本发明涉及一种用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物及其应用，属于中药
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：食管癌是常见的恶性肿瘤之一，我国每年约有25万新诊断的食管癌病例，占全世界食管癌病例数的一半，五年生存率不到15％。手术和化疗是常用的治疗方法，但临床上对化疗有效反应率只有19％-40％，肿瘤耐药成为治疗食管癌的主要障碍。食管癌属于中医“噎膈”病的范畴，从食管“传化物而不藏”，“以通降为用”的功能特点来讲，食管癌病变当归与中医“腑”病，但六腑中又无“食管”一说，因其与胃功能相似和解剖上的联系，故从理论上来讲应归于“胃”腑病变。食管癌病机主要与气血、津液和阴阳失调几个方面有关。中医学认为，肿瘤的产生是由于各种原因导致机体气血失常，壅滞局部所致，虽然没有明确地指出壅滞局部的气血怎样化生肿瘤，但是由此可知，局部气血紊乱是导致肿瘤发生的重要条件。局部气血紊乱和局部细胞微生环境发生改变非常相似，局部气血紊乱所产生的痰、瘀、毒等所营造的状态与肿瘤微环境相近。中医药直接作用于肿瘤细胞可能非常弱，而更强于改善肿瘤细胞与微环境的关系，中医药临床上也多是配合化疗应用。因此，利用中医药增强化疗药物的敏感性，降低化疗药物的耐药性，对于提高临床防治水平和能力，提高食管癌病患者的生活质量，减少食管癌患者死亡率具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，能够增强食管癌对化疗药物的敏感性，降低化疗药物的耐药性。本发明还提供了一种上述中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用。为了实现以上目的，本发明的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物所采用的技术方案是：一种用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，主要由以下重量份数的组分组成：丹参18～22份、郁金13～17份、浙贝母8～12份、陈皮8～12份、半夏8～12份、甘草3～7份。本发明的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物中，丹参，苦而微寒，具有活血祛瘀，通经止痛，凉血消痈之功效，为君药，《神农本草经》称它：“心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破症除瘕，止烦满，益气”。郁金，辛苦而寒，《本草求真》说它：“其气先上行而微下达，凡有宿血凝积，及有恶血不堪之物，先于上处而行其气；若使其邪其气其痰其血在于膈上而难消者，须审宜温宜凉，同于他味，兼为调治之”。在方中能助君药活血化瘀通经止痛，且可行气解郁。浙贝母，苦寒，具有清热化痰，开郁散结之效，《本草正》说它“最降痰气，善开郁结，止疼痛，消胀满”，在方中和郁金一起为臣药。半夏，辛，温，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，《别录》认为它能够：“消心腹胸膈痰热满结，咳嗽上气，心下急痛坚痞，时气呕逆，消痈肿”。陈皮，味苦、辛，性温，具有理气健脾，燥湿化痰之能。《本草纲目》说它可：“疗呕哕反胃嘈杂，时吐清水”；陈皮、半夏在方中既可以帮助臣药化痰散结，有具行气祛湿，杜绝生痰之源，共为佐药。甘草，味甘，性平，可补脾益气，清热解毒，调和诸药，在方中为使药。六种药物相互配合，共凑活血化瘀、化痰散结之功效，契合食管癌病机。食管癌发病初期病机以本虚邪盛为主，中晚期则以正气虚弱为主，正气虚弱贯穿着整个食管癌发病的全程。中医学对食管癌的病因学认识主要有忧思郁怒、饮食酒伤、正气虚弱、他病转化等。食管癌发病初期病机以本虚邪盛为主，中晚期则以正气虚弱为主，正气虚弱贯穿着整个食管癌发病的全程。本发明的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，具有一定的抗癌作用，特别是能够增强食管癌对化疗药物的敏感性，提高对食管癌细胞的抑制率和杀伤力，改变食管癌细胞对化疗药物的耐药性，提高临床治疗的效果，减少食管癌患者的死亡率。本发明的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，组方小，费用低；疗效确切；可制成纯中药制剂；安全便捷；符合中医药组方理论。优选的，浙贝母、陈皮和半夏的质量比为1:1:1。本发明的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用所采用的技术方案为：一种上述的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：取配方量的各组分用水进行煎煮，去除药渣，制得煎出液。本发明的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面进行应用时，工艺简单，可以制成任何常规的内服制剂，如本发明的中药制剂可以为粉剂、颗粒剂或口服液等，具有费用低、安全便捷的特点，便于进行推广应用。取配方量的各组分可以混合后进行煎煮，也可以分开进行煎煮。优选的，将各组分进行煎煮前，先用水进行浸泡。浸泡时，每1g中药采用的水的体积为15～25mL。为了使中药原料中的有效成分的高效溶出，浸泡前还可以将中药原料进行粉碎。所述浸泡的时间为30～150min。