本发明涉及医药技术领域，具体涉及丁苯酞在制备抗真菌产品中的应用及其产品。
背景技术：
由于免疫抑制剂、化疗药物、广谱抗生素以及激素的大量应用，真菌感染成为器官移植、肿瘤、艾滋病等免疫缺陷患者的常见并发症，是导致患者预后不良的主要原因。念珠菌是真菌中最常见的条件致病菌，念珠菌感染对临床的威胁虽然没有曲霉菌感染所造成的威胁大，但由于这类真菌容易出现药物外排增强与基因靶位改变(如erg11)等，使得对唑类抗真菌药物敏感的念珠菌不断出现耐药性，这给临床抗真菌感染带来极大的挑战。数据表明，获得性免疫缺陷综合征患者晚期感染真菌后，超过三分之一耐药，对唑类药物耐药率更是高达65％。其中念珠菌尤其是白色念珠菌(candidaalbicans，ca)，是呼吸系统、血流感染、消化系统和泌尿系统真菌感染的常见分离菌。根据美国院内感染控制组织的资料显示，ca是第4位引起院内血流感染的病原微生物，是死亡率最高的致病菌，死亡率可高达40％。此外，由于传统抗真菌药物在临床大量的预防治疗性应用，非白色念珠菌(non-albicanscandidaspecies，nca)的分离率逐年增加，在某些地区nca的分离率已经高于白色念珠菌。在nca菌种中，光滑念珠菌(candidaglabrata，cg)和克柔念珠菌(candidakrusei，ck)是临床上经常被分离到的病原菌。由于念珠菌分离率不断升高，且对常用抗真菌药物具有固有耐药或较快获得耐药性，给临床成功治疗念珠菌感染带来了挑战。因此寻找一种对抗念珠菌有效的成分成为近年来的研究热点。
丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，nbp)，又叫芹菜甲素，是芹菜油中的化学成分之一，是我国脑血管领域第一个具有自主知识产权的ⅰ类新药。nbp对脑血管病具有广泛的药理作用，可抗脑缺血、改善脑能量代谢与抑制血栓形成，且其毒性较弱，安全性好。近来文献检索发现，同为芹菜提取物的其它化合物已被证实具有抗念珠菌活性，但目前对于nbp对念珠菌的体外作用效果，尚无文献报道，具有广阔研究前景。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提供丁苯酞单用或联合三唑类药物在制备抗真菌产品中的应用及其产品。本发明研究表明，脑血管领域ⅰ类新药nbp单用具有显著抗念珠菌活性，为念珠菌感染的治疗和nbp的新药理作用研究及潜在应用提供新思路。
本发明的目的之一是提供了一种丁苯酞在制备抗真菌产品中的新应用。
本发明的目的之二是提供了一种丁苯酞联合三唑类药物在制备抗真菌产品中的应用。
本发明的目的之三是提供了一种包含丁苯酞的抗真菌产品。
本发明的目的之四是提供了一种包含丁苯酞和三唑类药物的抗真菌产品。
为实现上述发明目的，具体的，本发明公开了下述技术方案：
首先，本发明公开了一种丁苯酞在制备抗真菌产品中的应用。
优选的，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
优选的，所述产品为药物。
优选的，丁苯酞单用抗念珠菌(包括白色念珠菌，光滑念珠菌及克柔念珠菌)的最低浓度为128μg/ml。
其次，本发明公开了一种丁苯酞联合三唑类药物在制备抗真菌产品中的应用。
优选的，所述三唑类药物为氟康唑、伊曲康唑或伏立康唑中的一种或多种。
优选的，所述产品为药物。
优选的，丁苯酞与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：丁苯酞＝0.25～8:4～32(μg/ml)；丁苯酞与伏立康唑联合应用时的有效浓度配比：伏立康唑：丁苯酞＝0.0313:64(μg/ml)；丁苯酞与伊曲康唑联合应用时的有效浓度配比：伊曲康唑：丁苯酞＝0.25～0.5:64(μg/ml)。
优选的，联合应用时丁苯酞与氟康唑的最低抑菌浓度为：4～32μg/ml与0.25～8μg/ml；联合应用时丁苯酞与伏立康唑的最低抑菌浓度为：64μg/ml与0.0313μg/ml；联合应用时丁苯酞与伊曲康唑的最低抑菌浓度为：64μg/ml与0.25～0.5μg/ml。
再次，本发明公开了一种包含丁苯酞的抗真菌产品。
优选的，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
优选的，所述产品为药物。
最后，本发明还公开了一种包含丁苯酞和三唑类药物的抗真菌产品。
优选的，所述抗真菌产品还包含药学上可接受的辅料。
进一步优选的，所述辅料为药物制剂中的常规辅料，如润滑剂、黏合剂、崩解剂等。
本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：
(1)本发明表明，脑血管领域ⅰ类新药nbp单用具有显著抗念珠菌活性，为念珠菌感染的治疗和nbp的新药理作用研究及潜在应用提供新思路。
(2)本发明表明，nbp分别与flc、vrc、itz联合应用时，可以增强三唑类抗真菌药物对念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转念珠菌对三唑类抗真菌药物的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。对临床分离得到的常见念珠菌，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，4～32μg/ml的nbp与0.25～8μg/ml的flc合用、64μg/ml的nbp与0.0313μg/ml的vrc合用及64μg/ml的nbp与0.25～0.5μg/ml的itz合用均可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。
