一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒及其制备方法和应用。所说的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒，是在固体脂质纳米粒表面修饰有乳铁蛋白。该乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒可在其内包裹药物，作为药物转运载体。其制备方法是：先通过DCC脱水反应合成mal-sac-PEG-MS，再用mal-sac-PEG-MS制得纳米混悬液；然后通过Traut's试剂进行乳铁蛋白巯基化（Lf-SH），在纳米粒混悬液中加入Lf-SH，室温搅拌进行蛋白修饰。本发明的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒具有良好的粒径和Zeta电位，具有良好的稳定性；实验表明其可将可将模型药洛派丁胺和香豆素6转运入脑。
【专利说明】一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]血脑屏障(blood-brain barrier,BBB),可以防止血液中的有害物质进入脑内，同时又可将脑内有害或过剩物质排出体外，从而保持脑的内环境稳定，保障了大脑的正常功能，对中枢神经系统(central nervous system,CNS)起到了很好的保护作用。但BBB的存在，使98%的小分子化学药物和几乎所有的大分子药物，包括蛋白质与多肽以及基因药物都无法进入脑内，或难以在脑内达到有效浓度，使得脑部疾病的治疗极为困难。
[0003]在过去的研究中，学者们已经提出了一些方法来改善大脑药物的摄入:如制备前体药物，开放血脑屏障的紧密连接，使用载体系统如抗体、脂质体、纳米粒等，其中，纳米药物载体受到人们的关注。纳米药物载体是指溶解或分散有药物的各种纳米乳、纳米粒、纳米脂质体和纳米药物微粒等。采用纳米技术制备的纳米粒，具有小尺寸效应、表面效应和界面效应等特性。大分子药物与纳米药物载体制备形成的纳米粒易于通过BBB,祀向于脑组织。而且将纳米粒表面进行修饰后可避免网状内皮系统的吞噬，发挥脑靶向作用。纳米粒常用的修饰材料有聚乙二醇(PEG)、泊洛沙姆及其乙二胺衍生物、多糖等亲水性聚合物以及受体介导的脑靶向功能分子。脑靶向给药载体分为聚合物纳米粒、脂质体、受体介导转运载体、吸附介导转运载体、基因载体、内源性物质载体等。
[0004]受体介导的转运载体是将脑靶向功能分子(亦称配体)通过不同的方法连接到已包裹药物的纳米粒上，如叶酸、低密度 脂蛋白(LDL)、载脂蛋白E、载脂蛋白A-Ι、转铁蛋白、胰岛素等。经过这些配体修饰的纳米粒进入体内后，可与血脑屏障上相应的受体相结合而被转运入脑，实现脑靶向给药目的。研究表明，这种受体介导的转运载体能够提高药物的脑靶向性。
[0005]乳铁蛋白(Lactoferrin，Lf)是一种存在于哺乳动物体内的阳离子糖蛋白，属于转铁蛋白家族。己有研究证实Lf可以通过受体介导的胞吞转运入脑。与转铁蛋白相比，血浆中内源性Lf含量较低，它在血脑屏障的转运为单向转运，无明显的跨细胞降解现象。鉴于以上特点，近几年来有学者应用Lf作为靶向功能分子修饰纳米粒，如用Lf修饰聚合物(PLGA, PLA)纳米粒、聚合物泡囊及阳离子脂质体。
[0006]固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是以固态的天然或合成的类脂为载体，将药物包裹于类脂核中，经不同方法制成的粒径在50-1000nm之间的固态胶粒给药系统。SLN既有脂质体的生理相容性和耐受性好的优点，又有聚合物纳米粒的缓释和良好的靶向性。然而SLN的靶向性是一种被动靶向。由于SLN是以脂质为基质的，而绝大多数脂质类化合物结构缺乏活性基团，不像聚合物容易进行表面修饰，因此连接蛋白类的靶向功能分子比较困难，故其主动靶向的报道很少，受体介导的脑靶向目前尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种乳铁蛋白作为靶向功能分子构建固体脂质纳米粒(Lf-SLN)的制备方法，采用该方法制备而得的Lf-SLN具有良好的粒径和Zeta电位，具有良好的稳定性。
[0008]一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒，包括固体脂质纳米粒，固体脂质纳米粒表面修饰有乳铁蛋白。
[0009]本发明的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒可作为药物转运载体，在固体脂质纳米粒内包裹有药物。
