本发明属于核/壳结构纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料及其制备和应用。
背景技术：
在世界范围内，癌症是人类死亡的主要原因。目前治疗癌症的方法有手术治疗、放疗和化疗，然而这些传统的治疗方法仍然存在缺陷。光热治疗是治疗癌症的一种新技术，具有精确性、可控性和高效性。该方法通过近红外光选择性照射肿瘤组织，使肿瘤区域产生热量，从而温度升高，导致癌细胞死亡。开发新型高效的光热治疗材料在肿瘤治疗中具有重要意义，与此同时，热疗联合放疗的临床协同效应是目前联合治疗研究最多的方向之一。热放疗增效的机制是处在乏氧、低ph环境的癌细胞对放射线不敏感，而热疗通过光热效果增加血流从而改善肿瘤组织氧供，进而增加肿瘤组织的放疗敏感性，同时热疗导致的癌细胞蛋白变性，能够阻碍dna放射损伤的修复，进一步加强治疗效果。因此，发展肿瘤热放疗的联合治疗成为提高肿瘤治疗效果的一种新趋势。
近年来纳米材料在生物医学领域尤其是在癌症的治疗方面得到了较多的研究。通过对纳米材料的合理设计，开发一种能够实现肿瘤联合治疗的新型、多功能纳米材料成为可能。介孔二氧化硅因其尺寸均一，具有大的比表面积、高的孔容、均匀可调的孔径、以及良好的生物相容性和表面易功能化等特点而被广泛研究。陈等人(chenf.etal.chem.asianj.2009,4,1809-1816)制备了包裹氧化铁的二氧化硅纳米颗粒，该纳米颗粒具有高度的制备可重复性，材料均一性，可用于t2磁共振成像。王等人(wangg.etal.nanoscale2014,6,2953-2963)通过一步法制备的水溶性超小氧化铁纳米颗粒，可用于t1磁共振成像。此外，在碱性和有氧的条件下，多巴胺可以自聚合形成聚多巴胺，并包裹在不同纳米物质表面，聚多巴胺具有近红外强吸收的特点而被广泛应用到光热治疗中。李等人(lid.etal.j.mater.chem.2016,4,4216-4226)制备的聚多巴胺包裹的金星纳米颗粒，具有很好的ct成像效果，并且在808nm近红外激光照射下对肿瘤具有优异光热治疗效果。
检索国内外文献发现，目前尚没有关于以一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料的制备方法研究的相关报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料及其制备和应用，本发明方法工艺简单，反应温和，易于操作分离，原料来源广泛，成本低廉，制备的纳米材料具备优异的生物相容性，具有良好的光热/放疗联合治疗效果，为联合治疗纳米材料的开发提供了一种新方法，应用前景广阔。
本发明的一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料，聚多巴胺包裹磁性介孔二氧化硅纳米材料为核/壳结构纳米颗粒，其中磁性介孔二氧化硅纳米材料为在中空介孔二氧化硅表面和内部负载超小的四氧化三铁纳米粒。
本发明的一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料的制备方法，包括：
(1)将中空介孔二氧化硅hmss溶解于溶剂中，超声分散，加入丙基三乙氧基硅烷aptes，在70-80℃的水浴中回流4h，离心，洗涤，得到氨基修饰的中空介孔二氧化硅hmss-nh2；
(2)将活化后的超小四氧化三铁fe3o4nps溶液加入hmss-nh2溶液中，搅拌反应2-4天，离心，洗涤，得到负载超小四氧化三铁的中空介孔二氧化硅纳米颗粒hmss-fe3o4nps；
(3)将多巴胺盐酸盐溶解在tris-hcl缓冲溶液中，加入hmss-fe3o4nps溶液，室温下敞口搅拌10-24h，离心，洗涤，得到聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅hmss-fe3o4/pdnps。所述步骤(1)中溶剂为乙醇；中空介孔二氧化硅hmss溶解于溶剂后的浓度为1-3mg/ml，优选浓度为2mg/ml。
所述步骤(1)中hmss和aptes的质量比例为98:0.42。
所述步骤(1)中离心为离心的速度为8500r/min，离心时间为10min。
所述步骤(2)中超小四氧化三铁fe3o4nps的粒径为2-3nm。
步骤(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)对超小四氧化三铁fe3o4nps进行活化；其中fe3o4nps、edc和nhs的质量比为160:134:65。
