本发明属于化妆品
技术领域：
，具体涉及一种玉米源单体肽在作为酪氨酸酶抑制剂中的应用。
背景技术：
：抗氧化剂是指可以捕获并对自由基进行中和的物质，可以阻止氧气引发的不良反应。目前研究的抗氧化剂，可分为人工合成和天然两大类，机体中抗氧化剂来自自身合成，也有一部分由食物来源。由食物来源的抗氧化剂可以保护人体消化道，保护机体的其他器官，用于治疗药物的生产。人工合成的抗氧化剂对机体健康有很大威胁，而天然性的抗氧化物因其安全性能高，毒性小及对人体的危害轻等特点备受关注。小分子活性肽指某些具有生物活性的肽类物质，它是由氨基酸经不同形式组成的线性或者环状的小肽，在生理及生化功能等方面有其独特性，这些低分子量的寡肽来源于蛋白质，在机体内参与神经、细胞、激素等的生长和代谢。按照化妆品中美白剂的来源，可以将美白剂划分为通过生物发酵在动植物体内提取出来的和由人工进行合成的。目前，有以下四方面的美白成分已经得到公认。第一类是由植物体提取的物质，植物体内富含着天然化合物，可以应用在美白，抗衰老，皮肤抗皱以及治疗皮肤病。他们主要是通过，对酪氨酸酶活性抑制使黑色素的产生量下降，目前有报道称，曲酸这种酪氨酸酶抑制剂可能会对人体在细胞突变以及毒性方面有很大的影响。第二类是如烟酰胺以及由大豆体内提取的物质，他们发挥抑制黑色素合成的方式是阻止在向角质形成细胞进行转移的黑色素细胞的活动，减缓皮肤老化的速度据报道乙硫胺类似物也表现出对酪氨酸酶的有效抑制。第三类美白成分包括水杨酸、亚油酸、α-羟基酸，而且在果酸中α-羟基酸易出现晒伤也有可能引发皮肤癌等现象，他们使皮肤表皮中黑色素含量伴随其脱落而减少，以此达到美白皮肤的效果；第四类是在自由基清除中起到抗氧化作用的维生素c和维生素e，但是维生素c在稳定性上以及皮肤对其吸收性差。氢醌类物质由于在发挥作用时会导致皮肤色素不可逆的消失，已经在欧盟和中国被禁止使用。有些化妆品中添加一定量激素，这些激素地加入将使皮肤在短时间内出现光泽而有弹性，然而随后皮肤细胞将出现损害，干涩和起斑也伴随出现，皮肤开始老化。研究发现天然植物活性成分作为化妆品美白添加剂，具有温和、持久、安全性高等特性。研究葛根黄酮类物质抑制作用，抗氧化作用，进行探索葛根黄酮类物质中美白作用机理。发现了葛根黄酮类物质中总还原能力较强，可对超氧阴离子自由基、-oh及dpph-有清除作用。因此，天然来源的具有美白功效的小分子肽类更加受到人们的青睐。技术实现要素：本发明的目的是提供一种玉米源单体肽在作为酪氨酸酶抑制剂中的应用。由于玉米源单体肽具有良好的抑制酪氨酸酶活性的能力，可以在化妆品中抑制色素沉积方面得到应用。本发明所述的玉米源单体肽是从玉米蛋白中通过蛋白酶水解得到(徐力，李相鲁，吴晓霞，王华，侯瑞珍，黄宜兵，张学忠；一种新的玉米抗氧化肽的制备与结构表征，高等学校化学学报,2004,25(3)，466-469.)的，其肽链结构如下所示：leu-asp-tyr-glu。本发明进一步提供玉米源单体肽作为酪氨酸酶抑制剂在制备治疗因酪氨酸酶活性增强产生的皮肤色素沉积的色斑或雀斑等皮肤病的药物中得到应用。本应用对应实施例1分子相互作用、实施例2玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂作用48h后对细胞形态学进行观察、实施例3玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成的影响和实施例4玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞内的酪氨酸酶活性影响的结果。该玉米源单体肽作为酪氨酸酶抑制剂还可以在制备治疗皮肤细胞抗皱、抗衰老的药物中得到应用，本应用对应实施例5细胞内的ros含量测定的结果。本发明提供的玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为白色粉末，溶于水，经测试无细胞毒性，对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，抑制效果要高于本领域已知的熊果苷等酪氨酸酶抑制剂产品，单酚酶活性测试证明此玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性抑制效果是熊果苷的1.25倍。本发明的创新性和有益效果：本发明以玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为研究对象，通过体外的生化实验来研究玉米源单体活性肽对酪氨酸酶在抑制动力学等方面的作用，分子对接实验模拟了酪氨酸酶与玉米源单体活性肽的相互作用的氨基酸位点。同时利用玉米源单体活性肽对小鼠黑色素瘤(b16-f10)细胞在形态方面、细胞增值率、酪氨酸酶活性和黑色素的生成量方面进行研究，我们应用人脐静脉内皮细胞(huvec)进行抗氧化作用的研究。附图说明图1：在光学显微镜下对小鼠黑色素瘤细胞形态学观察的照片。传代后的小鼠黑色素瘤细胞多以两级形态常见。a组空白对照组细胞生长状态良好，形态上无明显变化；b组和f组表示当加入玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂和α-arbutin熊果苷0.5mm时，细胞形态无明显变化，c组和g组表示当加入玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂和α-arbutin为5.0mm时，两组细胞分布开始变得稀疏，不再形成密集的网状结构，且g组比c组更明显。d组和h组表示当加入α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为10.0mm时细胞出现明显变形，出现不规则生长，e和i组为α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为2.0mm时，α-arbutin数量减少明显，由于玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂浓度很高时导致羟基浓度变高，从而使得碱性培养液颜色发生改变。图2：玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对b16-f10细胞黑色素生成的影响图(n＝4)；*p<0.05，**p<0.01；图中的control是未加入α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂。tpm表示玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂，α-arbutin表示熊果苷，横坐标表示α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的不同浓度，纵坐标表示细胞内酪氨酸酶受抑制的抑制率。图3：玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞内的酪氨酸酶活性影响图(n＝4)；*p<0.05，**p<0.001；图中的control是未加入α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂。tpm表示玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂。α-arbutin表示熊果苷，横坐标表示α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的不同浓度，纵坐标表示细胞内酪氨酸酶受抑制的剩余活力。图4：细胞内的ros含量测定图(n＝4)(比例尺，100μm)；*p<0.05，**p<0.01。图a组为空白组、b组只加入0.4mmh2o2，c组加入0.4mmh2o2和300μg/ml玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂、d组加入0.4mmh2o2和300μg/mlα-arbutin、e组加入0.4mmh2o2和600μg/ml玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂、f组加入0.4mmh2o2和600μg/mlα-arbutin、g组加入0.4mmh2o2和900μg/ml玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂、h组加入0.4mmh2o2和900μg/mlα-arbutin，i图为细胞内的ros含量检测结果。通过对实验结果的分析，只加入h2o2组细胞内的ros量是加入900μg/ml玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的1.49倍，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的加入可明显降低胞内氧化自由基的浓度，并且随玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂浓度提高，自由基清除效果更明显，α-arbutin虽也有一定的自由基清除能力，但整体效果并没有玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的作用显著。再次证实玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂确实具有清除自由基的能力。具体实施方式本发明以下实施例作进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。本发明通过酶标仪等方法，在ph＝6.8的条件下，以酪氨酸作为底物，温度37℃建立反应体系，进行检测玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶抑制情况，利用autodock软件对其酪氨酸酶的结合方式进行研究，mtt实验法观察玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞增殖造成的影响；利用l-多巴氧化法来检测玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对b16-f10细胞在酪氨酸酶活性上造成的影响，利用氢氧化钠被裂解的方法，研究玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对抑制细胞黑色素生成影响，h2o2对人脐静脉上皮细胞进行损伤实验，来检测玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂及熊果苷在抗氧化方面的情况。研究结果提示玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂具有良好的开发前景，可进行深入的结构改造和活性研究，用于预防因酪氨酸酶抑制作用产生的皮肤问题的研究。实施例1：分子相互作用从pdb数据库里，得到了酪氨酸酶大分子的结构，使用的酪氨酸酶是从蘑菇体内提取，因此将双孢蘑菇酪氨酸酶(2y9x)立体结构作为大分子受体进行对接实验。使用autodock3.1软件模拟，将对接中得到的能量最低的结合体作为本发明结果。当出现结合能是正值时，则表示小分子与大分子之间并无结合能力。表1得到结论玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂可以与酪氨酸酶发生相互作用。l-tyr购置美国sigma公司，α-arbutin购置美国sigma公司，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂(tpm)由本实验室提供。表1：各种配体与酪氨酸酶分子相互作用的结合能配体(结合能)(kcal/mol)l-tyr-4.85α-arbutin-5.3玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂-0.90实施例2：玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂作用48h后对细胞形态学进行观察将对数期的小鼠黑色素瘤细胞进行消化，然后细胞悬浮液离心，将收集的细胞悬液调整到浓度为105个/ml，在6孔培养板中培养细胞，在每孔中加3ml的完全培养基。细胞的完全培养基：来自gibco公司的dmembasic(1x)90％及康源生物所生产的含有10％的小牛血清混合配制，在实验过程中严格控制无菌环境。放在含5％co2，37℃的培养箱中过夜，然后将原培养基倒掉，每孔加入2ml的pbs进行清洗，对照组内只加入细胞完全培养基。