本发明涉及纳米载药
技术领域：
，具体涉及一种氧化石墨烯纳米载药的工艺方法及应用。
背景技术：
：氧化石墨烯(grapheneoxide，go)，是石墨烯的氧化产物，含有大量的羟基、羧基和环氧基团，这些含氧活性基团的引人不仅使其拥有良好的水溶性和稳定性，而且可使go更易于修饰而具有功能化作用。除此之外，go两面均具有芳香结构，且比表面积较大，可通过π-π共轭、氢键和疏水效应等非共价键与单链dna和rna以及芳香类药物分子如阿霉素、喜树碱及其衍生物等结合，理论负载量高，go被广泛用于生物医学领域。采用亲水性高分子材料修饰go是进一步提高go安全有效性的途径，明胶修饰的go可使其在水或者各种生理溶液中保持良好的分散性和稳定性，且细胞毒性大大降低，表现出极高的安全性。叶酸受体是人多种肿瘤组织比较有效的生物靶点。它是一种膜蛋白，可与细胞外叶酸高亲和力结合，并通过胞吞作用将其运抗癌药的递药设计。目前，很多临床前试验和新兴的临床试验证明，将叶酸受体可以应用到叶酸聚合物显影诊断剂识别解剖位置和应用叶酸聚合化疗药可有效地对其治疗。现在比较热门的就是基于叶酸的小分子药物配合物，包括叶酸受体、聚合物、载体和药物。目前研究较多的载体为脂质体、聚合物胶束、固体脂质体纳米粒、树枝状聚合物及碳纳米管，而将氧化石墨烯作为载体应用到该叶酸受体的递药系统的暂时还未见报道。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明提供一种一种氧化石墨烯纳米递药工艺方法，并提出用该纳米递药体系治疗癌症的应用，该递药体系生物相容性好、治疗效果好、见效时间短、效率高、安全性好。本发明提供一种氧化石墨烯纳米递药工艺方法，包括：(1)氧化石墨烯(go)的酸化：采用hummers法制备氧化石墨烯1mol，加入100ml的硝酸，120℃回流12h，冷却过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，干燥得到酸化的氧化石墨烯；(2)叶酸活化脂(nhs-fa)的合成：加入1mol叶酸溶于乙醇，依次加入缩合剂3moldcc和2molnhs，60℃避光反应12h，停止反应，柱层析色谱分离得到nhs-fa；(3)明胶-fa偶联物的合成：将1.5mol的明胶溶于ph＝4.5～5.0的pb缓冲液中，滴加1mol的nhs-fa的乙醇溶液，再加入1mol的edc，避光反应过夜，得到明胶-fa偶联物；(4)go-明胶-fa载体的合成：将1mol酸化的氧化石墨烯加入水中，500w超声20min使其分散均匀，滴加1mol的明胶-fa偶联物的乙醇溶液，加入1mol的edc，搅拌反应12h，过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，得到白色go-明胶-fa载体；(5)药物的装载：将1mol的go-明胶-fa载体加入水中，超声使其分散均匀，滴加1.2mol已溶于水的药物，500w超声搅拌30min，避光反应24h，过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，得到氧化石墨烯纳米递药体系。作为本发明进一步的改进，明胶可用天然高分子聚合物藻酸盐、透明质酸、壳多糖及胶原代替。作为本发明进一步的改进，明胶可用化学高分子聚合物peg、hpma及pga代替。作为本发明进一步的改进，药物为阿霉素、紫杉醇、卡铂、喜树碱、多柔比星。作为本发明进一步的改进，缩合剂dcc可用ddc替代。本发明进一步保护一种将上述氧化石墨烯纳米递药体系用于治疗癌症的应用。作为本发明进一步的改进，癌症包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌。本发明具有如下有益效果：1、本发明的氧化石墨烯纳米递药系统在生理溶液和水中良好的分散性和稳定性，同时具备极好的生理相容性和极低的细胞毒性，安全有效，可用于快速靶向癌症治疗；2、本发明的氧化石墨烯纳米递药系统可用于较广泛种类的癌症的靶向治疗，治疗速度快，效率高，见效时间短，对于癌症难题的攻克具有重大医学意义。附图说明图1是氧化石墨烯纳米递药体系的制备工艺流程图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售。实施例1氧化石墨烯纳米递药载体的制备按一下步骤进行：(1)氧化石墨烯(go)的酸化：采用hummers法制备氧化石墨烯1mol，加入100ml的硝酸，120℃回流12h，冷却过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，干燥得到酸化的氧化石墨烯；(2)叶酸活化脂(nhs-fa)的合成：加入1mol叶酸溶于乙醇，依次加入缩合剂3moldcc和2molnhs，60℃避光反应12h，停止反应，柱层析色谱分离得到nhs-fa；(3)明胶-fa偶联物的合成：将1.5mol的明胶溶于ph＝4.5～5.0的pb缓冲液中，滴加1mol的nhs-fa的乙醇溶液，再加入1mol的edc，避光反应过夜，得到明胶-fa偶联物；(4)go-明胶-fa载体的合成：将1mol酸化的氧化石墨烯加入水中，500w超声20min使其分散均匀，滴加1mol的明胶-fa偶联物的乙醇溶液，加入1mol的edc，搅拌反应12h，过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，得到白色go-明胶-fa载体；实施例2阿霉素--氧化石墨烯纳米递药体系的制备将1mol的go-明胶-fa载体加入水中，超声使其分散均匀，滴加5mol已溶于水的阿霉素，500w超声搅拌30min，避光反应24h，过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，得到阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系。