本发明涉及一种双靶向多肽-药物偶联物及其制备方法与抗肿瘤应用。
背景技术：
化学疗法作为一种系统的治疗方法，广泛应用于癌症的治疗，尤其是癌症转移过程中的治疗。然而，由于种种原因，传统的抗肿瘤药物往往存在难以治愈癌症的问题，其中，系统毒副作用和耐药性是化疗失败的两大关键因素。由于缺少选择性和肿瘤特异性，传统的抗肿瘤药物在使用过程中常常伴随着严重的毒副作用和肿瘤部位低吸收，为了减少系统毒性，通常不能按照最优剂量给药，这就使得临床治疗效果非常有限。多药耐药是化学疗法遇到的又一大障碍，能通过多种不同的机制使化疗药物失去疗效，例如减少细胞对药物的摄取、促进dna损伤修复、发起药物外排等。很多临床使用的抗肿瘤药物，如阿霉素，在面对耐药型肿瘤细胞时都会失去疗效。减少毒副作用和克服耐药性是化疗成功的关键，也是癌症治疗至今都面临的重大挑战。
靶向递药是癌症治疗的一种有效途径。根据肿瘤细胞特定的分子特征，例如蛋白质、酶、核酸等，利用分子靶向方法特异性地将药物靶向递送至肿瘤部位。在靶向载体的作用下，药物可以高效、高选择性地定位于肿瘤细胞，从而能够减少毒副作用，提高治疗指数。但是，耐药性仍然是分子靶向治疗中需要面对的一个难题。相比之下，亚细胞器靶向是一个可以绕过耐药性的有效途径。其中，线粒体作为细胞的能量工厂和细胞凋亡的调控中心，是克服肿瘤细胞耐药性的有效靶点，可以通过多种机制，包括抑制atp合成、激活细胞凋亡通路、损伤线粒体dna等增强抗肿瘤活性。然而，以线粒体为靶向的抗肿瘤策略目前还存在着一些挑战，例如药物在线粒体中的累积量低、肿瘤细胞和正常细胞非特异性药物摄取等。因此，发展一种新型的靶向递药体系，对于同时解决系统毒性和耐药性两大难题十分关键。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种双靶向多肽-药物偶联物。该偶联物实现了肿瘤细胞特异性药物递送和亚细胞水平药物控释。
为了降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒副作用，关键是实现肿瘤细胞特异性识别。十肽ap2h(ihghhiisvg)对肿瘤标志蛋白laptm4b第二胞外区多肽片段具有高特异性的亲和识别作用。根据本课题组之前发表的工作，ap2h不但能够特异性识别肿瘤细胞膜表面过表达的laptm4b蛋白，而且能够随laptm4b蛋白的动态转运进入细胞质。在ap2h的引导下，抗肿瘤药物阿霉素可以靶向递送至肿瘤细胞。由于肿瘤细胞对能量的需求更加旺盛，因此细胞内线粒体数量更多，并且线粒体膜携带更为显著的负电荷。此外，线粒体内有dna分布而线粒体dna缺少有效的修复机制，这就使得线粒体有望成为一个良好的药物作用靶点。综上考虑，利用线粒体靶向基团三苯基膦(tpp)实现线粒体靶向，尽管阿霉素通常累积于细胞核中，与tpp偶联之后有望定位于线粒体，从而引发新的药物作用机制，克服抗肿瘤药物的耐药性。
基于此，本发明设计了一种双靶向多肽-药物偶联物。
所述双靶向多肽-药物偶联物，其结构包括四个组成部分：
a)肿瘤特异性靶向多肽；b)抗肿瘤药物；c)线粒体靶向功能团；d)连接多肽与抗肿瘤药物的腙键；
其中，所述抗肿瘤药物与所述线粒体靶向功能团通过化学键相连；
所述肿瘤特异性靶向多肽适用于将所述偶联物靶向至肿瘤细胞，并以所述肿瘤细胞表面携带的标志蛋白laptm4b作为特异性靶标。
本发明所述肿瘤特异性靶向多肽的具体氨基酸序列无特别限制，凡是能够有效识别laptm4b，并能将其所连接的抗肿瘤药物靶向至表面携带laptm4b蛋白的肿瘤细胞即可。具体的，所述肿瘤特异性靶向多肽可为ap2h多肽，其氨基酸序列如下所示：ihghhiisvg(seqidno:1)。
所述抗肿瘤药物的种类不限，任何对肿瘤细胞具有杀伤作用的药物均适用于本发明。具体的，本发明中所述抗肿瘤药物可选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、甲氨蝶呤等抗肿瘤药物中的至少一种，优选阿霉素。
