3-甲基腺嘌呤在制备治疗视网膜下纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是3-甲基腺嘌呤在制备治疗视网膜下纤维化的药物中的应用。

背景技术：

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，又称老年黄斑变性，是50岁以上成年人致盲的主要原因之一。近年来，AMD发病率呈逐年增高之势。在发展中国家，AMD的发病率约为7％，在发达国家，预计到2020年AMD患者将增加50％，接近23％患者视力完全丧失。临床上将AMD分为干性(dry AMD)和湿性(wet AMD,wAMD)，前者占AMD患者的80％-90％，后者占10％-15％。虽然湿性AMD占患者总比例较少，但约90％的AMD相关的视力丧失与湿性AMD有关。wAMD患者的视力预后较差，随着脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)和随后的视网膜下纤维化(subretinal fibrosis,SRF)的形成，病情发展迅速。虽然常用的抗血管内皮生长因子(anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF)药物治疗可以提高wAMD患者的视力，但研究表明在2年内大约有一半的抗VEGF治疗的眼睛会形成视网膜纤维瘢痕。SRF的发生导致视网膜光感受器细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)及脉络膜血管的不可逆损伤，从而导致视力的永久性丧失，因此迫切需要加强对SRF的研究，研发一种能有效预防和干预SRF的药物以保障抗VEGF疗效，提高wAMD患者视力预后。

目前，临床上并没有针对SRF进行有效预防和干预的手段。基础研究表明SRF可能是由于过度的损伤愈合反应导致的，而持续的损伤或炎症状态可能是导致过度损伤愈合反应的前提。有研究发现，在AMD患者尸眼的视网膜下纤维膜中可见大量巨噬细胞浸润，且在动物模型中也发现了巨噬细胞浸润在CNV区域，说明巨噬细胞参与的免疫炎症反应可能与视网膜下纤维化的形成有关。近年来肝脏、肺脏组织的纤维化研究也指向纤维化的发病与炎症反应的参与、上皮间质转化、氧化应激和相关信号通路活化等有关。因此，从SRF的发病机制出发，找到抗纤维化发生的关键靶点并进行有效干预是亟待解决的关键问题。

自噬是真核生物进化中高度保守的对细胞内物质进行降解再利用的过程，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，近年来大量研究显示自噬参与纤维化的发生和发展。本发明在动物体内进行腹腔注射常用的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)，发现3-MA明显的抑制了视网膜下纤维化。我们通过体内和体外实验进一步研究了3-MA抑制SRF的机制。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供3-甲基腺嘌呤在制备治疗视网膜下纤维的药物中的应用。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供3-甲基腺嘌呤在制备治疗老年黄斑变性的药物中的应用。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供3-甲基腺嘌呤在制备试剂中的应用。

本发明的第四个目的是针对现有技术中的不足，提供一种抗视网膜下纤维化的药物组合物。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

3-甲基腺嘌呤在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗视网膜下纤维化。

作为本发明的一个优选实施方案，所述视网膜下纤维化是指老年黄斑变性相关的视网膜下纤维化。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物抑制视网膜下纤维化的形成。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物通过抑制巨噬细胞自噬活性，减少巨噬细胞数量，调节巨噬细胞亚型，抑制巨噬细胞促纤维化信号通路的激活发挥抗纤维化作用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物的给药方式为注射给药。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

3-甲基腺嘌呤在制备治疗老年黄斑变性的药物中的应用，所述药物抑制视网膜下纤维化的形成。

作为本发明的一个优选实施方案，所述老年黄斑变性是指湿性AMD。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

3-甲基腺嘌呤在制备试剂中的应用，所述试剂用于调节巨噬细胞表型。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抗视网膜下纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含3-甲基腺嘌呤、以及药学上可接受的载体或辅料，所述视网膜下纤维化是指老年黄斑变性相关的视网膜下纤维化，所述药物组合物抑制视网膜下纤维化的形成。

本发明首先建立视网膜下纤维化动物模型，验证该模型的成功建立(图1)，其次通过全身注射巨噬细胞清除剂氯磷酸二钠脂质体证明巨噬细胞在SRF中的关键作用(图2)，然后结合前期发现眼球组织自噬活性升高的结果，首先将自噬激活定位到巨噬细胞(图3)，再应用3-MA腹腔注射，观察分析3-MA对巨噬细胞自噬活性(图3)、数量(图4)、极化分型(图5)的影响，最后探索3-MA对巨噬细胞及纤维化发挥作用的相关信号通路(图6)。