(3)本发明利用液体定量法，测定nbp单用抗念珠菌及与三唑类药物联合用药抗耐药白色念珠菌的最低有效浓度，并以fici法评价药物联合用药的作用；本发明还采用时间-杀菌曲线法评价药物单用及联用动态抗真菌作用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为丁苯酞单用抗真菌时间-杀菌曲线；
图2为丁苯酞联合氟康唑时抗真菌时间-杀菌曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中常用抗真菌药物具有固有耐药或较快获得耐药性，给临床成功治疗念珠菌感染带来了挑战。因此亟需寻找一种新的抗念珠菌的有效成分。
鉴于此，本发明的一种典型实施方式中，提供一种丁苯酞在制备抗真菌产品中的应用。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明优选的实施方式中，丁苯酞单用抗念珠菌(包括白色念珠菌，光滑念珠菌及克柔念珠菌)的最低浓度为128μg/ml。
在本发明的又一种典型的实施方式中，提供了一种丁苯酞联合三唑类药物在制备抗真菌产品中的应用。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明优选的实施方式中，所述三唑类药物为氟康唑、伊曲康唑或伏立康唑中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，丁苯酞与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：丁苯酞＝0.25～8:4～32(μg/ml)；丁苯酞与伏立康唑联合应用时的有效浓度配比：伏立康唑：丁苯酞＝0.0313:64(μg/ml)；丁苯酞与伊曲康唑联合应用时的有效浓度配比：伊曲康唑：丁苯酞＝0.25～0.5:64(μg/ml)。
在本发明优选的实施方式中，联合应用时丁苯酞与氟康唑的最低抑菌浓度为：4～32μg/ml与0.25～8μg/ml；联合应用时丁苯酞与伏立康唑的最低抑菌浓度为：64μg/ml与0.0313μg/ml；联合应用时丁苯酞与伊曲康唑的最低抑菌浓度为：64μg/ml与0.25～0.5μg/ml。
结果表明，大于4～32μg/ml的丁苯酞与大于0.25～8μg/ml的氟康唑联合应用、大于64μg/ml的丁苯酞与0.0313μg/ml的伏立康唑或者大于64μg/ml的丁苯酞与0.25～0.5μg/ml的伊曲康唑联合应用均有协同抗耐药白色念珠菌作用。
在本发明的又一种典型的实施方式中，还提供了一种包含丁苯酞的抗真菌产品。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明的又一种典型的实施方式中，还提供一种包含丁苯酞和三唑类药物的抗真菌产品。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明优选的实施方式中，所述抗真菌产品还包含药学上可接受的辅料，所述辅料为药物制剂中的常规辅料，如润滑剂、黏合剂、崩解剂等，优选为淀粉、羧甲基纤维素钠、甘油、甜菜碱等其中的一种或多种。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例丁苯酞单用及联合三唑类药物抗念珠菌作用测定
1.材料
1.1药品与试剂
氟康唑(fluconazole,flc)，大连美仑生物技术有限公司；
伊曲康唑(itraconazole，itz)，大连美仑生物技术有限公司；
伏立康唑(voriconazole，vrc)，大连美仑生物技术有限公司；
丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，nbp)，大连美仑生物技术有限公司；
科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
ttc-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；
酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；
蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；
葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；
琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
pbs磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；
磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。
二甲基亚砜(dmso)，国药集团化学试剂有限公司；
乙醇，国药集团化学试剂有限公司；
rpmi1640原料药粉，美国gibco公司；
3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
甲萘醌(menadione)，美国sigma公司；
xtt(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；
乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；
丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；
