HFn包载铂类药物的方法及其产物与流程

本发明涉及hfn(人h铁蛋白，即由人铁蛋白的h亚基自组装形成的铁蛋白)包载铂类药物如ddp(顺氯氨铂)、cbp(卡铂)的方法及其产物。具体而言，本发明涉及利用脲或盐酸胍解聚、复性hfn并包载铂类药物如ddp、cbp的方法及产物。
背景技术：
：铁蛋白(ferritin)是参与和维持铁代谢平衡的重要功能蛋白，它是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质。从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似。典型的铁蛋白结构是由蛋白外壳和铁内核两部分构成，其中蛋白外壳是由24个亚基自组装形成的笼状结构(外径12nm，内径8nm)，铁内核的主要成分为水铁矿(5fe2o3·9h2o)。铁蛋白外壳通常是由两种蛋白亚基(h和l)组成。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有h和l亚基的比例有所不同。人h铁蛋白(hfn)是指由人铁蛋的h亚基自组装形成的铁蛋白。由人铁蛋白的h亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人铁蛋白的h亚基数目通常为24。人h铁蛋白的全长氨基酸序列如seqidno:1所示。mttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdnes(seqidno.1)根据文献报道，不同来源铁蛋白的药物装载，主要依赖于两种方式：1、药物在特定处理条件下，通过铁蛋白上的离子通道或疏水通道，进入蛋白壳内部；2、利用低ph值或高浓度脲，使蛋白壳发生解聚，在随后的复聚过程中加入待包载药物，进而实现药物在蛋白壳内部的装载。上述的包载方法中，尤其以高浓度脲条件下的hfn包载阿霉素效率最高，达到每分子hfn装载33分子阿霉素；该方法的简要步骤为：将人hfn加入终浓度大于6m的脲中，室温下反应30分钟，随后加入适量阿霉素试剂，并避光反应10分钟，然后使用透析的方法，将反应体系中的脲浓度逐级递减至0，从而实现阿霉素在hfn中的包载。相比其他包载方法，虽然高浓度脲法有效地提高了阿霉素在hfn中的装载量，但是距离临床用药需求仍有较大的差距，按照1分子铁蛋白装载33分子的阿霉素计算，临床单次给药所需的蛋白质量就达到了克级水平，显著超出了现有蛋白质药物的最高给药剂量(百毫克级)。为了满足临床用药需求，本领域必须开发载药量更大的hfn药物包载方法。以顺铂为代表的铂类抗癌药物是当今临床恶性肿瘤化疗的基石，也是肿瘤内科发展的基础之一，据统计，以顺铂为主或含有顺铂的化疗方案占所有化疗方案的70～80％，主要包括顺铂类药物如顺铂、卡铂类药物如卡铂、奈达铂、奥沙利铂。ddp，即顺氯氨铂，又称顺铂，顺式铂，顺式二氨二氯铂，化学名称为顺式二氨基二氯络铂，为橙黄色或黄色结晶性粉末，是目前常用的金属铂类络合物，在分子中铂原子对其抗肿瘤作用有重要意义。但只有顺式才有意义，反式无效。ddp微溶于水，易溶于二甲基甲酰胺，在水溶液中可逐渐转化成反式和水解。该品能与dna结合，引起交叉联结，从而破坏dna的功能，并抑制细胞有丝分裂，高浓度时也抑制rna及蛋白质的合成，为一种细胞非特异性药物。是癌症治疗的常用化学药物，抗瘤谱较广，临床用于治疗睾丸恶肿肿瘤，对胚胎瘤和精原细胞瘤均有较好效果，与常用药物无交叉耐药。对卵巢癌、乳腺癌和膀胱癌有较好疗效。对头颈部癌、肺癌、食管癌、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤软组织肉瘤和癌性胸腹水等也有一定疗效。与其他抗癌药联合应用效果更好。cbp，即卡铂，又称碳铂、卡波铂、铂尔定、顺二氨环丁铂、顺二氨环丁羧酸铂，化学名称为顺二氨络(1，1-环丁烷二酸)铂，为白色或类白色粉末，或结晶状粉末，无臭，无味，略溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿；遇光易分解。cbp为第二代铂类化合物，其生化物征与顺铂相似，但肾毒性、耳毒性、神经毒性尤其是胃肠道反应明显低于ddp，是近年来广泛受到重视的新药，与ddp一样同属细胞周期非特异性药物。