本发明涉及一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜的制备方法，属于生物材料和组织工程领域。
背景技术：
组织工程是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程的三要素包括种子细胞、基质材料和调节因子。过去组织工程支架通常从材料学的角度设计，而不是从生物学角度考虑如何使植入材料整合重建组织，植入材料常因细胞利用率低、支架降解导致的纤维化、排异和炎性反应等因素达不到预期修复效果。天然生物材料来源广泛、无毒、生物相容性和生物可降解性良好，但是其加工提取困难、力学性能不佳，限制了其在组织工程中的应用。人工合成的无机材料化学性质稳定，生物相容性好，但降解速率慢，部分降解产物不易被机体吸收、力学性能差。人工合成的有机高分子材料降解可控，但是材料表面缺乏细胞识别信号，不利于细胞的特异性粘附和特异基因的激活。
高分子水凝胶是由高分子三维网络与水组成的多元体系，对环境刺激在形状上产生巨大变化的聚合物网络。水凝胶是一种类似于生命组织的高分子材料，水凝胶与许多组织和细胞外基质非常接近，表现出良好的生物相容性，放入体内不会引发排异反应，同时为营养物质运输和代谢废物的排出提供良好通道。水凝胶可作为永久软组织损伤替代物，或作为细胞培养基质材料。chaudhuri等将含有软骨细胞的水凝胶用于替代损伤软骨【naturematerials，2017，16：1243-1251】。常江教授等制备了可注射的caalg/casio3@sio2复合水凝胶，该水凝胶可以促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化【actabiomaterialia，2013，9(11)：9107-9117】。
可降解水凝胶能在机体生理环境下，通过水解、酶解等作用降解成对机体无损害的小分子物质，并且这些小分子降解产物通常是体内自身就存在的，如氨基酸、乳酸等，最后，通过机体的新陈代谢完全吸收和排泄，对机体无毒副作用，因而在生物医学领域有广泛的应用。目前研究较多的天然高分子可降解水凝胶包括琼脂、海藻酸钠、明胶、壳聚糖、纤维素和羧甲基壳聚糖等。但是由于水凝胶光滑的表面和高的亲水性，细胞在水凝胶表面不易粘附增殖。即使在水凝胶中加入了纤维粘连蛋白促进细胞粘附，也难以控制贴壁细胞的密度。三维培养因细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是细胞在水凝胶表面不易粘附，难以控制贴壁细胞密度，三维培养因细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡的问题。
本发明解决所述细胞在水凝胶表面不易粘附，难以控制贴壁细胞密度，三维培养因细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡的问题的技术方案是提供一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜的制备方法。
本发明提供了一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜的制备方法。首先将天然高分子聚合物，致孔剂溶于水中得到铸膜液a，将细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b。在a玻璃板上用缠绕直径为da的铜丝的玻璃棒将铸膜液a刮均匀，在b玻璃板上用缠绕直径为db的铜丝的玻璃棒将铸膜液b刮均匀，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，两块玻璃板之间用直径为d的铜丝隔开，其中d≤da+db。将两块玻璃板浸泡入交联剂溶液中使天然高分子聚合物充分交联后，用大量水洗脱掉致孔剂，得到一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜。本发明制备方法简单，没有引入任何有毒试剂，该水凝胶膜厚度可控，生物相容性好，可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。
本发明提供了一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：
a)在无菌条件下，首先将0.1-10g天然高分子聚合物，0.05-5g致孔剂溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液a；将细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b，将铸膜液a放置于无菌容器中备用，含有细胞的铸膜液b现配现用；
b)配制质量百分比为0.5％-20％的交联剂水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，将步骤a)制备的铸膜液a倒入干燥清洁的玻璃板a上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒a刮成厚度均匀的液膜a，同样将步骤a)制备的铸膜液b倒入干燥清洁的玻璃板b上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒b刮成厚度均匀的液膜b，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，玻璃板a和玻璃板b之间用10-2000μm的铜丝隔开，要求铜丝直径小于等于刮膜棒a和刮膜棒b的厚度之和；由于天然高分子聚合物具有一定粘度，液膜a和液膜b都能暂时保持一定厚度，且厚度由刮膜棒决定，将玻璃板b倒扣在玻璃板a上后液膜a和液膜b相融合没有界面；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的液膜连同玻璃板a和玻璃板b一起浸泡入交联剂水溶液中使天然高分子聚合物充分交联，用大量水洗脱致孔剂后，得到一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜，天然高分子聚合物具有可降解性和良好的生物相容性；