所述连接多肽与抗肿瘤药物的腙键可具有下式所示的结构：
其中，r为c1-c5的烷基，优选r为c2的烷基。
所述线粒体靶向功能团可选自三苯基膦(tpp)、d(klaklak)2等线粒体靶向配体中的任意一种，优选三苯基膦。
当所述肿瘤特异性靶向多肽为ap2h，所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述线粒体靶向功能团为tpp时，所述双靶向多肽-药物偶联物具有下式所示的结构：
本发明的另一个目的是提供上述双靶向多肽-药物偶联物的制备方法。
本发明所提供的制备方法包括下述步骤：
1)采用固相多肽合成法制备肿瘤特异性靶向多肽；然后在固相多肽合成树脂上通过琥珀酸酐原位衍生法在所述肿瘤特异性靶向多肽的氨基端修饰丁二酸手臂，然后通过fmoc-肼与羧基反应，引入fmoc保护的肼官能团，脱去fmoc(笏甲氧羰基)保护基后，将产物从树脂上裂解下来，得到肼衍生化的肿瘤特异性靶向多肽；
2)将所述抗肿瘤药物与所述线粒体靶向功能团通过化学反应相连接，得到线粒体靶向功能团修饰的抗肿瘤药物；
3)将所述肼衍生化的肿瘤特异性靶向多肽与线粒体靶向功能团修饰的抗肿瘤药物通过腙键进行偶联，得到所述双靶向多肽-药物偶联物。
上述步骤1)中，所述肿瘤特异性靶向多肽为ap2h多肽；所述肼衍生化的肿瘤特异性靶向多肽的制备方法具体如下：
a1)以fmoc-gly-wang树脂为起始原料，以20％六氢吡啶/dmf为脱保护试剂，n-甲基吗啡啉和hbtu为活化试剂，合成ap2h多肽序列；其中，所述fmoc-gly-wang树脂中甘氨酸键合量为0.698mmol/g；
b1)脱去所述ap2h多肽序列的fmoc保护基团，加入3倍摩尔量琥珀酸酐进行偶联反应，偶联结束后进行清洗，再分别加入3倍摩尔量fmoc-nh-nh2、hbtu(o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)和hobt(n-羟基苯并三氮唑)反应过夜；
c1)利用裂解液将ap2h-hydrazide从树脂上裂解下来，即得；其中所述裂解液由体积分数为95％三氟乙酸，2.5％水，2.5％三异丙基硅烷组成。
上述步骤2)中，所述抗肿瘤药物为阿霉素，所述线粒体靶向功能团为三苯基膦，所述线粒体靶向功能团修饰的抗肿瘤药物的制备方法如下：
a2)将三苯基膦溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入dcc(n,n'-二环己基碳酰亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)进行活化反应，得到活化后的三苯基膦；
b2)在三乙胺存在下，使阿霉素与活化后的三苯基膦在n,n-二甲基甲酰胺中进行偶联反应，得到三苯基膦修饰的阿霉素。
所述a2)中，三苯基膦、n,n'-二环己基碳酰亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.2:1.2。所述活化反应的条件为室温下磁子搅拌反应3小时。
所述b2)中，阿霉素与活化后的三苯基膦的摩尔比为1:1，所述三乙胺与阿霉素的摩尔比为1.1:1。所述偶联反应的条件为室温下磁子搅拌避光反应过夜。
本发明再一个目的是提供上述双靶向多肽-药物偶联物的应用。
本发明所提供的双靶向多肽-药物偶联物的应用包括下述方面：
1)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；
2)在制备治疗肿瘤化合物中的应用。
所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞(包括耐药性癌细胞)；所述癌细胞为肝癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、黑色素癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、宫颈癌细胞、鼻咽癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞或直肠癌细胞。