它主要作用dna的鸟嘌呤的n7和o6原子上，引起dna链间及链内交联，破坏dna分子，阻止其螺旋解链，干扰dna合成，而产生细胞毒作用，为广谱抗肿瘤药，与其他抗肿瘤药无交叉耐药性，与ddp有交叉耐药性，该药易于溶解，不需水化、利水化、利尿，使用方便，主要适用于卵巢癌、肺癌、头颈部癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌等。但是铂类药物如顺铂、卡铂为强蓄积性药物，易产生肾毒性，消化道反应较常见，用于治疗癌有一定的毒性，会引起副作用，例如肾脏毒性，恶心、呕吐、食欲减低和腹泻，白细胞和(或)血小板的减少，耳毒性和神经毒性等。在运用较大剂量(80～120mg/m2)时，必须同时进行水化和利尿。为减轻毒副作用，用药期间尚应多饮水；用药前宜选用各类止吐药；同时备用肾上腺素、皮质激素、抗组织胺药，以便急救使用。因此，对ddp、cbp进行包载可以有效减少其毒副作用。然而，截至目前针对ddp、cbp的应用主要还是直接使用生理盐水或5％葡萄糖稀释后静脉注射，对ddp、cbp的毒副作用没有改善效果。利用纳米载体，尤其是将ddp、cbp包裹在纳米载体内，使其靶向肿瘤部位后再释放并起到杀伤效果，对于缓解ddp、cbp带来的毒副作用以及提高杀伤肿瘤的效果有很大的帮助。因此，本领域存在对hfn高效装载铂类药物如ddp、cbp的方法及相应产物的需求。技术实现要素：本发明的第一方面涉及一种hfn包载铂类药物的方法，其包括步骤：1)将hfn在35～50℃孵育温度下在含有一定浓度的变性剂、促进铂类药物溶解的添加剂和铂类药物的溶液中解聚8-30h，2)通过去除溶液中的变性剂使hfn复聚并包载铂类药物，3)任选地，去除溶液中残余的变性剂、添加剂和药物，4)任选地，干燥上述溶液获得包载了铂类药物的hfn固体，其中变性剂选自脲或盐酸胍；其中一定浓度在脲的情况下是指5m～8m，在盐酸胍的情况下是指4～6m；和/或，促进铂类药物溶解的添加剂选自dma、dmf、dmso或其混合物。在一些实施方案中，组成hfn的h亚基的氨基酸序列如seqidno.1所示。在一些实施方案中，促进铂类药物溶解的添加剂选自dmf或dmso。在一些实施方案中，溶液中hfn与铂类药物的质量比例为2:1～1:4，优选地，1:1～1:3，更优选地，1:1.5～1:2.5。在一些实施方案中，去除溶液中的变性剂、促进铂类药物溶解的添加剂和残余铂类药物采用脱盐方式进行，优选地，采用脱盐柱进行。在一些实施方案中，hfn包载铂类药物的质量比为5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％。在一些实施方案中，溶液中hfn含量范围为0.1～100mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml；和/或，铂类药物的含量范围为0.1～50mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml。在一些实施方案中，一定浓度在脲的情况下是指5m或8m，在盐酸胍的情况下是指5m，和/或解聚10～20h，更优选地，12～18h，和/或孵育温度为38℃～48℃，优选地，40℃～45℃。在一些实施方案中，所述铂类药物选自ddp、cbp、奈达铂或奥沙利铂。本发明的第二方面涉及一种利用上述第一方面所述的hfn包载铂类药物的方法获得的包载铂类药物的hfn。本发明所述的包载铂类药物的hfn中含有高剂量的铂类药物，即，在均一的24聚体的蛋白壳中包含了高剂量的铂类药物，其既不同于空的蛋白壳，也不同于未包载的铂类药物。本发明的第三方面涉及一种包含利用上述第一方面所述的hfn包载铂类药物的方法获得的包载铂类药物的hfn的药物组合物。利用本发明的hfn包载铂类药物如ddp、cbp的方法可以使铂类药物如ddp、cbp包载量大幅度提高，进而在达到相同治疗效果的前提下，临床给药剂量将会大大减少。附图说明图1.示出了未包载ddp的hfn的g75图谱。图2.示出了包载ddp的hfn的g75图谱。正常hfn的a280/a260比值≥2.0，而ddp在260左右有强吸收，故包载有ddp的hfna280/a260比值要明显小于2.0，图中a280/a260＝1.08明显存在ddp。图3.示出了未包载和包载ddp的hfn的紫外吸收对比结果图。ddp在254nm处有强吸收，故包载有ddp的相同浓度的hfn较未包载ddp的hfn在全波长扫描中于254处吸收更高且峰型更平缓。