48h后用倒置的显微镜观察、拍照，进行三次重复实验)。作用48h后在光学显微镜下进行形态学观察的照片。a组空白对照组未加入药物；b组和f组表示分别加入玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂和α-arbutin0.5mm；c组和g组表示分别加入玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂和α-arbutin为5.0mm，d组和h组表示分别加入α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为10.0mm，e和i组为分别加入α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂为20.0mm)实施例3玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对b16-f10细胞黑色素生成的影响将不同浓度的玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂及α-arbutin培养液分别加入到实验组，空白组只加培养液。继续培养48h后，以960rpm/min转速离心5min，倒掉上清液，使用pbs清洗3次。倒掉上清液后，向每个组内加入100μl的naoh(含有10％二甲基亚砜)，再加超纯水至400μl，将混合液吹打均匀后转到96孔板内，在每个孔内加入100μl混合液。在酶标仪上490nm处测定吸光度值，将每个浓度设定4个复孔。将0.5mm的α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂分别配成溶液后给药，α-arbutin和玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对黑色素生成量几乎没有抑制效果；在药物浓度为5mm时，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞黑色素生成的抑制率达19.4％；当药物浓度达到10mm时，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞内黑色素生成的抑制率已达到了29.7％；0mm时玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞内黑色素生成的抑制率已达到了38.7％。综上，我们认为玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂在b16-f10细胞的黑色素合成过程中确有抑制效果。实施例4：玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞内的酪氨酸酶活性影响在实验组每孔内加入100μl培养液，不同浓度的玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂或α-arbutin，空白孔加入等体积的缓冲液，每个实验组设置4个复孔。细胞在37℃环境，含有5％co2的培养箱内培养48h。然后吸掉上清液，用pbs进行2-3次冲洗，然后再每个孔内，加入100μl含1％体积分数的tritonx-100的溶液，将96孔板用封口膜封好，置于-80℃的冰箱内60min，然后将培养板取出，室温放置使细胞融化裂解，每个孔内加入10μl2mm的酪氨酸。经过对b16-f10细胞分别给药玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂(tpm)和熊果苷α-arbutin后，在490nm的吸光度下，我们发现细胞的酪氨酸酶活性均随药物浓度的升高而呈一定的浓度依赖性。在低剂量0.5mm的给药浓度下，二者几乎没有抑制效果，在药物浓度为5mm时，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对细胞酪氨酸酶活性的抑制率达27.4％左右，当药物浓度为10mm时，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性的抑制能力达到52.8％，而此时的α-arbutin没有其抑制效果明显，20mm时的作用效果与10mm的作用效果差别不大，可能此时药物对细胞构成了一定的副作用，使得部分细胞死亡。综上，我们认为玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂对b16-f10细胞的酪氨酸酶活性具有抑制效果。实施例5：细胞内的ros含量测定将96孔板内的培养基均吸掉，加入完全培养基，同时将已配置好的h2o2溶液加入到实验组各孔在培养箱内继续培养4h后，将96孔板内的培养基吸出，将已配好的50μl探针加入各孔内，在37℃下再培养20min后，利用酶标仪进行荧光检测，荧光的吸收波长是485nm，激发波长是535nm。使用倒置荧光显微镜观察加入荧光探针组，并且拍照，实验过程与上述相同，本实验采用12孔板进行。a组无荧光，b组为阴性对照组荧光强度最高，c组荧光强度弱于b组，e组弱于c组，g组是所有组别中仅高于a组荧光强度，d组荧光强度高于c组，f组荧光强度高于e组，h组荧光强度明显高于g组含量。i图为细胞内的ros含量检测结果图。b组为只加入h2o2组对应这个实验组。细胞内的ros量是加入900μg/ml玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的1.49倍，玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的加入可明显降低胞内氧化自由基的浓度，并且随玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂浓度提高，自由基清除效果更明显，α-arbutin虽也有一定的自由基清除能力，但整体效果并没有玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂的作用显著。再次证实玉米源单体肽酪氨酸酶抑制剂确实具有清除自由基的能力。实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12