优选的，所述煎煮是先武火煮沸，然后转文火煮20～40min。煎煮时，每1g中药原料采用的水的体积为15～25mL。上述中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，还包括在煎出液中加入乙醇混匀，然后固液分离，再将固液分离所得液体进行浓缩或干燥。在煎出液中加入乙醇会产生沉淀。固液分离可以采用离心或过滤的方法。优选的，在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为70～80％，然后再进行固液分离。优选的，在煎出液中加入乙醇混匀后，不停摇匀不短于24h后，离心分离出上清。优选的，将固液分离所得液体中的乙醇去除，然后再进行浓缩或干燥。如可以采用蒸馏的方法将乙醇去除。所述干燥为冷冻干燥或低温负压干燥。上述中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感方面的应用还包括将固液分离所得液体进行干燥后，将干燥所得到的固体进行粉碎。上述中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用还包括在干燥所得固体或浓缩所得的液体中加入常规辅料，制成所需的剂型。附图说明图1为肿瘤生长的大小随时间变化趋势图；图2为不同组移植肿瘤的平均重量柱状图，其中：M为模型组；S为顺铂组；Z为中药组；S+Z为顺铂联合中药组。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。具体实施方式中所采用的中药均购自河南中医学院第三附属医院，并经河南中医药大学第三附属医院鉴定专家鉴定为真品。实施例1本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参22份、郁金17份、浙贝母12份、陈皮12份、半夏12份、甘草7份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水20mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡1h，武火煮沸转文火煎煮30min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为75％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后浓缩至干，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实施例2本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参18份、郁金13份、浙贝母8份、陈皮8份、半夏8份、甘草3份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水20mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡1h，武火煮沸转文火煎煮30min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为75％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。采用本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，制得的中药提取物粉末能占到药材原料总重量的4.5～6％。实施例3本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参20份、郁金15份、浙贝母10份、陈皮10份、半夏10份、甘草5份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水30mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡1h，武火煮沸转文火煎煮30min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为75％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实施例4本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参21份、郁金16份、浙贝母9份、陈皮9份、半夏9份、甘草6份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水30mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡1h，武火煮沸转文火煎煮30min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为75％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实施例5本实施例为实施例1的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水30mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡1h，武火煮沸转文火煎煮30min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为75％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实验例6本实施例为实施例1的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：取配方量的各组分分别进行粉碎，然后按照每1g中药中加水30mL的比例，分别在各粉碎后的中药组分中加水浸泡1h，武火煮沸后转文火煎煮30min，滤除药渣，得到各中药组分煎煮后的滤液，混合，得到煎出液。