图4.示出了未包载cbp的hfn的g75图谱。图5.示出了包载cbp的hfn的g75图谱。正常hfn的a280/a260比值≥2.0，而cbp在260左右有强吸收，故包载有cbp的hfna280/a260比值要明显小于2.0，图中a280/a260＝1.45明显存在cbp。具体实施方式定义本发明的hfn是指全人重链(h亚基)铁蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明的解聚是指铁蛋白天然24聚体的紧密闭合球状结构被打开，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间被显著延迟，从而解聚蛋白峰与未解聚蛋白峰发生分离。在本发明中解聚比例为至少50％，例如至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达到100％。复聚是指在引起解聚的物质被去除或降低到足够低浓度后，发生解聚的铁蛋白又恢复到天然24聚体的紧密闭合球状结构，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间减少至与天然铁蛋白相近的出峰时间。在本发明中，复聚比例为至少50％，例如55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达100％。本发明中的hfn包载铂类药物如ddp、cbp是指铂类药物如ddp、cbp包载在hfn的笼状结构中的过程，在溶液体系中的hfn解聚和复聚的过程中，处于同一溶液体系中的待包载的铂类药物如ddp、cbp就会包载在复聚后重新形成的笼状结构中。本发明中的hfn中包载铂类药物如ddp、cbp的上限为hfn笼状结构的内部容积所能容纳的药物的最大量，即约268立方纳米的体积内所能容纳的药物的量。在一些实施方案中，以质量比计算，药物包载量为5～60％，优选地，10～50％、20～40％、25～35％，例如至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高。在一些实施方案中，每分子hfn包载50-900个ddp或cbp分子，例如60、80、90、100、110、120、130、140、150、170、190、200、220、240、260、280、240、260、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或更多个。利用本发明的hfn包载铂类药物如ddp、cbp的方法可以使铂类药物包载量大幅度提高，进而在达到相同治疗效果的前提下，临床给药剂量将会大大减少。本发明的包载铂类药物的溶液的缓冲体系可以包括但不限于磷酸盐缓冲液(含或不含0.9％氯化钠)、tris缓冲液。缓冲液浓度在20mm～200mm的范围，优选地，30mm～150mm，更优选地，40mm～80mm，ph值从6.9.0-8.5的范围，优选地，7.0～8.0，更优选地，7.1～7.5。本发明的包载铂类药物的缓冲体系中还含有促进铂类药物如ddp、cbp溶解的添加剂，本领域中已知用于促进铂类药物如ddp、cbp溶解的任何添加剂都可以用于本发明的方法。在一些实施方案中，所述添加剂选自dmf、dma、dmso或其混合物，在一些实施方案中，所述添加剂选自dmf或dmso或其混合物，在一些实施方案中，所述添加剂的体积比含量为10-40％，优选地，15-30％，更优选地，18-25％。本发明的包载铂类药物如ddp、cbp的hfn可以以药物组合物的形式提供，即，除包载铂类药物的hfn外，其还含有药学上可接受的载体。这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第22版，gennaro编，mackpublishingco.，2013。利用本发明的方法所获得的包载铂类药物的hfn可以用于治疗和/或预防受试者的疾病或状态。本发明的包载铂类药物的hfn所能治疗治疗和/或预防的疾病或状态取决于所包载的铂类药物，即，例如，现有技术中已知可以由ddp治疗和/或预防的疾病或状态均可以由本发明的包载ddp的hfn治疗和/或预防。不受限于任何理论，本发明的包载铂类药物的hfn可以靶向肿瘤，从而在施用后在肿瘤部位释放所包载的铂类药物，实现对所述肿瘤的预防和/或治疗。