本发明属于天然产物中活性成分提取
技术领域：
，具体涉及磷钨杂多酸催化、水热反应调控方法。
背景技术：
：桑叶富含多种维生素（100g桑叶干品中含视黄醇670μg，胡罗卜素7440μg，vb10.59mg，vb21.35mg，vc31.6mg）和氨基酸（含有18种之多，占干重的10.10%，其中必需氨基酸含量占3.281%，植物蛋白第一限制氨基酸赖氨酸占0.454%，半必需氨基酸占1.843%）；桑叶提取物具有良好的降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、抗丝虫病、抗肿瘤。而桑枝中含有多羟基生物碱、黄酮类化合物、桑叶多糖、植物甾醇、多酚类等活性成分；具有抑制血清胆固醇升高并防止动脉粥样硬化、抗菌抗病毒等药理作用。经现代医学及营养学研究证明，桑枝（叶）表现出的高效药理作用与其所含有活性成分密切相关。桑叶的保健药理作用，使其获得食品工业的青睐，已开发出桑茶、桑叶面、桑叶饼干、桑叶酒、桑叶醋、桑叶酱等产品，使人们通过日常饮食达到预防疾病、延年益寿的目的；随着研究的不断深入，桑叶有望成为一些疾病尤其是老年性疾病和慢性疾病的治疗药品及保健产品，且在美容护肤、畜牧等方面具有广阔的前景。现有桑枝（叶）活性成分提取方法主要有回流浸提法、超声提取法、酶法提取、超临界流体萃取等。其中，回流法提取液受热时间较长，因长时间受热，原料中成分的生物活性易受破坏，且溶剂消耗量大，局限了该方法的生产应用；酶法提取反应时间长，且酶是蛋白质，容易引起糖液过滤困难；超声提取方法操作简单，但有时其提取效率会低于其它方法；超临界流体提取在提取效率上得到大大提高，但其方法要求的装备复杂，溶剂选择范围窄，需高压力容器和高压泵，故投资成本较高。这些方法或多或少影响提取产品品质、造成环境污染等问题。因此，开展桑叶活性成份高效提取方法的研究，提高桑枝（叶）中活性成分的提取效率和资源化利用价值具有研究意义和现实经济价值。现有2016年11月2日公开的发明专利cn201610569828.8的“一种水热法提取茶多糖的方法”，该发明是在高温高压反应釜中采用水热法提取茶多糖，即利用高温高压的溶液使茶叶多糖快速全溶提取茶叶多糖，可以有效提取茶叶多糖，但仍存在以下的不足：（1）仅靠水热反应的热解作用破坏植物细胞壁的复杂致密网状结构；（2）该发明只提取了茶多糖一种物质；（3）水作为提取剂，茶叶中茶多酚、氨基酸和蛋白质等其他物质不能充分溶出，未能实现资源利用的最大化。现有桑枝（叶）中活性成分的提取方法，如2016年1月27日公开的公开号为cn201711354749.6的“药桑叶中活性物质的提取方法”，公开的方法是：称取干燥药桑叶粉末300.0g，按1﹕20料液比加入6.0l石油醚，70℃回流4h过滤后，滤渣按料液比1﹕20加入6.0l65％乙醇，浸泡一天一夜，过滤，滤液减压浓缩得桑叶浸膏；桑叶浸膏经过树脂分离纯化，分别得到生物碱、黄酮和多糖的三种粗提物。该方法提取的活性物质的化学成分和含量虽稳定，但仍存在以下的不足：（1）整个提取过程耗时较长；（2）石油醚和乙醇用量较大分别为6.0l；（3）石油醚的易燃易爆性、和慢性毒性对人体健康和环境造成威胁，增加安全生产成本。技术实现要素：本发明的目的是，针对现有桑枝（叶）活性成分提取方法的不足，提供一种磷钨杂多酸催化-水热调控提取的方法，实现提取条件操作步骤少且简单、环境污染小、生产能耗和成本低等特点。本发明机理是：植物细胞壁是由木质素组成的复杂致密的网状结构，在外力作用下破坏其致密结构，才能使氢键和共价键断裂，加快化合物的溶出。木质素的β-o-4醚键连接方式是木质素中含量最多且最重要的结构单元，同时其键能最小也最易断裂，而木质素在水热条件下可以发生水解反应，其主要过程便是醚键的断裂。