所述肝癌细胞具体可为hepg2；所述乳腺癌细胞具体可为乳腺癌阿霉素耐药细胞株mcf-7/adr以及乳腺癌细胞株mcf-7/wt。
本发明还有一个目的是提供一种治疗肿瘤的化合物。
本发明所提供的治疗肿瘤的化合物包括上述双靶向多肽-药物偶联物。
所述肿瘤包括实体瘤或非实体瘤；所述肿瘤具体可为肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、鼻咽癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌或直肠癌。
所述治疗肿瘤的化合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述化合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
以所述双靶向多肽-药物偶联物为活性成分制备的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明所提供的双靶向多肽-药物偶联物(pdc)由四部分构成：a)肿瘤特异性靶向多肽ap2h；b)抗肿瘤药物dox；c)线粒体靶向功能团tpp；d)连接多肽与抗肿瘤药物的腙键。tpp通过酰胺键与dox偶联，多肽通过腙键与抗肿瘤药物偶联，ph敏感性腙键能够响应酸性环境，实现药物控释。利用固相多肽合成操作简单、合成高效的优点，在固相多肽合成树脂上通过琥珀酸酐原位衍生法在ap2h氨基端修饰丁二酸手臂，然后通过fmoc-肼与羧基反应，脱去fmoc保护基后得到肼衍生化的ap2h多肽。经过多肽裂解与纯化后，ap2h-hydrazide与tpp-dox通过ph敏感性腙键相偶联，经过液相色谱纯化后，得到纯品pdc，产率为21％。本发明通过整合分子靶向、细胞器靶向和ph敏感性化学键，实现了肿瘤细胞特异性识别和细胞器靶向递药。
在本发明的工作中，通过改变抗肿瘤药物的递送路径和亚细胞分布，使抗肿瘤药物同时能够克服系统毒性和耐药性。在靶向亲和多肽的作用下，经过合理设计得到的双靶向多肽-药物偶联物pdc能够特异性识别并结合肿瘤细胞，并能够通过靶向多肽介导的内吞机制进入肿瘤细胞。尽管dox通常累积于细胞核中，双靶向多肽-药物偶联物pdc能够进入溶酶体并最终定位于线粒体。将分子靶向和细胞器靶向相结合不但能够增加药物在肿瘤细胞中的选择性摄取，而且能够将dox的药物作用位点转移至线粒体，由于耐药型肿瘤细胞对线粒体损伤比较敏感，pdc能够破坏线粒体中的氧化还原电势，切断能量物质atp的合成，从而克服耐药性杀伤肿瘤细胞。活体动物实验结果表明，pdc能够在活体动物肿瘤组织中靶向富集，表现出了很好的肿瘤抑制效果，并且没有毒副作用。
附图说明
图1为pdc的反应流程图。
图2为ap2h-hydrazide的液相色谱图。
图3为ap2h-hydrazide的质谱图。
图4为tpp-dox的液相色谱图。
图5为tpp-dox的质谱图。
图6为pdc的液相色谱图。
图7为pdc的质谱图。
图8为(a)pdc在ph7.4,ph6.0和ph5.0下的药物释放曲线；(b)肿瘤细胞(hepg2,mcf-7/wt和mcf-7/adr)和正常细胞(hek293)经dox,pdc和tpp-dox孵育后的激光共聚焦成像结果，比例尺：20μm(c)hepg2细胞与细胞核染料hoechst(蓝色荧光)共染实验，细胞分别用dox、hoechst或pdc、hoechst共染，比例尺：20μm。
图9为pdc,dox和tpp-dox对肿瘤细胞(hepg2,mcf-7/wt和mcf-7/adr)和正常细胞(hek293)的杀伤性能实验；每组柱形图中从左至右依次为hepg2,mcf-7/wt、mcf-7/adr、hek293。
图10为(a)不同细胞经pdc处理前后线粒体膜电位的激光共聚焦成像结果；(b)不同细胞与pdc孵育18小时后线粒体膜电位变化情况。