在一些实施方案中，所述疾病或状态选自小细胞与非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、成骨肉瘤、网状细胞肉瘤、精原性细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、甲状腺癌、头颈部肿瘤、鳞状上皮癌和恶性淋巴瘤。在包载的药物为cbp的情况下，则现有技术已知可以由cbp治疗和/或预防的疾病或状态均可以由本发明的包装cbp的hfn治疗和/或预防，例如卵巢癌、肺癌、头颈部癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌等。本发明的药物组合物可以通过任何适合途径和模式给予，包括都不限于静脉内或皮下注射或输注。本发明的药物组合物还可以与其他药物组合使用，例如与长春新碱、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶联用，或者与放疗配合使用。以下结合具体的实施案例对本发明做进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不意欲限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更、修改或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。实施例实施例1hfn包载ddp工艺研究本实施例以空壳铁蛋白(hfn，序列如seqidno.1所示)为载体，利用hfn8nm的内部空间来装载顺铂(ddp，购自大连美仑生物技术有限公司)，使得ddp在肿瘤治疗中达到靶向治疗的效果，工艺采用脲、胍等蛋白变性剂处理蛋白，在相应ph条件下缓冲液中按照一定比例使hfn与ddp混合并在特定温度时间下孵育，使得ddp成功包载进入hfn空腔中。1主要设备1.1aktaavant(含g75脱盐柱)(gehealthcare)1.2恒温水浴锅1.3agilent1260hplc(含agilentsec-5300a凝胶排阻柱)(agilenttechnologies)2工艺条件研究2.1不同温度条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：hfn：ddp＝2：2(质量比)，缓冲液为ph7.250mmtris，变性剂为6m脲，孵育时间15h，无添加剂。结果见表1。表1.不同温度条件下的hfn-ddp包载数据温度/℃包载摩尔比255037804213550147小结：hfn-ddp包载随温度的升高，包载增多。2.2不同时间条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：hfn：ddp＝2：2(质量比)，缓冲液为ph7.250mmtris，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，无添加剂。结果见表2。表2.不同时间条件下的hfn-ddp包载数据时间/h包载摩尔比151302414236140小结：hfn-ddp包载随时间的延长，包载增多。2.3.不同ph条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：hfn：ddp＝2：2(质量比)，缓冲液为50mmtris，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，孵育时间为15h，无添加剂。结果见表3。表3.不同ph条件下的hfn-ddp包载数据小结：hfn-ddp包载量基本受ph影响不大。2.4.不同添加剂条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：hfn：ddp＝5：4(质量比)，缓冲液为ph8.050mmtris，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，孵育时间为15h。结果见表4。表4.不同添加剂条件下的hfn-ddp包载数据添加剂包载摩尔比无15010％dmf14220％dmf14810％dmso15820％dmso170小结：hfn-ddp包载受dmf影响不大，受dmso影响较大。2.5.