一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备及其应用的制作方法

本发明涉及茶学、药剂学、药理学及生物纳米材料等领域，具体涉及一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备、表征其在恶性肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

茶树花，作为茶树重要的组成部分，内含多种活性有机物质，被视为一种天然的中药材。但由于人们对茶树花了解不深，重视程度远低于茶叶，进而导致其尚未得到有效的开发和利用。自2002年徐纪英老师首次提出“茶树花资源的综合利用”这一理念以来，人们逐渐开始对茶树花开展一系列的研究。目前已有的研究结果表明，茶树花有着与茶叶类似的生化成分，包括茶多酚、蛋白质、维生素类、咖啡碱、多糖、黄酮类、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等。其中，茶多酚作为一种常见的抗氧化物质，被诸多研究人员证明其有很好的抗癌性能。茶树花中茶多酚含量较多，尤以儿茶素占到了很大的比例，高达约70%，由egcg、ecg、ec等多个单体组成。在我国传统医学学说中，“药食同源”理论一直被大家沿用至今，茶花作为一种可食用性、抗氧化活性表现良好的天然材料，有着巨大的临床药用潜能。

近几年，研究人员发现，新鲜植物中普遍存在着一种天然脂质纳米囊泡，其内部包含有许多不同种类的有机小分子、核酸等活性物质，可以作为一种很好的纳米药物用于部分疾病的研究。相较于目前热门的纳米药物而言，天然脂质纳米囊泡有着更好的生物相容性，免去了纳米粒子制备过程中有机溶剂的使用，克服了纳米药物无法大批量生产等问题。2013年，美国huang-gezhang课题组首次从葡萄柚中提取得到一种脂质纳米囊泡，该种纳米囊泡可以装载不同抗体或核酸等治疗分子用于肿瘤等疾病的治疗（x.houetal.biomaterials2017:124;195-210）。随后，该课题组又证实葡萄中同样存在着类似结构的物质，可以有效地治疗由葡聚糖硫酸钠诱导的急性溃疡性结肠炎疾病(s.juetal.mol.ther.2013:21;1345-1357)。最近，huang-gezhang课题组和美国didiermerlin课题组均从生姜中得到了类似的纳米脂质囊泡，分别用于酒精引起的肝病、急性结肠炎、慢性结肠炎和结肠癌的治疗，均有着良好的治疗效果(m.zhangetal.biomaterials2016:101;321-340.m.zhangetal.mol.ther.2016:24;1783-1796.x.zhuangetal.j.extra.ves.2015:4;28713.)。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的在于从新鲜茶树花中提取一种天然脂质纳米囊泡，该纳米囊泡天然装载多种儿茶素成分，表现出较好的抑制肿瘤细胞增殖的能力，可用于多种恶性肿瘤的化学治疗。

本发明的技术方案具体如下：

一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备方法包括以下步骤：

（1）将新鲜茶树花组织放至榨汁机中搅拌破碎，得到组织原浆；

（2）将步骤（1）得到的组织原浆在4^oc条件下离心，保留组织上清液；

（3）将步骤（2）收集得到的组织上清液在4^oc条件下离心，保留沉淀，并用磷酸缓冲液重悬，得到重悬液；

（4）将步骤（3）收集得到的重悬液进一步进行蔗糖梯度离心，其中蔗糖浓度分别为8%、30%、45%和60%；

（5）收集30%和45%之间的天然茶树花脂质纳米囊泡（tfnps）,洗涤三次后重悬至pbs中，放至-80^oc长期保存。

进一步，所述步骤（2）中，离心速率为6000~15000rpm，离心时间为1~5h。

优选的，所述步骤（2）中，离心速率为20000rpm，离心时间为3h。

进一步，所述步骤（3）中，离心速率为50000~80000rpm，离心时间为1~5h。

优选的，所述步骤（3）中，离心速率为65000rpm，离心时间为3h。

进一步，所述步骤（4）中，离心速率为50000~80000rpm，离心时间为1~5h。

优选的，所述步骤（4）中，离心速率为65000rpm，离心时间为3h。

采用由上述任一所述方法制备新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡。

采用由上述任一所述方法制备的新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡在恶性肿瘤治疗中的应用。

相对于现有的技术，本发明的优点在于：

（1）本发明是从新鲜可食用植物茶树花中提取，取材简单且成本低廉；

（2）本发明通过将天然茶树花脂质纳米囊泡与多种恶性肿瘤细胞共培养发现，其对多种肿瘤细胞均呈现出良好的抑制其增殖的能力，具有很好的广谱抗癌性能；

（3）本发明的提出，可以有助于我们对茶树花进行更进一步的研究与开发，有着很大的经济和临床转化意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡的制备过程及作用机理示意图。

图2为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡的平均粒径大小及粒径分布；

图3为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡内含物成分的高效液相色谱分析结果图

图4为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡对mcf-7细胞、ct-26细胞、a549细胞、hela细胞的体外毒性结果图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

（1）将新鲜茶树花组织放至榨汁机中搅拌破碎，得到组织原浆；

（2）将上述得到的组织原浆4^oc条件下20000rpm离心3h，保留组织上清液；

（3）将上述收集得到的组织上清液4^oc条件下65000rpm离心3h，保留沉淀，并用磷酸缓冲液重悬；

（4）将上述收集得到的重悬液进一步进行蔗糖梯度离心，其中蔗糖浓度分别为8%、30%、45%和60%,离心参数为4^oc条件下65000rpm离心3h；

（5）收集30%和45%之间的天然茶树花脂质纳米囊泡（tfnps）,洗涤三次后重悬至pbs中，放至-80^oc长期保存。

图1为天然茶树花脂质纳米囊泡的制备过程及作用机理示意图。

试验1：取50μl天然茶树花脂质纳米囊泡贮存液稀释至1ml,使用动态光散射粒度仪（dls）分析其平均粒径大小及粒径分布。

图2为天然茶树花脂质纳米囊泡粒径分布结果图，结果显示脂质纳米囊泡粒径均一，平均粒径为131.6±1.6nm。

试验2：为了探究天然茶树花脂质纳米囊泡内容物的成分组成，我们对其进行了高效液相色谱分析。

图3为天然茶树花脂质纳米囊泡内容物的成分分析图，结果显示茶树花脂质纳米囊泡中负载了egcg、ecg、ec等儿茶素成分。

试验3：天然茶树花脂质纳米囊泡治疗恶性肿瘤的效果

图4为将不同浓度的天然茶树花脂质纳米囊泡与多种恶性肿瘤细胞（mcf-7细胞、ct-26细胞、a549细胞、hela细胞）共培养多个时间点（24h、48h、72h）,结果显示茶树花脂质纳米囊泡具有很好的体外抑制恶性肿瘤细胞增殖的能力，且具有很强的时间独立性、浓度独立性以及抗癌广谱性。

最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。