实施例7本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参19份、郁金14份、浙贝母11份、陈皮11份、半夏9份、甘草4份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水25mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡30min，武火煮沸转文火煎煮40min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为80％，摇匀24h，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实施例8本实施例的用于增强食管癌对化疗药物敏感性的中药组合物，由以下重量份数的组分组成：丹参20份、郁金15份、浙贝母10份、陈皮9份、半夏11份、甘草6份。本实施例的中药组合物在增强食管癌对化疗药物敏感性方面的应用，包括以下步骤：1)取配方量的各组分混合后进行粉碎，然后按照每1g中药中加水15mL的比例，在粉碎后的中药中加水浸泡150min，武火煮沸转文火煎煮20min，滤除药渣，得到煎出液；2)在煎出液中加入乙醇至乙醇的体积分数为70％，摇匀30h，，然后离心，取上清液进行旋转蒸馏去除乙醇，然后冷冻干燥，得到固体，粉碎，得到中药提取物粉末。实验例本实验例以治疗食管癌的常用化疗药物顺铂为例，对中药组合增强食管癌对顺铂敏感性进行测试。(一)材料1、细胞株：人食管癌细胞株Eca9706购于中国医学科学院细胞中心。2、动物：BALB/C(nu/nu)雌性裸小鼠，5周龄，体重15～18g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。3、主要试剂：RPMIMedium1640培养基(Solarbio公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio公司)，胎牛血清(Gemini公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(Solarbio公司)，细胞凋亡/周期检测试剂盒(BD生物公司)。4、实验仪器：CO2培养箱(德国Eppendorf公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，荧光倒置相差显微镜(德国Laica公司)，ELx-800型酶标仪(BIO-TEK公司)，离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，游标卡尺(上海量具刃具厂)。(二)体外实验1、中药和顺铂对人食管癌株EC9706细胞的抑制作用。测试过程中，中药组用药为实施例2中制得的中药提取物粉末溶于培养基制，中药+顺铂组用药为实施例2中制得的中药提取物粉末和顺铂溶于培养基。如100μg/mL中药+1μg/mL顺铂组是指中药提取物粉末和顺铂加入培养基后形成的混合药液，中药提取物的浓度为100μg/mL，顺铂的浓度为1μg/mL，然后加入EC9706细胞(下同)。MTT检测：取对数生长期食管癌EC9706细胞种板。设置四个实验分组：正常对照组，正常对照+1μg/mL顺铂组，中药组，中药+1μg/mL顺铂组。其中中药组和中药+1μg/mL顺铂组分别设置200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL四个中药浓度梯度。24h后取出，取原有培养基，按实验分组进行加药，每组三个复孔，孵育48h，MTT法用酶标仪酶标仪在570/630nm处测各孔吸光值(OD值)。计算各用药组的平均抑制率，细胞抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。实验重复3次，检测结果见表1。表1不同实验组对EC9706细胞的抑制作用(n＝3)评价联合用药药效：应用金正均法，按照以下公式计算联合用药指数q值:q＝EA+B/(EA+EB-EA×EB)，其中EA代表A药单独给药时的效应，EB代表B药单独给药时的效应，EA+B代表A、B两药合并给药后的效应。如果实际测得的合并效应等于期望值，即q＝1为相加，q>1为协同，q<1为拮抗。通过表1中的数据，根据金氏公式计算各组联合用药指数q值，其中EA代表顺铂单独给药时的抑制率，EB代表中药单独给药时的抑制率，EA+B代表顺铂和中药合并给药后的抑制率。200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml中药与1μg/ml顺铂联合作用时，q值分别为1.19、1.27、1.26、1.06。可以得知，200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml中药提取物与顺铂联合应用时都有协同增效作用，也就是说中药提高了食管癌细胞对顺铂的敏感性，其中100μg/ml与顺铂协同增效作用最为显著，我们选择100μg/ml药物提取物作为后续实验。