实施例3紫杉醇--氧化石墨烯纳米递药体系的制备将1mol的go-明胶-fa载体加入水中，超声使其分散均匀，滴加5mol已溶于水的紫杉醇，500w超声搅拌30min，避光反应24h，过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣，得到紫杉醇-氧化石墨烯纳米递药体系。对比例1按照专利：靶向性抗肿瘤药物和基因共载载体材料及制备和应用(专利号：zl201210531834.6)实施例方法制备盐酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的负载产物按照以下步骤进行：(1)合成氧化石墨烯材料，采用改进的hummers法制备氧化石墨烯；(2)乳糖酰化壳聚糖的制备：乳糖酸0.2671g，edc0.1715g，nhs0.1030g溶解在5ml蒸馏水中，超声溶解后，电磁搅拌1小时活化。称取1g纯化的壳聚糖，溶在3ml蒸馏水中，超声溶解后，与活化的乳糖酸混合在一起，加入三乙胺调ph值至8-9，电磁搅拌反应48小时。体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，收集流出的黄色溶液，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物；(3)氧化石墨烯与上述第二步产物连接：称取3mg氧化石墨烯，分散在10ml蒸馏水中，加氢氧化钠调ph值至6-7，加入edc95.85mg，nhs57.5mg，超声溶解后，温水浴搅拌40分钟活化。在氧化石墨烯溶液中加入80mg上述第二步产物乳糖酰化壳聚糖。超声溶解后，用三乙胺调ph值至8-9，35℃油浴反应120小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次(3-5次)。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过热重分析和红外光谱证明；(4)季铵化反应：将第三步产物超声分散在50ml蒸馏水中，加入400mg2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，加氢氧化钠调ph值至7-8，80℃油浴回流，电磁搅拌反应24小时。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。产物通过激光粒度仪表征zeta电位；(5)阿霉素的负载：将6ml浓度为0.33mg/ml的功能化氧化石墨烯与12ml浓度0.45mg/ml的阿霉素溶液混合并超声30分钟，室温避光搅拌12小时。然后样品在14000转/分钟下离心，即得。对比例2按照专利：基于氧化石墨烯的靶向性基因载体材料及制备和应用(专利号：zl201110244641.8)实施例方法制备载药体系(1)合成氧化石墨烯材料：采用改进的hummers法制备氧化石墨烯；(2)聚乙二醇和叶酸偶联物的制备：将44mg叶酸和420mg氨基封端的聚乙二醇(mn＝2100)混溶于40mln,n-二甲基亚砜和10ml水的混合溶剂中，加入edc，nhs室温搅拌一天，体系旋蒸脱溶，浓缩物过葡聚糖凝胶柱，收集先流出的黄色溶液，将产物浓缩冻干，获得二者偶联产物；(3)氧化石墨烯与上述第二步产物连接：10mg氧化石墨烯分散在10ml水中，加入edc192mg，nhs115mg，继续超声1小时后，体系搅拌过夜。加入100μl三乙胺调节反应溶液的ph值为9左右，再往体系中加入170mg上述第二步产物，室温反应4天。待反应完全后，对反应体系进行离心，得到的沉淀物用蒸馏水进行洗涤，反复数次。偶联产物修饰氧化石墨烯的结构通过红外光谱和紫外光谱证明；(4)盐酸氨甲基芘反应：将5ml第三步产物go-peg-fa(1mg/ml)0.5ml(1mg/ml)pynh2混合，室温超声搅拌1天，得到的go-peg-fa-pynh2用蒸馏水通过高速离心反复洗涤数次。通过对上层清液紫外光谱吸收峰的监测，确定溶液中不含有过量游离的pynh2，从而得到功能化氧化石墨烯备用。产物结构通过紫外光谱证明。(5)阿霉素的负载：将6ml浓度为0.33mg/ml的上述功能化氧化石墨烯与12ml浓度0.45mg/ml的阿霉素溶液混合并超声30分钟，室温避光搅拌12小时。然后样品在14000转/分钟下离心，即得。