本发明属于生物医用材料领域，涉及一种具有光热效应的复合骨水泥，更具体地涉及一种具有光热效应的介孔生物玻璃/氧化石墨烯复合骨水泥及其制备方法。
技术背景
骨肿瘤是目前临床上常见的疾病，通常采用切除手术来治疗骨肿瘤，但术后会存在两个基本问题：第一，术后残留瘤空腔的填充和重建；第二，瘤空腔周围组织残留肿瘤的复发、转移。因此，临床上迫切需要同时具有修复骨缺损进行组织重建和抑制残留肿瘤细胞功能的骨修复材料。
对于骨肿瘤切除手术后留下的不规则瘤空腔的填充和重建，要求植入材料必须具有一定的形状可塑性。相比于传统骨修复材料，骨水泥除了良好的生物相容性、生物活性等生物学性能，还具有使用方法简单、优良的可塑性、可微创植入等优势，在骨缺损修复治疗方面有着良好的应用价值。与聚甲基丙烯酸甲酯、磷酸钙、硫酸钙、磷酸镁、硅酸二钙和硅酸三钙等骨水泥相比，生物玻璃基骨水泥由于其优良的生物活性和生物相容性而成为骨缺损修复领域的研究热点。其中，介孔生物玻璃(mesoporousbioactiveglass,mbg)由于其规则有序的介孔结构、高的比表面积等特点，使其比传统生物玻璃具有更为优异的生物相容性，生物活性、生物降解性能以及成骨活性。
药物化疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但是药物化疗会引起严重的毒副作用，以及出现由于肿瘤细胞的耐药性而造成治疗效果不佳等问题。光热治疗作为一种新型的肿瘤治疗手段被广泛应用于临床。光热治疗是指在外部光源(通常是近红外光)的照射下聚集在肿瘤组织附近的材料由于具有良好的光热转化性能而产生热量，使局部温度升高，从而杀死肿瘤细胞的一种疗法。例如，金、硫化铜和碳纳米材料等都具有优良的光热转化效率而可以进行光热治疗研究。其中氧化石墨烯(grapheneoxide,go)，大量研究表明go具有生物相容性，在近红外波段具有较高的光热转化效率，可用于肿瘤光热治疗应用。另一方面，由于go其强度高，柔韧性好等特点已广泛作为复合材料增强的功能组分。
因此，结合介孔生物玻璃优异的生物活性、成骨性能和氧化石墨烯良好的光热效应，制备具有光热效应的介孔生物玻璃/氧化石墨烯(mbg/go)复合骨水泥在骨肿瘤术后骨缺损修复治疗上具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于骨肿瘤术后骨缺损修复治疗的骨水泥，即制备具有光热效应的介孔生物玻璃/氧化石墨烯复合骨水泥，满足骨缺损修复和残留肿瘤的治疗功能。
本发明提供的具有光热效应的介孔生物玻璃/氧化石墨烯复合骨水泥的制备包括如下过程：
(1)氧化石墨烯的制备：将一定量的石墨(c)和nano3加入到一定体积的质量分数大于或等于95％的浓h2so4中并在冰水浴中搅拌分散25min；接着把一定量的kmno4加入到上述混合液中并在小于10℃的条件下搅拌25min；之后加热到35℃并搅拌45min，再加入一定量的去离子水并在98℃下搅拌45min；然后用去离子水将混合液稀释到700ml，稀释后再加入一定量的质量分数为30％的h2o2还原未反应的高锰酸钾，过滤并用浓盐酸洗涤，得到沉积物。上述试剂的质量比为：石墨:nano3:h2so4:kmno4:h2o:h2o2:hcl＝2:1:80～90:6:200～300:10～15:20～25。然后，将沉淀物用去离子水稀释并在11000rpm转速下离心分离；之后将上清液倒掉并加入去离子水洗涤，以上离心清洗步骤重复进行多次直至上清液的ph为7；最后将得到的粘稠物进行超声分散处理，再以3000rpm转速离心分离，收集上层液体并冷冻干燥，得到氧化石墨烯。
(2)介孔生物玻璃的制备：将一定量的三嵌段共聚物(pluronicp123)加入到乙醇溶液中充分搅拌，待p123完全溶解后依次加入正硅酸乙酯(teos)，磷酸三乙酯(tep)，四水硝酸钙(ca(no3)2·4h2o)和盐酸溶液(hcl，0.5m)；接着，在室温下搅拌1天后将溶液倒入培养皿中挥发溶剂，直至形成凝胶；凝胶干燥后在600℃下煅烧6小时以除去结构导向剂p123；最后，煅烧产物经研磨得到mbg粉体。上述反应物质量比为：p123:c2h5oh:teos:tep:ca(no3)2·4h2o:hcl＝4:60:5.8～7.5:0.73:2.4～0.5:1。产物mbg粉体中各成分摩尔比为：sio2:cao:p2o5＝70～90:25～5:5。
(3)骨水泥固化液的配制：将一定量的(nh4)2hpo4和nh4h2po4溶解于去离子水中，配制成ph为7.3的缓冲溶液，密封保存备用，其中(nh4)2hpo4与nh4h2po4质量比是11:2。