图11为不同细胞与pdc孵育18小时后atp含量变化情况。
图12为pdc经尾静脉注射后活体成像实验和抑瘤效果实验(a,b)pdc的活体成像和组织成像，黄色圈内为肿瘤区域(c)pdc的肿瘤抑制效果分析(d)给药过程中裸鼠的体重变化(e-h)给药后(e)pbs组(f)pdc组(g)dox组(h)tpp-dox组裸鼠肿瘤组织的h&e染色分析，比例尺：100μm。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
fmoc-gly-wang树脂购自吉尔生化(上海)有限公司
fmoc-aa-oh购自siam公司
fmoc-nh-nh2购自百灵威科技有限公司
dmf：n,n-二甲基甲酰胺购自北京博迈杰科技有限公司
hbtu：o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐购自吉尔生化(上海)有限公司
hobt：n-羟基苯并三氮唑购自siam公司
tfa：三氟乙酸购自百灵威科技有限公司
tis：三异丙基硅烷购自thermofisherscientific公司
tpp：三苯基膦购自阿拉丁科技有限公司
dcc：n,n'-二环己基碳酰亚胺购自siam公司
nhs：n-羟基琥珀酰亚胺购自sigma-aldrich公司
发明人针对肿瘤相关蛋白——溶酶体四次穿膜蛋白(laptm4b)，以选择性识别laptm4b蛋白的ap2h多肽(ihghhiisvg)为靶向功能基团，以广谱抗癌药阿霉素(dox)为模式药物，选择线粒体作为阿霉素的作用靶点，利用线粒体靶向基团三苯基膦(tpp)实现线粒体靶向，以ph敏感性腙键偶联阿霉素和靶向肽，设计并成功构建了双靶向多肽-药物偶联物，具体如下：
实施例1、双靶向多肽-药物偶联物pdc的合成
按照图1的反应流程图进行制备。
合成ap2h-hydrazide
采用fmoc固相合成策略手动合成。以fmoc-gly-wang树脂(甘氨酸键合量为0.698mmol/g)为起始原料，以20％六氢吡啶/dmf为脱保护试剂，n-甲基吗啡啉和hbtu为活化试剂。
ap2h多肽序列具体合成步骤为：将称好的fmoc-gly-wang树脂装入砂芯漏斗，用dmf溶胀30分钟，之后用dmf洗涤三次。按30ml/g树脂的比例加入20％六氢吡啶/dmf溶液，磁子搅拌5分钟后抽干，重复两次，脱掉fmoc保护基。用dmf洗涤树脂六次，每次搅拌1分钟，抽干10秒。用0.4mol/l的n-甲基吗啡啉/dmf溶液溶解fmoc-aa-oh与hbtu、hobt的混合物，将活化后的氨基酸溶液加入到树脂中，磁子搅拌反应2小时后，进行kaiser检测，树脂不变蓝紫色表明反应完全，否则延长反应时间，或重复偶联反应一次，然后用dmf洗涤树脂六次。重复上述步骤，以完成多肽链的延长，完成ap2h多肽序列(ihghhiisvg)的合成后，脱掉肽链氨基末端fmoc保护基。
ap2h多肽序列合成好之后，脱去fmoc保护基团，加入3倍摩尔量琥珀酸酐，偶联结束后进行清洗，加入3倍摩尔量fmoc-nh-nh2、hbtu和hobt反应过夜，反应结束后脱去fmoc保护基团，利用新鲜配制的裂解液(95％tfa,2.5％h2o,2.5％tis，v/v/v)将ap2h-hydrazide从树脂上裂解下来，得到的粗产品用岛津半制备液相色谱进行纯化，纯品用液相色谱和质谱进行表征。结果见图2、图3。
合成tpp-dox
tpp(45mg,0.10mmol)置于25ml圆底烧瓶中，加入10ml无水dmf，搅拌直至完全溶解，dcc(25mg,0.12mmol)和nhs(14mg,0.12mmol)加入圆底烧瓶中，搅拌反应3h后，过滤除去dcu，收集滤液。阿霉素dox(60mg,0.10mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入15ml无水dmf搅拌溶解，三乙胺(15μl,0.11mmol)逐滴加入圆底烧瓶中。然后将收集的已活化的tpp滤液逐滴加入盛有dox溶液的圆底烧瓶中，室温下避光反应过夜。粗产品用岛津半制备液相色谱进行纯化，纯品用液相色谱和质谱进行表征。结果见图4、图5。