本发明优点在于：

1、本发明首次发现3-MA腹腔注射可明显抑制视网膜下纤维化。

2、3-MA通过抑制巨噬细胞自噬活性，减少巨噬细胞数量，调节巨噬细胞亚型，抑制巨噬细胞促纤维化信号通路的激活发挥抗纤维化作用。

3、发现全身应用3-MA无明显毒副作用。

附图说明

附图1为激光损伤模型CNV及SRF的时间变化趋势结果，激光损伤后35天脉络膜新生血管消退而视网膜下纤维化生成显著。

附图2为巨噬细胞清除实验结果，巨噬细胞清除减少了SRF的形成。

附图3为3-MA腹腔注射对巨噬细胞活性的影响，显示3-MA可明显抑制巨噬细胞自噬活性。

附图4为3-MA腹腔注射对巨噬细胞数量的影响，显示3-MA明显减少了SRF及周围巨噬细胞数量却并未影响脾脏巨噬细胞数量。

附图5为3-MA腹腔注射对巨噬细胞极化分型的影响，显示SRF周围以M2型巨噬细胞募集为主，3-MA调控巨噬细胞极化分型。

附图6为3-MA对巨噬细胞及纤维化发挥作用的相关信号通路，显示3-MA通过抑制巨噬细胞STAT3/TGF-β2信号通路抑制视网膜下纤维化。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

药物组合物

依据本发明的方法，3-甲基腺嘌呤可以制备抗视网膜下纤维化形成的药物组合物，所述的药物组合物可由药物活性成分3-甲基腺嘌呤和药学上可接受的载体组成。

所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将3-甲基腺嘌呤作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型。当用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射剂。在各种制剂中，活性成分的重量含量为0.01％～99.9％。

所述的药物组合物可以用于治疗视网膜下纤维化的疾病。例如可以按剂型通过口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、粘膜用药等途径应用于需要治疗的个体，所述个体可以是人或动物。

本发明中，所述“药学上可接受”这里指一种物质，如载体或稀释液，不会使3-甲基腺嘌呤的生物活性或性质消失，且相对无毒。例如加入某物质，不会引起不想要的生物影响或以有害的方式与3-甲基腺嘌呤发生相互作用。

本发明中，所述治疗，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退。在本发中，所述治疗，尤指抑制视网膜下纤维化的形成。

实施例

本实施例中，在小鼠眼球后极部实施532nm激光建立小鼠视网膜下纤维化模型，探讨嘌呤类化合物3-MA对视网膜下纤维化的治疗效果。具体实验过程如下所述。

1.1实验动物

6-8周龄C57BL/6J健康雄性小鼠50只，100眼，体重为20～25g。

1.2试剂与仪器

3-甲基腺嘌呤化合物，氯磷酸二钠脂质体，荧光素钠注射液，一抗(F4/80、IB4-Lectin、Fibronectin、LC3、Atg5、Becline-1、YM-1、Arg-1、转化生长因子TGF-β2、信号转导与转录激活因子STAT3等)，荧光二抗等。Coherent激光治疗仪，海德堡荧光造影眼底成像仪，Olympus荧光显微镜，Leica共聚焦显微镜，冰冻切片机等。

1.3实验方法

1.3.1视网膜下纤维化模型的建立

为了诱导SRF，我们利用532nm激光对雄性C57BL/6J小鼠进行眼底激光损伤并观察到35天。简而言之，我们在第0天用透明盖玻片作用接触镜对小鼠眼底进行了激光光凝术(波长532nm，能量120mW，间隔时间100ms，光斑直径50μm)；在第7天、第21天和第35天分别进行观察和取材。眼底视神经周围接受8-10个激光点损伤的小鼠视网膜和脉络膜组织用于Western Blots实验分析，接受4个激光点损伤的小鼠视网膜和脉络膜用于免疫荧光检测。

1.3.2巨噬细胞清除实验

为了清除巨噬细胞，在激光光凝后的不同时间点用氯膦酸盐脂质体Clodrosome(SKU：8901，Encapsula Nanosciences，50mg·kg-1)进行腹腔注射。观察终点为7天的小鼠，于激光光凝后1,3和6天接受脂质体注射；观察终点为35天的小鼠，在接受前三次注射后每周再接受一次注射直至观察到35天。对照组注射未包裹氯磷酸二钠的脂质体Encapsome。

1.3.3 3-MA腹腔注射

3-MA粉末(M9281，Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)溶于65℃去离子水中，浓度为30mg·mL^-1，用0.9％盐水稀释10倍进行小鼠腹腔注射，剂量为15mg·kg^-1，频率为每两天注射一次。对照组腹腔注射等体积0.9％生理盐水。

1.3.4荧光血光造影

于造模后7天、21天、35天进行荧光素血管造影(FA)，以观察CNV泄漏的严重程度。每只小鼠腹腔注射10％荧光素钠(荧光素)0.05mL；使用数码眼底照相机(海德堡视网膜血管造影，Vista,CA)捕捉到眼底血管造影照片，并计算每个CNV病灶的平均信号强度。将视网膜血管的信号强度定义为1，无血管区域信号强度定义为0，利用Image软件对激光损伤处渗漏信号轻度进行测量，每个像素的信号强度用0(最暗)到1(最亮)的数字表示。