e)该水凝胶膜厚度可控，含细胞的水凝胶层厚度也可控，细胞处于水凝胶的表层，易于跟外界进行物质交换，避免了细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡的问题；得到表层包埋细胞的水凝胶生物相容性好，水凝胶可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。
本发明所述的天然高分子聚合物为琼脂、海藻酸钠、明胶、羧甲基壳聚糖中的任意一种或两种以上混合物；本发明所述的致孔剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚维酮、乳糖、蔗糖中的任意一种或两种以上混合物；本发明所述的细胞为骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、软骨细胞、成纤细胞、表皮细胞、心肌细胞的任意一种或两种以上混合物。如权利要求1所述的一种表层包埋细胞的可降解生物相容性水凝胶膜的制备方法，其特征是所述的交联剂为氢氧化钙、氯化钙、京尼平、乙二醛、戊二醛中的任意一种或两种以上混合物。
具体实施方式
下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实施例1.
a)在无菌条件下，首先将10g琼脂，5g聚乙烯醇溶于100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液a；将骨髓间充质干细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b，将铸膜液a放置于无菌容器中备用，含有骨髓间充质干细胞的铸膜液b现配现用；
b)配制质量百分比为20％的乙二醛水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，将步骤a)制备的铸膜液a倒入干燥清洁的玻璃板a上，用厚度为1000μm的刮膜棒a刮成厚度均匀的液膜a，同样将步骤a)制备的铸膜液b倒入干燥清洁的玻璃板b上，用厚度为1000μm的刮膜棒b刮成厚度均匀的液膜b，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，玻璃板a和玻璃板b之间用2000μm的铜丝隔开，要求铜丝直径小于等于刮膜棒a和刮膜棒b的厚度之和；由于琼脂具有一定粘度，液膜a和液膜b都能暂时保持一定厚度，且厚度由刮膜棒决定，将玻璃板b倒扣在玻璃板a上后液膜a和液膜b相融合没有界面；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的液膜连同玻璃板a和玻璃板b一起浸泡入乙二醛水溶液中使琼脂充分交联，用大量水洗脱聚乙烯醇后，得到一种表层包埋骨髓间充质干细胞的可降解生物相容性水凝胶膜，琼脂具有可降解性和良好的生物相容性；
e)该水凝胶膜厚度可控，含骨髓间充质干细胞的水凝胶层厚度也可控，骨髓间充质干细胞处于水凝胶的表层，易于跟外界进行物质交换，避免了骨髓间充质干细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起骨髓间充质干细胞死亡的问题；得到表层包埋骨髓间充质干细胞的水凝胶生物相容性好，水凝胶可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。
实施例2.
a)在无菌条件下，首先将0.1g海藻酸钠，0.05g聚乙二醇溶于50ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液a；将脐带血干细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b，将铸膜液a放置于无菌容器中备用，含有脐带血干细胞的铸膜液b现配现用；
b)配制质量百分比为0.5％的氯化钙水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，将步骤a)制备的铸膜液a倒入干燥清洁的玻璃板a上，用厚度为10μm的刮膜棒a刮成厚度均匀的液膜a，同样将步骤a)制备的铸膜液b倒入干燥清洁的玻璃板b上，用厚度为10μm的刮膜棒b刮成厚度均匀的液膜b，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，玻璃板a和玻璃板b之间用20μm的铜丝隔开，要求铜丝直径小于等于刮膜棒a和刮膜棒b的厚度之和；由于海藻酸钠具有一定粘度，液膜a和液膜b都能暂时保持一定厚度，且厚度由刮膜棒决定，将玻璃板b倒扣在玻璃板a上后液膜a和液膜b相融合没有界面；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的液膜连同玻璃板a和玻璃板b一起浸泡入氯化钙水溶液中使海藻酸钠充分交联，用大量水洗脱聚乙二醇后，得到一种表层包埋脐带血干细胞的可降解生物相容性水凝胶膜，海藻酸钠具有可降解性和良好的生物相容性；
e)该水凝胶膜厚度可控，含脐带血干细胞的水凝胶层厚度也可控，脐带血干细胞处于水凝胶的表层，易于跟外界进行物质交换，避免了脐带血干细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起脐带血干细胞死亡的问题；得到表层包埋脐带血干细胞的水凝胶生物相容性好，水凝胶可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。
实施例3.