合成pdc
ap2h-hydrazide(1.18mg,1μmol)和tpp-dox(1.05mg,1.2μmol)置于5ml密封容器中，加入400μl无水dmso，于室温下避光反应过夜。反应液用岛津半制备液相色谱进行纯化，冻干后得到纯品呈红色粉末状，纯品用液相色谱和质谱进行表征。结果见图6、图7。
实施例2、双靶向多肽-药物偶联物pdc的性能考察
1、荧光检测
dox,tpp-dox和pdc分别溶解于dmso配成浓度为2mm的母液，取10μl母液用pbs稀释至1ml，于日立f-4600荧光仪上进行荧光光谱检测，激发波长为498nm，记录510-900nm范围内的荧光发射光谱。
2、ph敏感性药物释放动力学
为了考察溶液状态下pdc的ph敏感性药物释放过程，分别用ph7.4,ph5.0和ph6.0三种不同ph的pbs将pdc母液稀释至10μm，于37℃避光孵育，分别于不同的时间点(0,1,2,3,4,9,12,24,36和48h)取出100μl溶液，使用液相色谱对药物释放过程进行监测。
以ph7.4的磷酸缓冲盐模拟正常生理环境，在该条件下，随着孵育时间延长pdc的含量基本保持不变，tpp-dox的释放量几乎可以忽略，说明pdc在正常的生理环境下十分稳定。以ph5.0的磷酸缓冲盐模拟细胞中内涵体-溶酶体的酸性微环境，随着孵育时间延长，pdc对应的色谱峰逐渐变小，tpp-dox对应的色谱峰逐渐变大，这些结果表明pdc在酸性环境中可以成功释放药物tpp-dox。根据药物释放曲线图8(a)可知，经过48小时孵育pdc的药物释放效率可以达到68％。pdc在正常生理环境下的稳定性和ph敏感性药物释放可以使药物集中释放于肿瘤细胞，而不会提前释放于非肿瘤部位，从而可以提高肿瘤细胞的局部药物浓度，最终能够高效地特异性杀伤肿瘤细胞。
以ph6.0的磷酸缓冲盐模拟肿瘤酸性微环境，相比于pdc在ph5.0条件下的药物释放过程，当ph值升高时pdc的药物释放速率明显变慢，经过48h孵育后药物释放效率达到26％，这些结果表明pdc对环境的ph变化十分敏感，并且能够对肿瘤的特征性酸性微环境做出响应。通过识别肿瘤标志物laptm4b蛋白和肿瘤部位的特征性酸性微环境，pdc具有杰出的靶向能力，能够高特异性地在肿瘤部位进行药物控释。
3、pdc的肿瘤细胞特异性摄取
细胞种植在35mm玻璃底共聚焦皿中，细胞密度约为1.0×105/ml，培养过夜使细胞贴壁。除去培养液，分别用dox,tpp-dox和pdc溶液(500μl,20μm)与细胞孵育，孵育过后，用pbs清洗3次。荧光共聚焦成像实验所使用的仪器是fv1000-ix81clsm(奥林巴斯，日本)，物镜为uplsapo100倍油镜，成像及数据分析软件是fv10-asw。共染实验中，与pdc孵育后的细胞再分别与mitotracker,lysotracker和hoechst33342孵育，孵育过后，用pbs清洗3次，进行荧光共聚焦成像。pdc,dox和tpp-dox由fv5-lamar488nm激光器进行激发，收集窗口波长范围为570-670nm。mitotracker和lysotracker由fv5-lamar488nm激光器进行激发，收集窗口波长范围为500-550nm。hoechst33342由50mw,405nm的激光器fv5-ld405-2进行激发，收集窗口波长范围为425-475nm。
阿霉素能够发射红色荧光，因此可以通过激光共聚焦成像考察pdc在细胞中的摄取情况。将pdc,tpp-dox和dox分别与肿瘤细胞hepg2和正常细胞hek293孵育，如图8所示，dox在hepg2细胞和hek293细胞中都呈现出明亮的红色荧光，结果表明dox非特异性地进入肿瘤细胞和正常细胞，与细胞核染料hoechst33342共染结果表明dox的荧光信号分布于细胞核中。pdc在细胞摄取和亚细胞分布上与dox有显著不同，红色荧光只分布于肿瘤细胞hepg2中，正常细胞hek293未发现任何红色荧光，说明pdc对肿瘤细胞具有高特异性识别作用，能够选择性进入肿瘤细胞。