1.3.5脉络膜铺片

分别在激光损伤后第7天、第21天、第35天，用4％多聚甲醛对小鼠进行心脏灌流。摘取小鼠眼球后固定2小时，放置在PBS中。显微镜下去除眼前节和视网膜组织，将剩余杯状RPE脉络膜复合体切4-6个放射状切口后铺平。

1.3.6免疫荧光染色及量化

将待染铺片或切片用封闭液(0.3％Triton+5％的山羊血清)封闭一小时，然后用封闭液配制一抗，4度过夜。次日弃去一抗，PBS清洗三遍，用封闭液配制荧光二抗，室温孵育1小时，弃去二抗，PBS清洗一遍后进行DAPI核染，封片并在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察拍照。为了量化巨噬细胞，我们使用DAPI(蓝色)标记细胞核，使用F4/80(红色)标记巨噬细胞。只有同时标记了红色和蓝色的细胞才被认为是巨噬细胞。为了定量并定位巨噬细胞中的自噬活性，我们使用F4/80(红色)标记巨噬细胞，使用DAPI(蓝色)标记细胞核，使用LC3B(绿色)显示自噬激活，LC3B点状颗粒(绿色)被认为是激活的LC3形式。为了量化CNV和SRF面积，我们使用IB4标记CNV，使用Fibronectin标记SRF，使用荧光显微镜系统自带的测量软件进行测量。每张照片至少测量三次，然后用平均值进行统计分析。

1.3.7免疫印迹实验

于造模后第7天、第21天、第35天过量麻醉法处死小鼠5只，摘除双侧眼球，显微镜下沿角巩膜缘剪去角膜，去除晶状体和玻璃体，分离视网膜脉络膜组织，用裂解液提取视网膜组织总蛋白，进行蛋白变性，然后电泳、转膜，添加相应一抗4℃孵育过夜。次日，TBST洗后用相应二抗常温孵育1小时，TBST清洗三遍后采用电化学发光试剂盒显像。

1.3.8细胞培养

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7购自ATCC(Manassas，VA，USA)，并在含有10％FBS和1％双抗(青霉素、链霉素)的DMEM中培养。为了检测3-MA是否影响蛋白质表达和巨噬细胞极化，将RAW细胞分为IL-4(404-ML，100ng/ml，RD)单独处理组、IL-4联合3-MA(5mM)处理组，处理48小时然后收集细胞用于蛋白质印迹。为了检测STAT3信号通路的作用，将RAW细胞用JAK2酪氨酸激酶抑制剂AG490(S1143,30μM,Selleck)处理24小时以阻断STAT3活化，然后收集细胞进行Western Blots实验。

1.4统计学处理

采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，以均数±标准差表示；然后经Levene检验检查方差齐性。对CNV渗漏信号强度、CNV及SRF面积、巨噬细胞数量等的相关结果，满足方差齐性时，采用单因素方差分析比较各组整体差异；方差不齐时，采用Dunnet t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2.1激光损伤模型CNV及SRF的时间变化趋势

结果如图1所示。我们的数据显示，激光损伤后第7天，荧光素渗漏信号强度达到峰值(0.91±0.05)，然后在第21天开始减弱(0.42±0.10)，在激光后第35天仅能看见少量渗漏信号(0.23±0.05)(图1A，1B)，与之一致的是脉络膜铺片中CNV的面积变化：在造模后第7天CNV面积最大(0.034±0.003mm²)，第21天CNV面积明显减小(0.021±0.002mm²)，到第35天明显减少但仍有部分存留(0.011±0.001mm²)，而SRF面积从造模后第7天到第35天呈逐渐增加趋势(图1A，1C)。这种CNV逐渐消退并伴随SRF逐渐增加的现象与nAMD患者的CNV晚期的自然病程十分类似。上述结果说明激光损伤小鼠眼底模型可很好的诱导视网膜下纤维化，激光损伤后第35天可作为研究视网膜下纤维化发生病理机制的时间点。

2.2巨噬细胞清除实验结果

结果如图2所示。小鼠脾脏免疫荧光结果表明，相对于Encapsome组，Clodrosome具有明显的清除全身巨噬细胞的效果，第7天清除率可达90％以上，第35天清除率可达80％以上(图2A)。造模后第7天，相对于Encapsome组，Clodrosome组纤维化组织周围的巨噬细胞数量明显减少(分别为40.8±6.3个，4.2±3.4个)，CNV面积亦明显减小(分别为0.037±0.0085mm2，0.003±0.011mm2)，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2B,2D)。造模后第35天，氯磷酸二钠脂质体组损伤周围的巨噬细胞数量明显少于对照组(分别为34.4±4.1个，3.4±3.0个)，SRF面积明显减少(分别为0.045±0.0095mm2，0.004±0.010mm2)，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2B,2E)。上述结果提示巨噬细胞在视网膜下纤维化形成中具有重要作用。

