本发明属于细胞移植技术领域，具体涉及一种用于细胞移植的迷你植片及其制备方法。
背景技术：
角膜病是我国第二大致盲性眼病，据统计全国有单眼和双眼角膜盲人约400-500万，其中由于各种原因导致的角膜内皮失代偿患者占有相当比例。角膜内皮是一层六角形的细胞，通过屏障和泵的功能维持角膜的透明度和厚度。成年人类角膜内皮细胞一旦受损，再生能力就会受到限制。当细胞密度在临界水平下降(约400～700个/mm2)，将导致角膜内皮功能失代偿。
角膜移植，包括穿透性角膜移植术，后弹力层剥离的角膜内皮移植术和后弹力层角膜内皮移植术，但是由于人类供体角膜短缺目前无法满足临床要求，研究者们正在进行体外培养角膜内皮细胞移植。传统细胞移植方法一般涉及细胞载体协助移植，如羊膜，胶原蛋白等，手术方式采用穿透性角膜移植术或角膜内皮移植术，要同时考虑到载体的安全性和透明性，角膜内皮细胞片制备也曾尝试用温敏培养皿，但要完整的单层剥离和移植的难度较大。直接注射体外培养角膜内皮的单细胞进入前房会破坏角膜内皮细胞间原有的结构，细胞移植后并不是都附着在角膜后弹力层，而且细胞在体内要重新形成连接，发挥功能较慢。因此能将培养性状良好的细胞移植给需要的患者改善角膜状况尤为重要。但是目前如何将脆弱的细胞单层移植到前房是该技术的难点，这就对移植细胞的完整度有一定要求。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于细胞移植的迷你植片及其制备方法，使所述迷你植片中的细胞不会产生生理损伤，从而有效改善角膜状况。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于细胞移植的迷你植片，由包括以下步骤制备得到：将融合率达到80％～90％的单层角膜内皮细胞在消化酶的作用下酶解5～15min，得到细胞植片。
所述消化酶包括accutase细胞消化液或胰酶；
优选的，将角膜内皮细胞在accutase细胞消化液作用下酶解10～15min。
优选的，所述角膜内皮细胞与accutase细胞消化液的作用比例为每30mm2的细胞加入1.5～2.5ml消化液；所述accutase细胞消化液的比活力为≥200u/ml。
优选的，所述酶解的温度为36.5～37.5℃。
优选的，所述酶解的ph值为7.2～7.4。
优选的，将内皮细胞在胰酶作用下酶解5～10min。
优选的，所述角膜内皮细胞与胰酶的作用比例为每30mm2的细胞加入1～2ml消化液；所述胰酶的质量体积比为0.05。
优选的，所述酶解的温度为36.5～37.5℃。
优选的，所述酶解的ph值为7.2～7.4。
本发明提供了所述方法制备的用于细胞移植的迷你植片，其特征在于，所述迷你植片含有4～10个细胞。
本发明提供了一种用于细胞移植的迷你植片的制备方法，包括以下步骤：将融合率达到80％～90％的角膜内皮细胞在消化酶的作用下酶解5～15min，得到迷你植片。本发明采用消化酶不会对单层细胞造成生理损伤，保持迷你植片上的细胞连接不被破坏，保证移植后迅速贴附于移植面并快速发挥细胞功能。
本发明提供的所述方法制备的用于细胞移植的迷你植片，所述迷你植片含有4～10个细胞。所述迷你植片能有效缩短角膜恢复健康的时间，表明迷你植片移植方法有效提高患者康复的速度。
附图说明
图1为术后6小时贴壁率比较结果，其中图1-单细胞表示单细胞移植后细胞贴壁情况，图1-迷你植片表示迷你植片移植后细胞贴壁情况；
图2为单细胞和迷你植片移植后细胞连接形成情况，其中图2-单细胞表示单细胞移植后细胞连接形成情况，图2-迷你植片表示迷你植片移植后细胞连接形成情况；
图3为单细胞和迷你植片移植1天和1周后角膜透明度效果的图片。
具体实施方式
本发明提供了一种用于细胞移植的迷你植片的制备方法，包括以下步骤：将融合率达到80％～90％的单层角膜内皮细胞在消化酶的作用下酶解5～15min，得到细胞植片。
本发明对所述单层角膜内皮细胞的培养方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养方法即可。所述单层角膜内皮细胞的融合率优选为85％。