所述步骤(2)中hmss-nh2和活化前fe3o4nps的质量比为0.5-2:3，优选质量比为1:3。
所述步骤(2)、(3)中离心速度为6000r/min，离心时间为10分钟。
所述步骤(3)中tris-hcl缓冲溶液的ph＝8.5，缓冲溶液的浓度为0.05mm，体积为40～60ml。配置方法为三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液(50ml，0.1mol/l)与盐酸(14.7ml，0.1mol/l)均匀混合后，加水稀释至100ml。
所述步骤(3)中多巴胺盐酸盐溶解在tris-hcl缓冲溶液后的浓度为12mg/ml。
所述步骤(3)中hmss-fe3o4nps和多巴胺的质量比为0.5-2:3，优选质量比为1:3。
所述步骤(3)温下敞口搅拌24h。
本发明的一种聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料的应用，聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅hmss-fe3o4/pdnps在制备用于光热-放疗联合治疗和磁共振成像制剂中的应用。
hmss-fe3o4/pdnps生理盐水溶液对裸鼠4t1移植瘤具有很好的光热治疗功能，具体方法包括：将上述hmss-fe3o4/pdnps纳米材料分散在生理盐水中，通过瘤内注裸鼠，并用808nm的激光在肿瘤处照射5min。
所述中空介孔二氧化硅的制备方法见专利cn105561345a。
所述超小四氧化三铁的制备方法见专利cn106421823a。
本发明利用中空介孔二氧化硅的空腔和介孔结构，在其表面和内部负载超小的四氧化三铁纳米粒，用于磁共振成像；聚多巴胺有近红外吸收特性，在近红外808nm激光的照射下能实现其对肿瘤的光热治疗，根据热放疗增效原理，放疗的同时增加热疗效果，也能够明显地提高放疗效果。
本发明使用透射电子显微镜(tem)、电势粒径(dls)、热重分析(tga)等手段表征制备的聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米材料，随后测定材料的升温曲线和弛豫效应，然后利用cck-8细胞活力测试法来评价纳米材料的细胞毒性以及体外癌细胞光热治疗效果，最后进行体内肿瘤模型的升温曲线实验，考察hmss-fe3o4/pdnps纳米材料的体内热疗及放疗增敏效果。
有益效果
(1)本发明采用温和的反应条件制备了聚多巴胺包裹的负载超小四氧化三铁的中空介孔氧化硅纳米材料，制备方法简单，成本较低；
(2)本发明制备的聚多巴胺包裹的负载超小四氧化三铁的中空介孔氧化硅纳米材料具有光热治疗作用和磁共振成像效果，根据热疗增敏原理，联合放疗，协同增强，为肿瘤的联合治疗纳米材料的开发提供了参考。
附图说明
图1为本发明的反应示意图；
图2为实施例1中的hmss和hmss-nh2的zeta电势图；
图3为实施例1中的hmss-nh2(a1-a3)、hmss-fe3o4nps(b1-b3)和hmss-fe3o4/pdnps(c1-c3)颗粒的tem图；其中，a1-a3、b1-b3和c1-c3分别为不同放大比例；
图4为实施例1中的多巴胺盐酸盐和hmss-fe3o4/pdnps的紫外光谱图；
图5为实施例1中hmss-fe3o4nps和hmss-fe3o4/pdnps颗粒的热重分析图；
图6为实施例2中hmss-fe3o4/pdnps纳米材料在不同浓度下经808nm激光照射后的升温曲线图；
图7为实施例2中hmss-fe3o4/pdnps纳米材料在不同功率的808nm激光照射后的升温曲线图；
图8为实施例3中fe3o4nps和hmss-fe3o4/pdnps的t1弛豫时间的倒数随fe浓度变化的线性关系图；
图9为实施例4中hmss-fe3o4/pdnps在不同浓度下的细胞毒性测试结果；
图10为实施例5中hmss-fe3o4/pdnps和hmss-fe3o4/pdnps+激光与4t1细胞共培养12h后在细胞活力测试结果；
图11为实施例6中瘤内注射制备的hmss-fe3o4/pdnps纳米粒子和生理盐水到裸鼠肿瘤部位后的肿瘤部位的温度变化曲线；