2.3 3-MA可明显抑制巨噬细胞自噬

结果如图3所示。Western Blots结果表明，激光损伤小鼠眼底后，随着时间延长，自噬活性逐渐升高(图3A)，且免疫荧光结果进一步证实了自噬活性定位于损伤周围的巨噬细胞中(图3B)。这说明损伤周围的巨噬细胞处于自噬激活状态。进而，通过腹腔注射3-MA，自噬相关蛋白如LC3、Atg5、Becline-1表达水平相对于对照组明显降低，且巨噬细胞内LC3颗粒的含量也明显减少(分别为37.3±4.3个，3.0±2.1个)(P<0.05)(图3C)。上述结果提示3-MA腹腔注射可以显著抑制巨噬细胞自噬活性。

2.4 3-MA可明显减少损伤周围巨噬细胞数量

结果如图4所示。免疫荧光结果显示，造模后第35天，3-MA处理组纤维化瘢痕周围F4/80阳性细胞的数量明显减少(分别为41.7±9.8个，8.8±5.5个)，同时纤维化面积也明显减少(分别为0.048±0.016mm2，0.003±0.001mm2)，差异均有统计学意义(P<0.05)(图4A，4B，4C)。另外，为了探讨3-MA作用的分子机制，我们用Western Blots测定了相关蛋白的表达。首先，我们证实了3-MA对CNV相关蛋白VEGFA以及纤维化相关蛋白CollagenI蛋白的表达的具有抑制作用。其次，我们检测了促纤维化因子TGF-β2的蛋白表达情况，发现3-MA可抑制纤维化期间升高的TGF-β2水平(图4D)。同时，我们检测了3-MA处理对脾脏内巨噬细胞的数量和分布的影响，并未发现与正常对照组有统计学差异(4E)，说明3-MA全身应用对正常器官并无明显毒副作用。这些结果表明长期全身应用3-MA相对安全，可通过抑制相关因子的表达抑制巨噬细胞募集，从而有效抑制CNV和纤维化。

2.5 3-MA可调控巨噬细胞亚型

为了确定聚集在纤维化区域周围巨噬细胞的亚型，我们在激光后第35天进行脉络膜铺片，标记M2型巨噬细胞标记蛋白YM-1，使用F4/80标记巨噬细胞，实验结果表明纤维化组织周围大多数巨噬细胞是YM-1阳性的(图5A)。另外，为了研究3-MA是否影响巨噬细胞亚型，我们在激光后第35天对视网膜切片进行免疫荧光。对照组在激光损伤部位可观察到YM-1信号，且主要分布在F4/80阳性细胞中，而3-MA处理组YM-1信号明显减少(图5B)。为了进一步确认3-MA对巨噬细胞亚型的影响，我们在体内和体外均检测了M2巨噬细胞特异性基因(YM-1和Arg-1)的表达水平。与对照组相比，两个M2特异性基因尤其是YM-1在激光后35天上调，而3-MA处理后明显下调(图5C)。在RAW细胞中，我们使用IL-4诱导M2极化，在IL-4处理24小时后YM-1和Arg-1表达增加，但3-MA处理24小时后其表达明显降低(图5D)。以上结果表明3-MA可通过抑制M2表型转化抑制M2型巨噬细胞的促纤维化作用。

2.6 3-MA可抑制促纤维化信号通路激活

研究表明wAMD患者中循环单核细胞中的存在STAT3激活的现象，因此我们检测了巨噬细胞中STAT3信号通路的水平。我们发现对照组磷酸化STAT3(p-STAT3)表达水平在纤维化过程中明显增加，而3-MA处理后p-STAT3表达明显下调。总STAT3蛋白表达水平在两组间无明显变化(图6A)。此外，免疫荧光分析显示在造模后第35天，对照组巨噬细胞内可见明显的STAT3激活现象，而3-MA处理后p-STAT3信号明显减少(图6B)，说明3-MA也明显抑制巨噬细胞STAT3的激活。最后，我们在RAW细胞中进行了进一步的验证：3-MA处理可明显下调由IL-4诱导的p-STAT3、总STAT3和TGF-β2的表达水平(图6C)。同时我们发现阻断STAT3的激活可抑制TGF-β2的表达，意味着TGF-β2表达可能是p-STAT3依赖性的(图6D)。

总之，这些结果表明3-MA可能通过抑制巨噬细胞内STAT3激活及其下游的TGF-β2的表达抑制纤维化的形成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。