对比例3按照专利：一种叶酸介导的peg-氧化石墨烯负载阿霉素纳米粒及其制备方法(专利号：zl201410066632.8)实施例方法制备载药体系(1)氧化石墨(go)的制备与纯化：采用改进的hummers法制备氧化石墨烯；(2)go的羧化：取200ml烧杯，加入100ml去离水，称取约100mggo加至烧杯中，超声分散，分别将5gnaoh和5gclch2coona加入到烧杯中，水浴超声2h，向烧杯中加入质量分数为5％的稀盐酸洗涤、离心，反复多次直至ph呈中性，然后，将产物转移至透析袋中(mw8000～14000)，以去离子水为透析介质透析48h，并每12h更换一次介质，以去除产物溶液中的所有离子。将产物溶液烘干，即得羧化的go(go-cooh)。(3)叶酸(fa)介导的peg-氧化石墨烯(peg-go-fa)的制备称取100mg的fa加入到反应瓶中，量取16ml二甲基亚砜(dmso)分次加入到反应瓶中并超声使fa充分溶解，加入100mggo-cooh并超声分散后加入约214.2mgdcc、292mgnhs和20μl吡啶，超声活化2h，开始30min控制温度在18℃，随后2h内逐渐升温至30℃，搅拌条件下加入peg-nh2约700mg，30℃、氮气保护下搅拌反应24h，反应结束后加入10ml蒸馏水并于4℃水浴冷却1h，20000r/min离心30min，0.8μm有机微孔滤膜过滤，将滤液转移至透析袋中于碳酸氢钠溶液(ph为8～9)中透析24h，再以去离子水为介质透析至无dmso异味，最后将透析袋内溶液冷冻干燥，得黑色疏松粉末即为peg-go-fa。(4)载阿霉素的功能化石墨烯(peg-go-fa)纳米粒(靶向纳米粒)的制备：取约3.6mg阿霉素，精密称定，用ph7.0的pbs缓冲液8ml溶解，与1.2mg载体材料peg-go-fa混匀，置于磁力搅拌器上，室温下以300r/min避光搅拌48h，经高分子超滤膜(≥100k)过滤，分别收集滤饼和滤液，滤饼反复以缓冲液冲洗即为阿霉素@peg-go-fa纳米粒,将产物于4℃保存。试验例1本发明实施例2制备的阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系与对比例1～3制备的阿霉素载药体系的载药量对比(1)用紫外光谱测定实施例2滤液中阿霉素的浓度，计算药物在阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系上的负载量；(2)用紫外光谱测定对比例1上清液中阿霉素的浓度，计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量；(3)用紫外光谱测定对比例2滤液中阿霉素的浓度，计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量；(4)用紫外光谱测定对比例3上清液中阿霉素的浓度，计算药物在多功能单层氧化石墨上的负载量；结果见表1。表1各载药体系载药量对比载药体系载药量阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系(实施例2)3.270mg/mg多功能单层氧化石墨载药体系(对比例1)0.470mg/mg功能氧化石墨载药体系(对比例2)0.512mg/mg阿霉素@peg-go-fa纳米粒(对比例3)2.440mg/mg由以上结果可知，本发明阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系的载药量相对于其他载药体系，有大幅度提升。试验例2本发明实施例2制备的阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系与对比例1～3制备的阿霉素载药体系的稳定性对比避光条件下，将各载药体系溶于水，在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃及70℃的水浴下，检测各载药体系水中阿霉素的含量，计算载药量的变化。结果见表2。表2各载药体系不同温度下载药量变化(单位：mg/mg)由以上结果可知，本发明阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系对温度非常稳定，在温度达到50℃以上后有小部分分解，对比例1～2的载药体系在温度达到40℃左右就明显分解，对比例3的载药体系则在20℃左右开始明显分解，其稳定性均远不如本发明。试验例3体外释药实验分别取ph值为5.5的释放介质溶解载药纳米粒并转移至透析袋中(截留分子量14000)，然后将密封的透析袋置于200ml的释放介质中，每组平行3个样品，在37℃，100次/min振荡的条件下进行普通纳米粒和本发明纳米粒(靶向纳米粒)的体外释放考察。于0.083、0.166、0.25、0.5、1、2、4、6、12h取1ml释放介质，并补充1ml新鲜介质。采用hplc测定药物浓度，计算药物累积释放量。结果见表3。表3不同载药体系随时间释药量对比由以上结果可知，本发明阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系释药速度快，见效时间短，30min内释药量可>90％，相较其他载药体系(对比例2载药体系在2h内释药量>90％)明显见效时间大大缩短。本发明具有如下有益效果：本发明阿霉素-氧化石墨烯纳米递药体系载药量大、稳定性强、释药时间短，见效速度快。本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。当前第1页12