(4)mbg/go复合骨水泥的制备：将不同组分的go和mbg粉体置于行星磨中球磨，然后用600目筛进行筛分得到粒径均小于26μm的均匀混合物。之后将固化液按1.0ml/g的液固比加入到粉体中，快速搅拌混合均匀形成浆料，然后将浆料引入到聚四氟乙烯模具中固化。最后，将固化的骨水泥试样置于温度为37℃、湿度为100％的环境中养护12-168小时后取出并放在室温下干燥，得到不同组分的mbg/go骨水泥。
具体的，go与mbg的质量比为0.1–5％。
本发明还提供了一种采用上述制备方法制备得到的具有光热效应的介孔生物玻璃/氧化石墨烯复合骨水泥。
本发明涉及的兼具骨缺损修复和光热治疗功能的mbg/go复合骨水泥具有如下特点：
(1)氧化石墨烯为改进hummer’s方法制备得到，但不限于此方法制备得到的氧化石墨烯。
(2)介孔生物活性玻璃粉体的摩尔比组成为sio2:cao:p2o5＝70～90:25～5:5，mbg粉体过600目筛，粒径小于26μm。
(3)mbg/go复合骨水泥的go组分比例可调，光热升温效果随go比例增加而增强。
(4)mbg/go复合骨水泥的力学强度相比于纯mbg骨水泥明显增强。
(5)mbg/go复合骨水泥生物相容性好，生物活性高，促进人体骨髓间质干细胞的增殖、分化和成骨，有望为临床上骨肿瘤术后骨缺损的修复治疗提供新的策略。
附图说明
图1为实施例1制备的具有光热效应的mbg/go复合骨水泥的凝结时间。
图2为实施例1制备的具有光热效应的mbg/go复合骨水泥的抗压强度曲线。
图3为实施例1制备具有光热效应的mbg/go复合骨水泥的光热升温曲线。
图4为人体骨髓间质干细胞在实施例1制备的具有光热效应的mbg/go复合骨水泥上培养的细胞增殖情况。
图5为人体骨髓间质干细胞在实施例1制备的具有光热效应的mbg/go复合骨水泥上培养的细胞碱性磷酸酶(alp)活性情况。
具体实施方法
以下实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明其中一种实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。
实施例1：
将5.0g石墨和2.5gnano3加入到115ml浓h2so4中并在冰水浴中搅拌分散25min；接着把15.0gkmno4加入到上述混合液中并在小于10℃的条件下搅拌25min；之后加热到35℃并搅拌45min，再加入140ml去离子水并在98℃下搅拌45min；然后用去离子水将混合液稀释到700ml，稀释后再加入30mlh2o2(30％)还原未反应的高锰酸钾，过滤并用50ml浓盐酸洗涤，得到沉积物；然后，将沉淀物用去离子水稀释并在11000rpm转速下离心分离；之后将上清液倒掉并加入去离子水洗涤，以上离心清洗步骤重复进行多次直至上清液的ph为7；最后将得到的粘稠物进行超声分散处理，再以3000rpm转速离心分离，收集上层液体并冷冻干燥，得到氧化石墨烯。
将4gp123加入到60g乙醇溶液中充分搅拌，待p123完全溶解后依次加入6.7gteos，0.73gtep，1.4gca(no3)2·4h2o和1.0ghcl溶液(0.5m)；接着，在室温下搅拌1天后将溶液倒入培养皿中挥发溶剂，直至形成凝胶；凝胶干燥后在600℃下煅烧6小时以除去结构导向剂p123；最后，煅烧产物经研磨得到摩尔比为80:15:5的mbg粉体。
将66.0g(nh4)2hpo4和12.0gnh4h2po4溶解于100ml的去离子水中，配制成ph为7.3的缓冲溶液，密封保存备用。
将go和mbg粉体(质量比:mgo/mmbg＝0.4％)置于行星磨中球磨，然后用600目筛进行筛分得到粒径均小于26μm的均匀混合物。之后将固化液按1.0ml/g的液固比加入到粉体中，快速搅拌混合均匀形成浆料，然后将浆料引入到聚四氟乙烯模具中固化(模具尺寸φ6×12mm或φ12×3mm)。最后，将固化的骨水泥试样置于温度为37℃、湿度为100％的环境中养护12小时后取出并放在室温下干燥，得到0.4％go含量的mbg/go复合骨水泥。
测试例1
在骨水泥凝结时间的测试中，根据gb/t1346-2001标准，利用维卡仪对骨水泥试样进行凝结时间的测定。具体步骤如下：先将实施例1中的浆料引入φ6×12mm的圆柱形聚四氟乙烯模具中并置于温度为37℃、湿度为100％的环境中养护。测定初凝时间时，取出骨水泥试样放到初凝针(300g,φ1.13mm)下，降低初凝针至与试样表面接触；然后拧紧螺丝，1s-2s后突然将螺丝拧松，初凝针在重力的作用下便垂直自由地插入到试样中，当初凝针停止下沉时，记录下指针的读数。初凝针降至距底板4mm±1mm时的状态为骨水泥的初凝状态，由试样开始和固化液接触至初凝状态的时间为骨水泥的初凝时间。测定终凝时间时，只需将初凝针换成终凝针(终凝针上安装了一个环形附件)即可。终凝针插入试样0.5mm时，即环形附件开始不能在试样上留下痕迹时的状态为骨水泥的终凝状态，由试样开始和固化液接触至终凝状态的时间为骨水泥的终凝时间。结果表明，其初凝时间为37.5±3.8min，终凝时间为47.0±4.8min。