[0010]本发明所述的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒，通过下述方法制得:先通过N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC)脱水反应合成马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯(mal-sac-PEG-MS)。再用马来酸酐_6_氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯制得纳米混悬液；然后通过Traut’ s试剂进行乳铁蛋白巯基化(Lf-SH),最佳反应比例为Lf:Traut’ s=l:40 (摩尔比)，在纳米粒混悬液中加入Lf-SH，室温搅拌进行蛋白修饰，最佳反应条件500:
I(质量比)。
[0011]具体地，一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒制备方法，依次包括以下步骤:
[0012]I)马来酸酐-6-氨基己酸(mal-sac)以二氯甲烧作为溶剂,加入l/3mal_sac摩尔量的聚乙二醇单硬脂肪酸酯(PEG-MS)，冰浴条件下，依次加入4- 二甲氨基吡啶(DMAP)和DCC，室温搅拌反应，薄层色谱(TLC)分析确定反应终点，乙醚沉淀，甲醇重结晶，低温条件下得马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯(mal-sac-PEG-MS)。
[0013]合成路线如下所示:
[0014]
【权利要求】
1.一种乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒，包括固体脂质纳米粒，其特征在于所述固体脂质纳米粒表面修饰有乳铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒，其特征在于，在固体脂质纳米粒内包裹有药物。
3.一种制备权利要求1所述乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒的方法，是:先通过N，N’ - 二环己基碳二亚胺脱水反应合成马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯；再用马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯制得纳米混悬液；然后通过Traut’ s试剂进行乳铁蛋白巯基化，在纳米粒混悬液中加入巯基化乳铁蛋白，室温搅拌进行蛋白修饰。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: O马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯的合成 马来酸酐-6-氨基己酸以二氯甲烷作为溶剂，加入1/3马来酸酐-6-氨基己酸摩尔量的聚乙二醇单硬脂肪酸酯，冰浴条件下，依次加入4-二甲氨基吡啶和N，N’ -二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应，薄层色谱分析确定反应终点，乙醚沉淀，甲醇重结晶，得马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯； 2)制备纳米混悬液 称取单硬脂酸甘油酯50mg、马来酸酐-6-氨基己酸-聚乙二醇单硬脂肪酸酯0.5mg至一试管中，加热、超声溶解，作为油相； 称取泊洛 沙姆188100mg、大豆磷脂300mg，用水IOml溶解,作为水相； 将水相加入到油相，在75°C，18000r/min条件下高速搅拌10分钟，然后在75°C水浴中超声，置冰箱低温固化，得纳米混悬液；将此混悬液在超滤管中离心，浓缩至质量不再减少； 3)制备巯基化乳铁蛋白 精密称取Img乳铁蛋白，溶解于0.15mol/L的硼酸钠溶液中，加入浓度lmg/mL的Trauf s试剂，室温低速搅拌lh，过Zeba脱盐柱，除去小分子杂质，收集蛋白组分，得到巯基化乳铁蛋白； 4)乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒 取浓缩后的纳米混悬液0.5g，用2ml洗脱液A分散后移入小烧杯，加入巯基化乳铁蛋白溶液，其中纳米混悬液:巯基化乳铁蛋白为Ig:2mg，室温搅拌反应9h，得到乳铁蛋白修饰的纳米混悬液；将该混悬液过琼脂糖凝胶柱，以PBS为洗脱液，除去未连接的蛋白，收集具有乳光的组分，以PBS定容至10ml，即得到乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)油相制备过程中加入有效剂量的药物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述药物是洛哌丁胺或香豆素6。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中乳铁蛋白与Traut’s试剂的比例为摩尔比为1:40。
8.权利要求1所述的乳铁蛋白修饰固体脂质纳米粒作为药物转运载体的应用。
【文档编号】A61K47/42GK103585639SQ201310499991
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】葛晓群, 郭荣, 高纬康, 赵宇蕾, 吕丹, 颜玉文, 鞠婧婧 申请人:扬州大学