xtt(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)-甲萘醌溶液的配制：取xtt粉末0.0500g，溶解于100ml已灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μl的10mmol/l的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为1μmol/l，摇匀，2℃～8℃避光保存。
药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/ml的储备液，过滤分装；伏立康唑用二甲基亚砜溶解，配成8000μg/ml的储备液，过滤分装；伊曲康唑用二甲基亚砜溶解，配成2560μg/ml储备液，过滤分装；丁苯酞用无水乙醇溶解，配成12800μg/ml的储备液，过滤分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。
pbs(磷酸盐缓冲液)：用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的pbs磷酸盐缓冲剂(粉剂)，小包装一袋溶于1l蒸馏水中，即配成0.01m，ph7.4的pbs磷酸盐缓冲液，121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却备用。
rpmi(roswellparkmemorialinstitute)1640液体培养液：取rpmi1640(含l-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及mops(3-(n-吗啉基)丙磺酸)粉6.906g，加蒸馏水至200ml，混合均匀后在22℃用1mol/l的naoh溶液调ph为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。
1.2仪器
ab204-n电子天平梅特勒-托利(上海)公司
sve-4a1超净工作台新加坡esco公司
incucell55恒温培养箱德国mmm公司
venticell55干热灭菌箱德国mmm公司
hs-9041高温高压灭菌器韩国hanshin公司
不锈钢过滤器(2000ml)江苏天和仪器厂
96孔培养板美国costar公司
可调式移液器thermoelectron(上海)公司
sc-329常温冰箱中国海尔公司
-20℃低温冰柜中国海尔公司
g-560e涡旋混合器美国si公司
multiscanmk3酶标仪美国thermolabsystems公司
1.3实验菌株
质控菌株：近平滑念珠菌atcc22019和白色念珠菌atcc10231，山东大学药理教研室惠赠；
实验菌株：白色念珠菌ca10,ca16,ca103和ca632；光滑念珠菌cg3,cg4和cg8；克柔念珠菌ck3,ck8和ck9；千佛山医院临床分离。
菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定。
菌液制备：-20℃下保存的菌株室温下解冻，接种到ttc-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，pbs配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时菌浓度约为1×106cfμ/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
2.内容与方法
2.1丁苯酞单用及与三唑类药物联用抗真菌作用测定
2.1.1丁苯酞单用抗念珠菌作用测定
根据clsim27-a3方案,以rpmi-1640液体培养基稀释药液使其成为2倍工作浓度，筛选nbp应用的浓度范围，即nbp终浓度为256～4μg/ml。按浓度从低到高的顺序分别吸取nbp药液100μl，再分别加入100μl菌液。另设置生长对照，只含菌液不含药物和空白对照，只含rpmi-1640液体培养基。将96孔板置35℃恒温培养箱中培养24h后，分别用xtt负载2h后以酶标仪测定od并记录结果。所有实验重复三次。
2.2.2丁苯酞分别与氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑联合抗念珠菌作用测定
根据clsim27-a3方案的棋盘法，以rpmi-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度,筛选nbp分别与flc、vrc、itz联合应用的浓度范围,即nbp终浓度为256～4μg/ml，flc、vrc、itz的终浓度分别为64～0.125μg/ml、16～0.0313μg/ml、16～0.0313μg/ml。按浓度从低到高的顺序分别吸取flc、vrc、itz药液50μl，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取nbp药液50μl，分别加入各96孔平板的第g～a行，除第12列外各孔再分别加100μl菌液，其余不足200μl的孔用rpmi-1640培养液补足。其中h1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含rpmi-1640液体培养基。根据clsim27-a3方案的要求，将加flc的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h、加vrc和itz的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养48h后，分别用xtt负载2h后以酶标仪测定od并记录结果。所有实验重复三次。