测试例2
实施例1骨水泥试样的抗压强度测试选用φ6×12mm尺寸试样，通过2.5kn的zwick静态万能材料试验机测试，测试速度为0.5mm/min。结果表明，mbg/go复合骨水泥的抗压强度为21.8mpa，相对于纯mbg骨水泥的抗压强度(13.2mpa)显著提高，能够满足人体松质骨的抗压强度要求。
测试例3
利用808nm红外光热成像系统测试mbg/go复合骨水泥的光热升温效果。具体操作步骤如下：首先将实施例1制备的φ6×12mm骨水泥试样置于96孔板中，然后用808nm红外光热成像系统测定其光热效应。其中红外光强度为2.0w/cm2，照射时间为5min，由flir红外热成像仪采集记录骨水泥表面升温变化，并通过光纤传入计算机中绘制成升温曲线。结果如图3所示，当设置红外光的功率密度为2.0w/cm2，光源与骨水泥表面距离为1厘米时，红外光照射使mbg/go复合骨水泥表面快速升温，能够在5min内从24℃升至约47℃。说明实施例1制备的mbg/go复合骨水泥有很好的光热效应，能够在较短时间内达到热疗温度(热疗温度一般在43-48℃)，有利于实际应用。
测试例4
人体骨髓间质干细胞在实施例1所制备的φ12×3mm的mbg/go复合骨水泥上增殖情况研究，包括以下步骤：
步骤一，根据文献报道提取人体骨髓间质干细胞[matsubarat,suarditak,ishiim,etal.alveolarbonemarrowasacellsourceforregenerativemedicine:differencesbetweenalveolarandiliacbonemarrowstromalcells.journalofboneandmineralresearch,2005,20,399-409]，后续实验所用细胞都是传代培养至第五代的细胞。
步骤二，将实施例1所制备的mbg/go复合骨水泥在紫外灯下照射24小时灭菌后放入24孔培养板中；接着，将含有5×104人体骨髓间质干细胞的100μl的培养液滴加到每块骨水泥上，让细胞预粘附4小时后加入1ml含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，并在37℃、5％co2气氛的培养箱中培养。
步骤三，细胞在骨水泥上培养1、3、7天后，在每个时间点上将360μl的培养液和40μl的cck-8溶液添加到每孔中，然后在37℃、5％co2气氛的培养箱中培养4小时；每孔取100μl溶液转移至新的96孔板中，采用bio-rad680酶标仪检测450nm波长处各样品的od值；以此表达细胞在骨水泥表面的增值情况。结果如图4所示，od值随培养时间增长而增加，说明细胞数量增加，mbg/go复合骨水泥具有生物相容性，能够促进细胞增殖。
测试例5
人体骨髓间质干细胞在实施例1所制备的φ12×3mm的mbg/go复合骨水泥上碱性磷酸酶(alp)活性情况研究，包括以下步骤：
步骤一，根据文献报道提取人体骨髓间质干细胞[matsubarat,suarditak,ishiim,etal.alveolarbonemarrowasacellsourceforregenerativemedicine:differencesbetweenalveolarandiliacbonemarrowstromalcells.journalofboneandmineralresearch,2005,20,399-409]，后续实验所用细胞都是传代培养至第五代的细胞。
步骤二，将实施例1所制备的mbg/go复合骨水泥在紫外灯下照射24小时灭菌后放入24孔培养板中；接着，将含有1×105人体骨髓间质干细胞的100μl的培养液滴加到每块骨水泥上，让细胞预粘附4小时后加入1ml含10％胎牛血清的dmem细胞培养基，并在37℃、5％co2气氛的培养箱中培养。
步骤三，细胞在骨水泥上培养7、14天后，缓慢倒掉培养基，然后先用pbs溶液冲洗3次，再用50mm的tris溶液清洗2次；接着用200μl的0.2％tritonx-100溶液将支架上细胞溶解，并通过超声分散、离心分离工序得到分层溶液，然后取50μl上清液与150μl标准试剂(beyotime)充分混合；用酶标仪测算上述溶液在405nm处的od值，同时按照bca法进行蛋白定量检测，最终以μm/min/mgprotein表示alp活性。结果如图5所示，alp活性随培养时间增长而增加，14天时alp活性比7天时有显著增加，表明mbg/go复合骨水泥有促进细胞分化能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。