此外，荧光成像结果表明，与dox的亚细胞分布结果不同，pdc不再分布于肿瘤细胞的细胞核中，而是定位于细胞质。没有ap2h多肽的靶向作用，tpp-dox也是非特异性地同时进入肿瘤细胞hepg2和正常细胞hek293，此外，tpp-dox在hepg2中的荧光信号强度与pdc相比非常弱，这些结果表明，pdc中的亲和多肽ap2h特异性识别肿瘤细胞膜表面的laptm4b蛋白从而能够实现选择性进入肿瘤细胞，此外，ap2h多肽的靶向识别作用也进一步促进了pdc通过laptm4b蛋白介导的内吞作用选择性进入肿瘤细胞。
将pdc,tpp-dox和dox分别与阿霉素耐药型肿瘤细胞mcf-7/adr和普通野生型肿瘤细胞mcf-7/wt孵育，与在hepg2细胞中的分布相似，dox能够进入mcf-7/wt细胞，累积于细胞核中，而在mcf-7/adr细胞中则几乎观察不到红色荧光，红色荧光仅仅分布于细胞外周，说明dox会被mcf-7/adr细胞排斥，只能非特异性地滞留于细胞膜上。经pdc孵育后，在mcf-7/adr细胞和mcf-7/wt细胞的细胞质中都能观测到明亮的红色点状荧光，pdc在两种细胞中的亚细胞分布行为几乎相同，在mcf-7/adr细胞中的信号强度也并没有减弱。tpp-dox在mcf-7/adr细胞中也表现出了很强的细胞膜滞留。这些结果表明，pdc能够成功进入耐药型肿瘤细胞，这就为有效杀伤耐药型肿瘤细胞提供了保障。
4、pdc对肿瘤细胞的靶向杀伤性能
肿瘤细胞杀伤性能采用标准mtt法进行考察。将细胞种在96孔板中，密度约为每孔5000个细胞，孵育24h使细胞贴壁，除去细胞培养液，分别加入dox,tpp-dox和pdc溶液，37℃孵育48h，孵育结束后除去原有溶液，每孔加入100μl新鲜配制的mtt溶液(0.5mg/ml,由培养液稀释)，孵育4h后除去mtt溶液，每孔加入150μldmso使蓝紫色甲瓒结晶完全溶解，使用酶标仪(moleculardevices,spectramaxi3,sunnyvale,usa)测量570nm处的吸光度，细胞存活率(vr)的计算公式为：vr＝a/a0×100％，其中a为实验组的吸光度值，a0为没有加药物的未处理细胞组的吸光度值。所有的数据均来自3次平行实验。
如图9所示，dox和tpp-dox非特异性地杀伤肿瘤细胞hepg2和正常细胞hek293，两种细胞的存活率都在20％以下。这与激光共聚焦实验中dox和tpp-dox非特异性地进入肿瘤细胞和正常细胞的结果相吻合。dox和tpp-dox对正常细胞的高杀伤性能会带来严重的毒副作用，与之相比，pdc对肿瘤细胞hepg2的杀伤效率能够达到83％，而正常细胞hek293则不受任何影响，与pdc孵育48h后hek293的细胞存活率仍在97％以上。在靶向亲和多肽ap2h的作用下，pdc能够高特异性杀伤肿瘤细胞，而不会对正常细胞造成损伤，从而可以靶向治疗癌症，降低毒副作用，提高治疗指数。
此外，还考察了pdc对耐药型肿瘤细胞的杀伤性能，面对阿霉素耐药型肿瘤细胞mcf-7/adr，dox和tpp-dox的杀伤性能都显著下降，与dox和tpp-dox孵育后，mcf-7/wt细胞的存活率仅为20％，而mcf-7/adr细胞的存活率仍然分别有66％和53％。由此可见，面对阿霉素耐药型肿瘤细胞，dox和tpp-dox的杀伤性能下降至原来的三分之一以下。与之相比，pdc对mcf-7/adr细胞和mcf-7/wt细胞保持了同等水平的杀伤能力，可以无区别地杀伤耐药型肿瘤细胞，这些结果与pdc,tpp-dox和dox的细胞摄取行为相一致。dox和tpp-dox在mcf-7/adr中的低细胞摄取率导致其细胞杀伤性能大大降低。由于具有多靶向功能，pdc的细胞摄取及内吞路径与dox有所不同，因而能够在耐药细胞mcf-7/adr中累积，从而能够克服耐药性杀死耐药细胞。
5、pdc的肿瘤细胞杀伤机制