在本发明中，所述消化酶包括accutase细胞消化液或胰酶。将角膜内皮细胞在accutase细胞消化液作用下酶解10～15min。所述角膜内皮细胞与accutase细胞消化液的作用比例为每30mm2的细胞加入1.5～2.5ml消化液；更优选为2ml。所述accutase细胞消化液的比活力为≥200u/ml，更优选为200u/ml。所述酶解的温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃。所述酶解的ph值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。采用上述方法制备的角膜内皮细胞的细胞植片含有4～10个细胞。本发明对所述accutase细胞消化液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的所述accutase细胞消化液即可。本发明实施例中，所述accutase细胞消化液购自sigma公司。
在本发明中，将角膜内皮细胞在胰酶作用下酶解5～10min。所述角膜内皮细胞与胰酶的作用比例为每30mm2的细胞加入1～2ml消化液,更优选为1.5ml；所述胰酶的质量体积比为0.05。所述酶解的温度优选为36.5～37.5℃，更优选为37℃。所述酶解的ph值优选为7.2～7.4，更优选为7.3。采用上述方法制备的上皮细胞的细胞植片含有4～10个细胞。本发明对所述胰酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的胰酶来源即可。在本发明实施例中所述胰酶购自sigma公司。
在本发明中，所述迷你植片的移植方法，优选包括以下步骤：
1)将上述方案得到的迷你植片经离心，收集沉淀；
2)将所述步骤1)中的沉淀重悬，得到迷你植片细胞悬液；
3)将麻醉后的动物先刮除其自体的角膜内皮细胞，冲洗前房3～4次；
4)用注射器将迷你植片细胞悬液自角膜缘注射到前房内，术后保持眼朝下位3小时；
所述步骤1)～2)和3)之间没有时间顺序的限制。
本发明将上述方案得到的迷你植片经离心，收集沉淀。所述离心的转速优选为1300～1800rpm/min，更优选为1500rpm/min。所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。所述离心的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。
得到沉淀后，本发明将所述沉淀重悬，得到迷你植片细胞悬液。本发明对所述重悬的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重悬方法即可。所述重悬用溶液优选为高糖dmem培养基。所述沉淀与重悬用溶液的比例为每200～300ul培养基中重悬2.5×105～3.5×105个细胞。
本发明将麻醉后的动物先刮除其自体的角膜内皮细胞，冲洗前房3～4次。所述刮除其自体的角膜内皮细胞的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的刮除方法即可。所述冲洗用溶液优选为pbs溶液。所述pbs溶液的浓度优选为8～12mmol/l，更优选为10mmol/l。所述pbs溶液的ph值优选为7.2～7.4，更优选7.3。本发明对所述冲洗的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的冲洗方案即可。
得到迷你植片细胞悬液后，本发明用注射器将迷你植片细胞悬液自角膜缘注射到前房内，术后保持眼朝下位3小时。在本发明中，所述注射的方法优选穿刺隧道的方法进行注射。本发明对所述穿刺隧道的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的穿刺隧道的方法即可。