而磷钨杂多酸酸催化与水热反应二者协同降解植物组织，主要是利用表面具有催化活性的酸性部位以及杂多酸氧化还原载体（e和ii+）的扩散与生物质中植物组织在水热条件下发生氧化作用，水解反应与酸催化氧化作用二者协同，破坏纤维素和半纤维素间的氢键，降解植物纤维组织，破坏细胞壁致密结构，减少细胞壁与细胞间质间的传质屏障，有利于活性成分的充分溶出。实现发明目的的技术方案是：一种固体酸强化水热反应协同提制桑枝（叶）中活性成分的方法，以桑叶粉末为原料，在水热反应釜体系中，经磷钨杂多酸酸催化降解、离心、定容，并采用高效液相进行检测分析。所述方法的具体步骤如下：（1）原料预处理将采摘的新鲜桑叶用在50～70℃烘箱中烘4～6h，烘干的后的桑叶经粉碎机粉碎，过筛60～100目，装入密封袋，待用。（2）固体酸强化水热反应处理原料第（1）步完成后，先称取2g经预处理的桑叶粉末于水热反应釜中，然后加入桑叶质量（g）的4～6‰的磷钨杂多酸，最后按照无水乙醇体积（ml）与桑叶粉末质量（g）比为3～11﹕1的比例，量取6～22ml无水乙醇倒入水热反应釜中。接着将反应釜放入170～190℃的烘箱中反应90～130min。（3）活性成分分析检测第（2）步完成后，将反应釜取出冷却至室温，倒入离心管中，在转速2000～4000r/min下离心10-20min，倒出上清液，定容至25nl容量瓶中。移取1ml桑叶提取液于样品瓶中，在流动相乙腈（ml）﹕水（ml）=35﹕65～50﹕50，温度25～40℃，进样量5～20μl，流速为0.6～1ml/min的条件下进行检测。（4）活性成分产品提制再将第（3）步收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.4～0.6mpa、温度为80～100℃下，进行减压浓缩至粘稠状得桑叶提取物粗制品；然后，按照桑叶提取物制品的质量（g）∶乙醇的体积（ml）之比为1∶8～10的比例，在浸提容器中加入桑叶提取物和乙醇溶液，混合溶解均匀；最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.4～0.6mpa、温度为80～100℃下，进行减压浓缩重复2～4次，制得桑叶提取物产品。本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果﹕（1）本发明通过磷钨杂多酸进行催化反应，由于其独特的强质子酸性、高水热稳定性、多功能（酸、氧、光催化）、易于调变的分子结构以及独特的“准液相”行为，对桑叶有良好的催化降解效果。（2）本发明采用乙醇代替水的水热反应提取桑叶中的活性成分，实现水热反应与醇提同步进行，提取过程中仅使用无水乙醇，成功避免其它有毒有害溶剂的使用，增加实验过程的安全性，有利于环境的保护，且操作简单。（3）本发明采用废弃桑叶为原料，经过预处理后，用本发明方法提取得到粗提品，分析检测出异斛皮苷、紫云英苷和绿原酸三种活性成分。当桑叶经80目筛、在60℃烘箱中烘5h时预处理后，其中加入5‰的杂多酸和22ml无水乙醇，反应温度为180℃、反应时间为110min，提取效果最好，表明杂多酸应用于桑叶中活性成分的提取以达到实现其资源化的利用有很重要的现实意义。下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。一种水热反应协同固体酸催化提制桑枝（叶）中活性成分的方法的具体步骤如下：实施例1（1）原料预处理将采摘的新鲜桑叶用在60℃烘箱中烘5h，烘干的后的桑叶经粉碎机粉碎为粉末，过筛80目，装入密封袋，待用。（2）固体酸强化水热反应处理原料第（1）步完成后，先称取2g经预处理的桑叶粉末于水热反应釜中，然后加入桑叶质量（g）的5‰即0.01g的磷钨杂多酸，最后按照无水乙醇体积（ml）与桑叶粉末质量（g）比为9﹕1的比例，量取18ml无水乙醇倒入水热反应釜中。接着将反应釜放入180℃的烘箱中反应110min。（3）活性成分分析检测第（2）步完成后，将反应釜取出冷却至室温，倒入离心管中，在转速4000r/min下离心15min，倒出上清液，定容至25nl容量瓶中。