸡病毒分离应均为阴性，并盲传1代，若均为阴性，最终判断为阴性。6甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。用实施例1～8所述方法制得三批成品疫苗进行检验，结果如下：最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12