本发明优选对迷你植片移植后的效果进行功能检测。所述功能检测包括细胞贴壁率检测和细胞连接检测。所述细胞贴壁率检测的方法，优选包括以下步骤：迷你植片注射后6小时取角膜组织加入体积浓度为4％甲醛溶液中固定，铺片后加入100ng/ml的dapi染色10min，流水冲洗，滤纸吸除多余水分，将染色后的角膜组织置于荧光显微镜下观察，统计弹力层贴附的内皮细胞数。所述细胞连接检测的方法，优选包括以下步骤：迷你植片注射后48小时取角膜组织加入体积浓度为4％甲醛溶液中固定，铺片后加入5％正常血清室温下封闭1小时；向封闭处理的角膜组织中加入anti-zo-1的初级抗体在4℃过夜，然后用alexafluor488标记的二抗37℃下孵育1min；向孵育后的角膜组织中加入100ng/ml的dapi染色10min，流水冲洗，滤纸吸除多余水分，置于荧光显微镜下观察细胞染色情况。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于细胞移植的迷你植片进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将24孔培养板中培养的融合率为80％的单层的兔原代角膜内皮细胞使用accutase细胞消化液在37℃消化10min后形成细胞数为4～10个细胞的迷你植片，同时保持植片上的细胞连接不被破坏。
实施例2
将24孔培养板中培养的融合率为90％的单层的兔原代角膜内皮细胞使用胰酶在37℃消化5min后形成细胞数为4～10个细胞的迷你植片，同时保持植片上的细胞连接不被破坏。
对比例1
将24孔培养板中培养的融合率为90％的单层的兔原代角膜内皮细胞使用胰酶在37℃消化15min后形成单细胞。
实施例3
将实施例1制备的细胞植片1500rpm/min离心5min，加入细胞培养基重悬制成细胞悬液，将细胞悬液吸入到注射器中。将动物麻醉后自12点位角膜缘做侧切口，进入前房后采用机械的方法刮除其自体的角膜内皮细胞，pbs液冲洗前房至少3次，10-0尼龙线缝合侧切口至水密，用注射器自10点位角膜缘通过穿刺隧道的方法将细胞植片注射到前房内，术后保持眼朝下位3小时。以对比例1制备的单细胞作为对照组采用同样的手术过程注射等量的培养的角膜内皮单细胞。
实施例4
所述细胞贴壁率检测的方法，包括以下步骤：迷你植片和单细胞注射后6小时的角膜组织加入体积浓度为4％甲醛溶液中固定，铺片后加入100ng/ml的dapi染色10min，流水冲洗，滤纸吸除多余水分，将染色后的角膜组织置于荧光显微镜下观察，统计弹力层贴附的内皮细胞数。进行免疫荧光染色，观察细胞贴壁率。结果见图1，其中图1-单细胞表示单细胞移植后细胞贴壁情况，图1-迷你植片表示迷你植片移植后细胞贴壁情况。可见，细胞植片贴壁率为单细胞的6-7倍。
实施例5
所述细胞连接检测的方法，包括以下步骤：迷你植片注射后48小时取角膜组织加入体积浓度为4％甲醛溶液中固定，铺片后加入5％正常血清室温下封闭1小时；向封闭处理的角膜组织中加入anti-zo-1的初级抗体在4℃过夜，然后用alexafluor488标记的二抗37℃下孵育1min；向孵育后的角膜组织中加入100ng/ml的dapi染色10min，流水冲洗，滤纸吸除多余水分，置于荧光显微镜下观察细胞染色情况。结果见图2，其中图2-单细胞表示单细胞移植后细胞连接形成情况，图2-迷你植片表示迷你植片移植后细胞连接形成情况。可见，细胞植片比单细胞更快形成细胞间连接从而发挥细胞功能。
实施例6
术后1天和术后7天分别观察迷你植片和单细胞移植角膜恢复情况，结果如图3所示，术后1天，迷你植片组角膜比单细胞组角膜的透明度高，术后7天后，移植角膜迷你植片组的角膜恢复透明，角膜厚度恢复正常，而单细胞组角膜的透明性还没有恢复，需要14～21天才逐渐恢复到正常状态。这表明采用本发明制备的迷你植片能有效缩短角膜恢复健康的时间，表明迷你植片移植方法有效提高患者康复的速度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。