移取1ml桑叶提取液于样品瓶中，在流动相乙腈（ml）﹕水（ml）=40﹕60，温度25℃，进样量10μl，流速0.6ml/min的条件下进行检测，此时桑叶中活性物质充分溶出，根据液相检测结果显示峰面积（mau*s）达23769.7。（4）活性成分产品提制第（3）步完成后，将收集的离心清液放置于在旋转蒸发器中，在真空压强为0.5mpa、温度为90℃下，进行减压浓缩至粘稠状得桑叶提取物粗制品；然后，按照桑叶提取物制品的质量（g）﹕乙醇的体积（ml）之比为1﹕9的比例，在浸提容器中加入桑叶提取物和乙醇溶液，混合溶解均匀；最后，通过旋转蒸发器，在真空压强为0.5mpa、温度为90℃下，进行减压浓缩重复3次，制得桑叶提取物产品。实施例2一种固体酸强化水热反应协同提制桑枝（叶）中活性成分的方法，同实施例1，其中：第（1）步中，烘箱温度为50℃，烘干时间为6h，过筛60目。第（2）步中，磷钨杂多酸的质量（g）为桑叶质量（g）的4‰，无水乙醇（ml）与桑叶粉末质量（g）之比为7﹕1，反应温度为170℃，反应时间为130min。第（3）步中，转速为2000r/min，离心时间为20min。乙腈（ml）与水（ml）之比为35﹕65，温度为30℃，进样量5μl，流速0.8ml/min，峰面积（mau*s）为19738.334。第（4）步中，真空压强为0.4mpa、温度为80℃下，桑叶提取物制品的质量（g）与乙醇的体积（ml）之比为1﹕8，减压浓缩重复次数为4次。实施例3一种固体酸强化水热反应协同提制桑枝（叶）中活性成分的方法，同实施例1，其中：第（1）步中，烘箱温度为70℃，烘干时间为4h，过筛100目。第（2）步中，磷钨杂多酸的质量（g）为桑叶质量（g）的6‰，无水乙醇（ml）与桑叶粉末质量（g）之比为11﹕1，反应温度为190℃，反应时间为90min。第（3）步中，转速为3000r/min，离心时间为15min；乙腈（ml）与水（ml）之比为50﹕50，温度为40℃，进样量20μl，流速1ml/min，峰面积（mau*s）为18549.287。第（4）步中，真空压强为0.6mpa、温度为100℃下，桑叶提取物制品的质量（g）﹕乙醇的体积（ml）之比为1﹕10，减压浓缩重复次数为2次。实验结果1、不同条件提取并制备桑叶提取物的实验结果如下：表1-1不同温度对桑叶提取物的影响序号温度（℃）桑叶量（g）峰面积11502.00054952.5820621602.00025957.0573331702.00046633.8715941802.00057278.3681751902.00014767.52964表1-2不同固液比对桑叶提取物的影响序号固液比桑叶量（g）峰面积11﹕32.00053994.4901821﹕52.00024179.2525731﹕72.00045305.8165541﹕92.00059335.0175151﹕112.00018241.60411表1-3不同时间对桑叶提取物的影响序号时间（min）桑叶量（g）峰面积1702.00059197.335612902.00029850.2803731102.000423769.741302.00058074.7867451502.00017530.05743从上述实验可知：本发明采用固体酸协同催化水热反应提取废弃桑叶中的活性成分，当桑叶经80目筛、在60℃烘箱中烘5h时预处理后，其中加入5‰的杂多酸和18ml无水乙醇，反应温度为180℃、反应时间为110min，提取效果最好，根据高效液相结果显示，峰面积达到23769.7，桑叶中活性成分能得到充分的溶出，分析检测出异斛皮苷、白藜芦醇和绿原酸三种活性成分，表明杂多酸应用于桑叶中活性成分的提取以达到实现其资源化的利用有很重要的现实意义。且提取过程中，仅使用无水乙醇，成功避免其它有毒有害溶剂的使用，提高了安全性能，增加实验过程的安全性，有利于环境的保护，且操作简单。当前第1页12