由于线粒体功能对耐药型肿瘤细胞的生存十分重要，我们进行了细胞线粒体功能的考察，以研究pdc的肿瘤细胞杀伤机制。
线粒体膜电位，指示着线粒体的健康状态，采用线粒体膜电位染料试剂盒(sigma-aldrich公司)对线粒体膜电位进行研究。该线粒体膜电位染料能够在正常的线粒体中聚集，使荧光增强。在损伤的线粒体中，线粒体膜电位遭到破坏，使荧光减弱。具体实验操作如下，首先将细胞与pdc共孵育，孵育结束后，用pbs清洗，加入线粒体膜电位染料孵育60min，然后加入50μlbufferb孵育30min，最后进行激光共聚焦成像。线粒体膜电位染料由635nm激光器进行激发，收集窗口波长范围为660-760nm。
如图10所示，未经pdc处理时，在肿瘤细胞(hepg2,mcf-7/wt和mcf-7/adr)中能观测到线粒体膜电位染料的红色荧光，说明此时肿瘤细胞的线粒体非常健康。与pdc孵育之后，肿瘤细胞中线粒体膜电位染料的红色荧光大大减弱，说明此时线粒体膜电位遭到了破坏。根据荧光定量实验结果，与pdc孵育18h后，肿瘤细胞hepg2,mcf-7/wt和mcf-7/adr中线粒体膜电位染料的荧光强度分别下降至原来的13％,32％和35％，而正常细胞hek293中线粒体膜电位染料的荧光强度则基本保持不变，说明pdc会对肿瘤细胞的线粒体造成损伤，破坏线粒体膜电位，影响电子传递链和氧化磷酸化，而正常细胞则不受影响。
线粒体是细胞的能量工厂，考虑到这一点，还考察了pdc对细胞内atp含量的影响。使用一种商品化atp检测试剂盒(beyotime公司)进行细胞内atp含量的检测。具体实验操作如下，将细胞种植在6孔板中，培养过夜使细胞贴壁，然后将细胞与pdc溶液(1ml,20μm)共孵育，孵育结束后，除去pdc溶液，用细胞裂解液将细胞裂解，收集细胞裂解液，12000rpm离心5min，收集上清液，预先在离心管中加入100μlatp检测液，然后加入100μl上清液，使用酶标仪(moleculardevices,spectramaxi3)测量化学发光的相对强度。对照组细胞除不加pdc孵育外其余处理步骤同上。
如图11所示，经pdc孵育18h后，hepg2细胞内的atp含量下降了71％，说明pdc影响了肿瘤细胞内的atp合成。经pdc处理后，mcf-7/wt和mcf-7/adr细胞中的atp含量分别下降了80％和78％。这些实验结果表明，无论是普通肿瘤细胞还是耐药型肿瘤细胞，pdc都能够影响其atp合成。
基于以上实验结果，可以总结出pdc的靶向药物递送和肿瘤细胞杀伤的整个过程。首先，pdc中的靶向亲和多肽ap2h与细胞膜上的肿瘤标志蛋白laptm4b相互作用，从而使pdc特异性识别并结合肿瘤细胞。然后通过受体介导的细胞内吞，使pdc进入细胞并运送至溶酶体。在溶酶体的酸性环境中pdc的ph敏感性腙键断裂，释放药物tpp-dox，tpp-dox从溶酶体中逃逸出来，在靶向基团tpp的作用下定位至线粒体。最后，dox对线粒体造成损伤，dox能够产生活性氧物种(ros)，扰动电子传递链，抑制atp合成。另外，dox还有可能与线粒体dna或拓扑异构酶ii结合，造成损伤，影响线粒体dna的复制。肿瘤细胞产生耐药性的其中一个主要机制是p-gp介导的药物外排，由于具有多靶向功能，pdc能够有效地绕过与p-gp的相互作用，因此无论是野生型还是耐药型肿瘤细胞中都能累积同等水平的药物量，此外，pdc损伤线粒体，造成线粒体功能紊乱，能够减少肿瘤细胞的能量供给，抑制p-gp药物外排。综上，无论是野生型肿瘤细胞还是耐药型肿瘤细胞，pdc都能够通过损伤线粒体实现特异性杀伤。
6、pdc的活体肿瘤靶向和抑瘤效果分析
构建了hepg2移植瘤模型，进行了活体动物实验，考察了pdc在活体中的肿瘤靶向和抑瘤效果。