图12为实施例7中裸鼠肿瘤体积随时间变化的曲线。第1组为注射生理盐水；第2组为注射hmss-fe3o4/pdnps纳米粒子；第3组为放射治疗；第4组为hmss-fe3o4/pdnps+激光；第5组为hmss-fe3o4/pdnps+激光+放射治疗；
图13为实施例7中裸鼠体重随时间的变化曲线。第1组为注射生理盐水；第2组为注射
hmss-fe3o4/pdnps纳米粒子；第3组为放射治疗；第4组为hmss-fe3o4/pdnps+激光；第5组为hmss-fe3o4/pdnps+激光+放射治疗；
图14为实施例7中裸鼠的存活率随时间变化的曲线。第1组为注射生理盐水；第2组为注射hmss-fe3o4/pdnps纳米粒子；第3组为放射治疗；第4组为hmss-fe3o4/pdnps+激光；第5组为hmss-fe3o4/pdnps+激光+放射治疗。
注：附图中的hmss-fe3o4@pdnps即为hmss-fe3o4/pdnps。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备hmss-fe3o4/pdnps纳米材料的具体过程如图1所示。
(1)将100mg中空介孔二氧化硅(hmss)溶于50ml乙醇中，逐滴加入丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在70-80℃油浴中回流4h，8500r/min下离心收集，超纯水洗3次，得到氨基修饰的中空介孔二氧化硅(hmss-nh2)。zeta电势测试结果表明：中空介孔二氧化硅表面成功修饰了氨基(图2)。
(2)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺活化后的超小四氧化三铁fe3o4nps溶液加入hmss-nh2溶液中，搅拌反应3天，离心收集并洗涤，得到超小四氧化三铁负载的中空介孔二氧化硅纳米颗粒hmss-fe3o4nps。tem测试结果表明：直径约为3nm的fe3o4nps负载到hmss-nh2纳米颗粒中(图3b1-b3)。
(3)将多巴胺盐酸盐溶解在ph＝8.5的tris-hcl缓冲溶液中，加入hmss-fe3o4nps,室温下敞口搅拌24h。离心收集洗涤得到聚多巴胺包裹的磁性介孔二氧化硅纳米颗粒hmss-fe3o4/pdnps(图3c1-c3)，可见在微球表面出现了明显的高分子层。多巴胺单体中含有苯环，从紫外光谱图中可以看出在280nm处有一个苯环b带的吸收峰(共轭体系与苯环振动叠加)，此外由于聚合之后的多巴胺影响了苯环骨架的振动，导致材料中多巴胺的吸收峰消失，从而证明多巴胺已成功聚合(图4)。热重测试结果表明：hmss-fe3o4nps表面成功修饰聚多巴胺，其上载量为17.2％(图5)。
实施例2
取实施例1中(3)所得产品用超纯水配制浓度为200μg/ml的母液，之后梯度稀释为100、50、20和10μg/ml的纳米材料，并对一系列浓度材料在808nm激光照射(输出功率1.2w/cm2，照射5min)，以等体积的超纯水作为空白对照。hmss-fe3o4/pdnps纳米材料升温性能测试结果表明：在试验浓度范围内，hmss-fe3o4/pdnps纳米材料表现出优异的光热转化效果，且随着纳米材料浓度的增加，温度升高的越明显(图6)。在相同浓度下(200μg/ml)，分别用输出功率为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2w/cm2的激光照射5min，观察温度变化情况，结果表明：随着输出功率的增加，温度升高的越明显(图7)。
实施例3
分别配制fe浓度为0,0.3，0.6，1.2和2.4mm的超小fe3o4nps及hmss-fe3o4/pdnps的水溶液1ml，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同fe浓度下的t1弛豫效应(图8)。通过计算得出fe3o4nps和hmss-fe3o4/pdnps的r1值分别为0.64和1.27mm-1s-1。表明超小氧化铁纳米粒被介孔氧化硅包覆后，具有增强的r1弛豫率，可用于增强的t1磁共振成像。
实施例4