2、同浓度的中药与不同浓度顺铂联用对EC9706细胞的凋亡和周期影响。实验方法：取对数生长期细胞，设置6个加药组分别为：空白对照组、0.5μg/ml顺铂、1μg/ml顺铂组、100μg/ml中药组、100μg/ml中药+0.5μg/ml顺铂组、100μg/ml中药+1μg/ml顺铂组。加药孵育48h后，收集细胞，严格按凋亡、周期试剂盒说明处理细胞，1h内上流式细胞仪进行检测，记录结果。见表2。表2同浓度的含药血清联合不同浓度顺铂对EC9706细胞的凋亡影响(n＝5)注：△：与空白对照组比较；▲：与100μg/ml中药组比较；◇：与同浓度的顺铂组比较由表2中数据可知：作用48h后，与对空白照组相比较，除50μg/mL中药组外(P＞0.05)，其它各组细胞凋亡率均升高，有统计学意义(P<0.05)；与同浓度的顺铂组比较，加入中药的顺铂组凋亡率都明显升高(P<0.05)，具有统计学意义。周期结果显示：与空白对照组比较，顺铂组和中药与顺铂联用组均将细胞阻止在S期；与同浓度顺铂比较，1μg/mL顺铂加入中药后，被阻止在S期的细胞比率明显提高(P<0.05)。作用48h后，与对照组相比较，除100μg/ml中药组外(P＞0.05)，其它各组细胞凋亡率均升高，有统计学意义(P<0.05)；与同浓度的顺铂组比较，加入中药+顺铂组凋亡率都明显升高(P<0.05)，具有统计学意义。周期结果显示：与对照组比较，顺铂组和中药+顺铂组均将细胞阻止在S期；与同浓度顺铂比较，中药+1μg/ml顺铂组，被阻止在S期的细胞比率明显提高(P<0.05)。由此可知：中药增强了食管癌细胞对化疗常用药物顺铂敏感性的可能机制与影响肿瘤细胞的凋亡与分裂有关。(三)体内实验中药联合顺铂对食管癌细胞EC9706裸鼠移植瘤生长的影响1实验方法：取对数生长期的食管癌EC9706细胞，于裸鼠右胁皮下注射0.1mL细胞(约2×106个细胞)混悬液，7日后，质地坚硬肉眼可见为肿瘤。取7日用量的实施例1中中药组合物，混合后，按照每1g中药加水20mL的比例，用水浸泡1h，武火煮开后改文火煎煮30min，过滤去药渣，制得中药组合物煎出液；每只小鼠(体重按20g估算)按每日剂量0.2mL计算剂量，将制得的中药组合物煎出液室温冷却，储存于4℃冰箱备用。将造模成功的裸鼠随机分为模型组、中药组、顺铂组、中药+顺铂组，每组各5只，并标号，重新测量各裸鼠移植瘤的大小，统计组间差异。模型组灌服生理盐水(0.2mL/只次)，腹腔注射生理盐水(0.2mL/只次)，中药组灌服中药组合物煎出液(0.2mL/只次)腹腔注射生理盐水(0.2mL/只次)，顺铂组灌服生理盐水(0.2mL/只次)，腹腔注射顺铂(0.2mL/只次)，中药+顺铂组灌服中药组合物煎出液(0.2mL/只次)，腹腔注射顺铂(0.2mL/只次)，灌服每日1次，腹腔注射，隔日一次，给药4周。用游标卡尺测量各实验鼠移植瘤的长径(a)和短径(b)，按公式V＝a·b2/2计算移植瘤体积，每周测量2次。统计各组每次的测量数据，结果见表3，根据均值绘制肿瘤生长曲线，见图1。脱臼处死实验鼠，剥离肿瘤组织，称重，结果见表4，根据表4绘制不同组移植肿瘤的平均重量柱状图，见图2。各实验组实验数据收集后采用SPSS19.0软件进行样本的方差齐性检验和正态性检验，组间差异性比较用单因素方差分析，结果以x±s表示，差异性描述显著水准前后取α＝0.05，绘制统计图表。2实验结果：2.1中药和顺铂联用对移植瘤生长的影响表3不同时间测量各组肿瘤体积平均值(cm3)注：M为模型组；S为顺铂组；Z为中药组；S+Z为中药和顺铂联用组(下同)2.2中药联合顺铂对移植瘤重量的影响表4不同组移植瘤的重量(g)(n＝5)组别MSZS+Z重量(g)1.631±0.1870.741±0.081*1.257±0.301*0.381±0.051*★▲注：*和模型组比较，★S+Z与S组比较，▲S+Z与S组比较由表4中数据可知，各用药组移植肿瘤重量与模型组相比，均明显小于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药和顺铂联用组与单独顺铂组或中药组比较均有明显差异，有统计学意义(P<0.05)；由此可见，联合用药对移植瘤重量的影响明显优于单独使用顺铂组，说明中药增强了移植瘤对顺铂的敏感性。(四)中药急性毒性实验给予一组动物半数致死量(LD50)观察七天，结果无一动物死亡；同时给予最大药量，结果无一动物死亡。在第二次给药后，动物活动减少比较明显，但第二天恢复正常。观察期间，除给药当天动物停止进食和有活动改变外，第二天起，动物恢复正常进食，活动正常，体重逐渐增长，外表正常。七天后，处死并解剖动物，肉眼观察各个重要脏器均未见异常改变。由体内实验、体外实验和中药急性中毒实验的实验结果可知：1)不同浓度的中药提取物和顺铂联用均有效增强了顺铂对食管癌细胞的抑制作用，可见，中药组合物提高了食管癌细胞对化疗药物的敏感性。2)从凋亡和周期结果可见，顺铂加入中药提取物后，对肿瘤细胞的凋亡和阻止分裂的效果明显增强，中药组合物提高食管癌细胞对化疗药物的敏感性，可能与影响凋亡和细胞分裂密切相关。3)化疗药物加入中药提取物时对食管癌移植瘤的生长抑制效果比单用顺铂作用明显，可见，中药组合物增强了化疗药物对移植瘤的抑制作用，有效提高了食管癌对化疗药物的敏感性。4)本发明的中药组合物安全有效，能有效增强食管癌对化疗药物的敏感性。当前第1页1 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