不同hfn与ddp(质量比)比例条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：缓冲液为ph7.250mmtris，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，孵育时间为15h，添加剂为20％dmso。结果见表5。表5.不同hfn与ddp(质量比)比例条件下的hfn-ddp包载数据小结：hfn-ddp包载受不同hfn与ddp比例影响较大，总体上，ddp所占比例越大，包载越多。2.6.不同蛋白变性剂条件下的hfn-ddp包载数据不变条件为：hfn：ddp＝5：4(质量比)，缓冲液为ph7.250mmtris，孵育温度为42℃，添加剂为20％dmso。结果见表6。表6.不同蛋白变性剂条件下的hfn-ddp包载数据蛋白变性剂包载摩尔比6m脲1548m脲1505m盐酸胍152小结：hfn-ddp包载量基本受不同蛋白变性剂影响不大。3.特定条件下的hfn-ddp包载工艺研究3.1.工艺参数hfn：5mg/ml，ddp：4mg/ml蛋白变性剂：6m脲孵育温度：42℃孵育时间：15h孵育缓冲液：ph8.250mmtris–hcl添加剂：20％dmf3.2工艺流程(2ml体系)3.2.1样品准备首先将保存在50mmtris–hclph8.0缓冲液中的hfn(其亚基序列如seqidno.1所示，为24个亚基组成的笼状结构，naturenanotechnology,2012,7(7),459-464)溶液(pbs或tris缓冲液体系))浓缩至20mg/ml备用，准确称取8mg的ddp及0.720g脲并混合，加入10mg的hfn并与缓冲液混匀使脲溶解，后加入20％的dmf定容至2ml。使用振荡器将样品混合30s，然后置于42℃水浴锅中孵育15h。3.2.2样品处理样品使用50mmtris–hclph:8.2缓冲液在50ml的g75柱子上直接洗脱脲和游离的ddp。3.2.3样品测定对样品进行bca蛋白质测定(可以得出样品中hfn的量，试剂盒厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号prod#23227)、hplc(进一步确定包载以及单体纯度，厂家：安捷伦科技(中国)有限公司，高效液相色谱1260infinity)测定、nanodrop(通过与等浓度hfn对比观察包载效果，厂家genecompanylimited基因有限公司，型号nd2000)、icp-ms(测定ddp含量，厂家：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号neptuneplustm高分辨率多接收器icp-ms)。(除非另外明确声明，上述第2部分工艺研究的方法步骤与第3部分的方法步骤相同，除发生改变的参数之外)3.2.4包载数据结果见图1-3，综合图1、2、3可以推断ddp成功的包载进入hfn中，并结合bca所得hfn浓度及icp-ms测定的ddp含量得出了药载摩尔比为150。实施例2hfn包载cbp工艺研究本工艺以空壳铁蛋白(hfn)为载体，利用hfn8nm的内部空间来装载卡铂(cbp，购自大连美仑生物技术有限公司)，使得cbp在肿瘤治疗中达到靶向治疗的效果，工艺采用脲、胍等蛋白变性剂处理蛋白，按照一定比例使hfn与cbp混合并在特定温度时间下孵育，使得cbp成功包载进入hfn空腔中。1、工艺条件研究1.1不同温度条件下的hfn-cbp包载数据不变条件为：hfn：cbp＝2：2(重量比)，缓冲液为ph7.020mmpb，变性剂为6m脲，孵育时间为24h，无添加剂。结果见表1。表1.不同温度条件下的hfn-cbp包载数据温度/℃包载摩尔比3740429050100小结：hfn-cbp包载随温度的升高，包载增多。1.2.不同时间条件下的hfn-cbp包载数据不变条件为：hfn：cbp＝2：2(质量比)，缓冲液为ph7.020mmpb，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，无添加剂。结果见表2。表2.不同时间条件下的hfn-cbp包载数据时间/h包载摩尔比1580249036954898小结：hfn-cbp包载在一定时间内随时间的延长，包载增多，后逐渐稳定。1.3.