通过cck-8细胞活力实验测定4t1细胞的活力来评价实施例1制备的hmss-fe3o4/pd纳米材料的细胞相容性。配制不同浓度的实施例1制备的hmss-fe3o4/pd纳米材料的生理盐水溶液。收集对数生长期4t1细胞，按照1×105个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，加入200μldmem培养基，细胞培养板置于co2浓度为5％和温度为37℃的环境中培养24h。弃掉培养基后，每孔更换180μldmem培养基，并分别添加20μl不同浓度hmss-fe3o4/pd纳米粒子(浓度为5、10、20、50、100、200和250μg/ml)和生理盐水(对照组)，每种浓度设定6个平行样。将细胞培养板继续放置在5％co2，37℃继续孵育24h。倒掉原有培养基并用无菌生理盐水清洗3遍，每孔加入20μlcck-8溶液，避光环境下37℃恒温培养4h。按顺序每孔吸取上层培养液100μl于96孔板中，在酶标仪上检测各孔在激发波540nm处的吸收值，吸收值的大小可以反映活细胞的数量(图9)。结果显示，与对照组相比，hmss-fe3o4/pd纳米颗粒在实验浓度为0到200μg/ml范围内对4t1细胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上，即使实验浓度高达200μg/ml，细胞存活率也在80％以上，但实验浓度高达250μg/ml时，细胞活力低于80％。在后续实验中不考虑此浓度，这充分说明hmss-fe3o4/pdnps在5～200μg/ml的浓度范围内具有良好的细胞相容性。
实施例5
以4t1细胞为模型细胞，在808nm激光照射下评价hmss-fe3o4/pd纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤作用。用无菌生理盐水溶液配置不同浓度的纳米材料，并用紫外照射杀菌过夜。将4t1细胞种植于96孔板(1×104细胞/孔)，在37℃和5％co2条件下过夜培养，贴壁后弃去培养基，再用含有实施例4中hmss-fe3o4/pdnps(浓度为5、10、20、50、100和200μg/ml)的培养基和和纯生理盐水(对照组)培养6小时，用生理盐水溶液洗涤3次，用808nm激光器照射(输出功率1.2w/cm2，照射5min)，未照射的细胞用作对照组。然后向培养板孔中加入20μlcck-8溶液，继续在37℃下培养4小时，在酶标仪上检测各孔在激发波长540nm处的吸收值，吸收值的大小可以反映活细胞的数量(图10)。结果表明随着浓度的增加，未照射的细胞仍然保持很高的细胞存活率；而经过激光照射5分钟，细胞表现出死亡趋势，并且随着浓度的增加，细胞的存活率越低，在浓度为200μg/ml时，仅有34.7％的细胞存活。该实验结果说明hmss-fe3o4/pd纳米粒子在近红外激光照射下能引起肿瘤细胞的死亡。
实施例6
为了探索hmss-fe3o4/pd纳米粒子在体内光热升温能力，将4t1荷瘤裸鼠麻醉后，直接瘤内注射hmss-fe3o4/pd的生理盐水溶液(200μg/ml，0.1ml)。接着，使用808nm激光照射(输出功率1.2w/cm2，照射5min)，并通过红外摄像机来评价体内肿瘤部位的热成像效果，同时以注射相同体积生理盐水溶液的裸鼠作为对照(图11)。结果表明，注射hmss-fe3o4/pd纳米粒子的裸鼠肿瘤部位的温度明显升高，达到了51.5℃，而此时注射生理盐水溶液的裸鼠的肿瘤部位的温度仅仅达到35.1℃。实验结果说明制备的hmss-fe3o4/pd纳米粒子能使肿瘤部位的温度升高，从而达到杀死肿瘤细胞的作用。
实施例7
将荷瘤的裸鼠分为五组，分别经过不同方式处理：第1组瘤内注射生理盐水(0.1ml)；第2组瘤内注射hmss-fe3o4@pdnps(实施例1)的生理盐水溶液(200μg/ml,0.1ml)但不经过激光照射和放射治疗；第3组单独的放射治疗；第4组瘤内注射hmss-fe3o4/pdnps(实施例1)的生理盐水溶液(200μg/ml,0.1ml)且经过808nm激光照射(输出功率1.2w/cm2，照射5min)；第5组瘤内注射hmss-fe3o4/pdnps(实施例1)生理盐水溶液(200μg/ml，0.1ml)且经过808nm激光照射后，再接受一次放射治疗。记录20天内小鼠的肿瘤体积(图12)、小鼠体重(图13)和40天内小鼠的存活率(图14)。结果表明：老鼠瘤内注射hmss-fe3o4/pdanps后经过808nm激光照射对老鼠肿瘤具有明显的光热治疗效果；放射治疗对老鼠肿瘤具有一定的抑制作用，而老鼠瘤内注射hmss-fe3o4/pdnps热疗后再放疗具有更突出的肿瘤治疗效果，即放疗和光热治疗能协同增强肿瘤治疗效果。证明本方法合成的hmss-fe3o4/pdnps能在小动物体内实现热放疗联合的协同增强治疗。