选取5-6周大的balb/c雌性裸鼠，于右侧腹皮下种植hepg2细胞(3×107/ml,200μl)，待肿瘤体积达到50mm3后，20只裸鼠随机分成4组，分别通过尾静脉注射200μlpbs,pdc,dox和tpp-dox溶液(20μm)，每隔一天进行一次尾静脉注射给药，给药当天测量裸鼠体重和肿瘤体积，肿瘤体积根据如下公式进行测量和计算：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。18天后处死裸鼠，解剖收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，保存于福尔马林中，进行组织病理学分析。
选取5-6周大的balb/c雌性裸鼠，于右侧腹皮下种植hepg2细胞(3×107/ml,200μl)，待肿瘤体积达到50-60mm3后，分别通过尾静脉注射pbs,pdc和dox溶液，90min后使用小动物活体成像系统(perkinelmer,spectrumct,boston,usa)进行活体荧光成像，然后将裸鼠处死，解剖收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，进行离体组织荧光成像。
药物能够在肿瘤部位累积是实现抗肿瘤效果的前提，因此，进行了活体动物荧光成像实验考察药物在活体中的肿瘤靶向递送情况。如图12所示，尾静脉注射pdc的荷瘤裸鼠进行活体荧光成像时能够看到在肿瘤部位有很强的荧光发射，说明pdc能够在活体动物的肿瘤组织中靶向富集。注射了dox的裸鼠肿瘤部位的荧光信号很弱，同时在裸鼠身体其他部位也能观测到荧光，说明dox并不能特异性识别肿瘤细胞、无法在肿瘤部位靶向富集。将裸鼠处死、解剖，将裸鼠组织进行荧光成像，能够观测到注射了pdc的裸鼠肿瘤组织中有非常强的荧光信号，而在心、肝、脾、肺、肾中则未观测到荧光。这些结果进一步证明，pdc在活体动物中也具有很好的肿瘤靶向功能。
监测肿瘤体积，考察了pdc对肿瘤的抑制效果。如图12所示，在给药期间，pbs组裸鼠的肿瘤体积由50mm3迅速增长为535mm3，而pdc组裸鼠的肿瘤生长速度则显著降低，且肿瘤体积明显较小，平均肿瘤体积只有243mm3，比pbs组小了55％。dox仅仅表现出了中等的肿瘤抑制效果，肿瘤体积比pbs组缩小了41％，tpp-dox几乎没有肿瘤抑制效果，原因可能是tpp-dox并没有肿瘤靶向和富集能力并且在肿瘤细胞中的摄取量比较低。在靶向基团的作用下，pdc表现出了非常好的肿瘤靶向性和穿透性，具有很好的肿瘤抑制效果。
监测裸鼠的体重，以此来评价药物的系统毒性。经pdc给药后，裸鼠的体重基本没有发生变化，说明pdc的系统毒性很低。进一步通过苏木精伊红染色法进行组织病理学分析，考察pdc的生物相容性，结果显示，在肿瘤组织的切片中能观察到明显的细胞损伤和细胞凋亡，而在心、肝、脾、肺、肾的组织切片中，则并没有观察到明显的病理学变化和损伤，这些结果表明pdc在血液循环过程中几乎没有毒副作用，具有非常好的生物相容性。
在本发明的工作中，通过改变抗肿瘤药物的递送路径和亚细胞分布，使抗肿瘤药物同时能够克服系统毒性和耐药性。在靶向亲和多肽的作用下，经过合理设计得到的双靶向多肽-药物偶联物pdc能够特异性识别并结合肿瘤细胞，并能够通过靶向多肽介导的内吞机制进入肿瘤细胞。dox分布于细胞核，而pdc能够进入溶酶体并最终定位于线粒体。将分子靶向和细胞器靶向相结合不但能够增加药物在肿瘤细胞中的选择性摄取，而且能够将dox的药物作用位点转移至线粒体，由于耐药型肿瘤细胞对线粒体损伤比较敏感，pdc能够破坏线粒体中的氧化还原电势，切断atp供给，从而克服耐药性杀伤肿瘤细胞。活体动物实验结果表明，pdc能够在活体动物肿瘤组织中靶向富集，表现出了良好的肿瘤抑制效果，并且未见显著毒副作用。该双靶向多肽-药物偶联物为新型抗肿瘤药物的设计和应用提供了新思路。
序列表
<110>中国科学院化学研究所
中国科学院大学
<120>一种双靶向多肽-药物偶联物及其制备方法与抗肿瘤应用
<130>gnczj180779
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>10
<212>prt
<213>artificialsequence
<400>1
ilehisglyhishisileileservalgly
1510