不同添加剂条件下的hfn-cbp包载数据不变条件为：hfn：cbp＝5：4(质量比)，缓冲液为ph7.020mmpb，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，孵育时间为15h。结果见表3。表3.不同添加剂条件下的hfn-cbp包载数据添加剂包载摩尔比无8020％dmf8520％dmso140小结：hfn-cbp包载受dmf影响不大，受dmso影响较大。1.4.不同hfn与cbp比例(质量比)条件下的hfn-cbp包载数据不变条件为：缓冲液为ph7.020mmpb，变性剂为6m脲，孵育温度为42℃，孵育时间为15h，添加剂为20％dmso。结果见表4。表4.不同hfn与cbp比例条件下的hfn-cbp包载数据hfn/cbp包载摩尔比5:41505:21354:31452:2140小结：hfn-cbp包载受不同hfn与cbp比例影响，但在一定比例内影响不大。1.5.不同蛋白变性剂条件下的hfn-cbp包载数据不变条件为：hfn：cbp＝5：4(质量比)，缓冲液为ph7.020mmpb，孵育温度为42℃，添加剂为20％dmso。结果见表5。表5.不同蛋白变性剂条件下的hfn-cbp包载数据小结：hfn-cbp包载量基本受不同蛋白变性剂影响不大。2.特定条件下的hfn-cbp包载工艺研究2.1工艺参数hfn：5mg/ml，cbp：4mg/ml蛋白变性剂：6m脲孵育温度：42℃孵育时间：15h孵育缓冲液：ph7.0，20mmpb2.2.工艺流程(2ml体系)2.2.1样品准备首先将保存在50mmtris–hclph8.0缓冲液中的hfn浓缩至20mg/ml并用ph7.020mm换液备用，准确称取8mg的cbp及0.720g脲并混合，加入10mg的hfn并与缓冲液混匀使脲溶解并定容至2ml。使用振荡器将样品混合30s，然后置于42℃水浴锅中开始孵育15h。2.2.2样品处理样品使用ph7.020mmpb的缓冲液在50ml的g75柱子上直接洗脱脲和游离的cbp。2.2.3样品测定对样品进行bca蛋白质测定(可以得出样品中hfn的量)、hplc(进一步确定包载以及单体纯度)测定、nanodrop(通过与等浓度hfn对比观察包载效果)、icp-ms(测定cbp含量)。除非另外明确声明，上述第1部分工艺研究的方法步骤与第2部分的方法步骤相同，除发生改变的参数之外)2.2.4包载数据结果见图4和5，综合图4和5可以推断cbp成功的包载进入hfn中，并结合bca所得hfn浓度及icp-ms测定的cbp含量得出了药载摩尔比为100。序列表<110>昆山新蕴达生物科技有限公司<120>hfn包载铂类药物的方法及其产物<130>lz1800246cn01<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>183<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>1metthrthralaserthrserglnvalargglnasntyrhisglnasp151015serglualaalaileasnargglnileasnleugluleutyralaser202530tyrvaltyrleusermetsertyrtyrpheaspargaspaspvalala354045leulysasnphealalystyrpheleuhisglnserhisglugluarg505560gluhisalaglulysleumetlysleuglnasnglnargglyglyarg65707580ilepheleuglnaspilelyslysproaspcysaspasptrpgluser859095glyleuasnalametglucysalaleuhisleuglulysasnvalasn100105110glnserleuleugluleuhislysleualathrasplysasnasppro115120125hisleucysasppheilegluthrhistyrleuasngluglnvallys130135140alailelysgluleuglyasphisvalthrasnleuarglysmetgly145150155160alaprogluserglyleualaglutyrleupheasplyshisthrleu165170175glyaspseraspasngluser180当前第1页12