a)在无菌条件下，首先将5g明胶，1g聚维酮溶于80ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液a；将软骨细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b，将铸膜液a放置于无菌容器中备用，含有软骨细胞的铸膜液b现配现用；
b)配制质量百分比为0.8％的京尼平水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，将步骤a)制备的铸膜液a倒入干燥清洁的玻璃板a上，用厚度为500μm的刮膜棒a刮成厚度均匀的液膜a，同样将步骤a)制备的铸膜液b倒入干燥清洁的玻璃板b上，用厚度为500μm的刮膜棒b刮成厚度均匀的液膜b，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，玻璃板a和玻璃板b之间用900μm的铜丝隔开，要求铜丝直径小于等于刮膜棒a和刮膜棒b的厚度之和；由于明胶具有一定粘度，液膜a和液膜b都能暂时保持一定厚度，且厚度由刮膜棒决定，将玻璃板b倒扣在玻璃板a上后液膜a和液膜b相融合没有界面；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的液膜连同玻璃板a和玻璃板b一起浸泡入京尼平水溶液中使明胶充分交联，用大量水洗脱聚维酮后，得到一种表层包埋软骨细胞的可降解生物相容性水凝胶膜，明胶具有可降解性和良好的生物相容性；
e)该水凝胶膜厚度可控，含软骨细胞的水凝胶层厚度也可控，软骨细胞处于水凝胶的表层，易于跟外界进行物质交换，避免了软骨细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起软骨细胞死亡的问题；得到表层包埋软骨细胞的水凝胶生物相容性好，水凝胶可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。
实施例4.
a)在无菌条件下，首先将2g羧甲基壳聚糖，1g乳糖溶于60ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液a；将成纤细胞分散到铸膜液a中得到的铸膜液b，将铸膜液a放置于无菌容器中备用，含有成纤细胞的铸膜液b现配现用；
b)配制质量百分比为10％的戊二醛水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；
c)在无菌条件下，将步骤a)制备的铸膜液a倒入干燥清洁的玻璃板a上，用厚度为200μm的刮膜棒a刮成厚度均匀的液膜a，同样将步骤a)制备的铸膜液b倒入干燥清洁的玻璃板b上，用厚度为200μm的刮膜棒b刮成厚度均匀的液膜b，然后立即将玻璃板b倒扣在玻璃板a上，玻璃板a和玻璃板b之间用350μm的铜丝隔开，要求铜丝直径小于等于刮膜棒a和刮膜棒b的厚度之和；由于羧甲基壳聚糖具有一定粘度，液膜a和液膜b都能暂时保持一定厚度，且厚度由刮膜棒决定，将玻璃板b倒扣在玻璃板a上后液膜a和液膜b相融合没有界面；
d)在无菌条件下，将步骤c)得到的液膜连同玻璃板a和玻璃板b一起浸泡入戊二醛水溶液中使羧甲基壳聚糖充分交联，用大量水洗脱乳糖后，得到一种表层包埋成纤细胞的可降解生物相容性水凝胶膜，羧甲基壳聚糖具有可降解性和良好的生物相容性；
e)该水凝胶膜厚度可控，含成纤细胞的水凝胶层厚度也可控，成纤细胞处于水凝胶的表层，易于跟外界进行物质交换，避免了成纤细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起成纤细胞死亡的问题；得到表层包埋成纤细胞的水凝胶生物相容性好，水凝胶可生物降解，在组织工程领域具有良好的应用前景。