2.1.3时间-杀菌曲线法
将浓度为12800μg/ml的丁苯酞和浓度2560μg/ml的氟康唑药物储备液以rpmi1640液体培养基稀释成10倍工作浓度。
取ttc-沙保罗琼脂培养基上传代两次的实验菌株(ca10)，挑取单个较大菌落，以pbs制成菌悬液，采用中国细菌浊度标准进行比浊，当标准管与样品管浓度一致时，菌液初始浓度约为4.5×106cfu/ml，并通过活菌计数法进行浓度验证。
取上述制备的药液500μl加入到相应试管内，再加入rpmi1640液体培养基至液体总体积为4.5ml；此时取按上述方法制备的菌液500μl加入到此4.5ml含(或不含)药物的培养基内，震荡混匀。本实验分为四组，即：生长对照组(不加药)、不同浓度丁苯酞药物单用组、氟康唑单用组、丁苯酞与氟康唑联合用药组，共7个体系。每个体系总体积为5ml，丁苯酞药物单用时，体系内丁苯酞的终浓度分别为64μg/ml,128μg/ml和256μg/ml；丁苯酞与氟康唑联合用药时，体系内丁苯酞的终浓度分别为64μg/ml，氟康唑的终浓度为1μg/ml。体系内菌液终浓度均约为4.5×105cfu/ml。将制备完毕的体系于35℃，200rpm震荡培养，于药物作用的第0,6,12,24和48h的时间点取样测定。
2.2评价方法与结果判定
2.2.1la理论
loeweadditivity(la)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractionalinhibitoryconcentrationindex，fici)，表述如下：
σfic＝fica+ficb＝ca/mica+cb/micb
mica和micb分别是药物a和b单用时的最小抑菌浓度，ca与cb为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。fici＞4为拮抗作用，fici在0.5与4之间为相加或无关作用，fici≤0.5定义为协同作用。
2.2.2xtt法(二甲氧唑黄比色法)
在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上混匀，吸取100μl某体系内的菌悬液加入到96孔平底培养板内，在以100μl无菌rpmi1640液体培养基为空白对照的情况下，再分别向每个加样后的孔内加入100μl配制好的xtt-甲萘醌溶液，培养板在35℃下避光培养2小时，酶标仪设置单孔空白，在492nm处测各孔的od值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。
3.结果
3.1丁苯酞单用抗念珠菌作用结果
真菌生长百分数的计算方法为：
真菌生长百分数＝(各孔od值-空白对照孔od值)/生长对照孔od值
按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。丁苯酞单用对不同念珠菌的最低抑菌浓度如表1所示。
表1丁苯酞单用对不同念珠菌的最低抑菌浓度
注解：mic：最低抑菌浓度；
3.2丁苯酞分别与氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑联合抗念珠菌作用结果
3.2.1丁苯酞分别与氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑联合的最低有效抑菌浓度
各孔中真菌生长百分数的计算方法为：
真菌生长百分数＝(各孔od值-空白对照孔od值)/生长对照孔od值
按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。各药物组合联用时的最低抑菌浓度见表2。
3.2.2fici模型评价nbp与三唑类药物联用的协同作用
fici模型的评价指标为fici值，fici≤0.5则定义为协同作用。由表2可以看出，各组合的fici值均小于0.5，表现为较强的协同作用。
丁苯酞与唑类药物(包括氟康唑，伏立康唑和伊曲康唑)联合对ca的作用结果见表2；丁苯酞与唑类药物(以氟康唑为代表)联合对nca的作用结果见表3。
表2丁苯酞与三唑类药物体外联合抗ca作用结果
注解：flc：氟康唑；vrc：伏立康唑；itz：伊曲康唑；mic：最低抑菌浓度；mica：药物单用时三唑类抗真菌药物的最低抑菌浓度；ca：药物联用时三唑类抗真菌药物的最低抑菌浓度；micb：药物单用时nbp的最低抑菌浓度；cb：药物联用时nbp的最低抑菌浓度；fici：分数抑菌浓度指数；
表3nbp与flc体外联合抗nca作用结果
注解：flc：氟康唑；mic：最低抑菌浓度；mica：药物单用时flc抗真菌药物的最低抑菌浓度；ca：药物联用时flc抗真菌药物的最低抑菌浓度；micb：药物单用时nbp的最低抑菌浓度；cb：药物联用时nbp的最低抑菌浓度；fici：分数抑菌浓度指数；
3.1.3时间杀菌曲线法评价nbp单用或与flc协同作用结果
将各个时间点联合抗真菌作用的结果连接成曲线，可观察用药后的动态作用效果。不同浓度nbp单用时，如图1所示：在4.5×105cfu/ml的菌液中，在6h之前加药组和对照组od值的变化不大；与对照组相比，6h之后nbp药物浓度大于128μg/ml的各组开始出现生长延迟，其中nbp药物浓度为256μg/ml的真菌生长延迟更明显。nbp与flc联用时，如图2所示，在4.5×105cfu/ml的菌液中，在6h之前加药组和对照组od值的变化不大；与对照组相比，6h之后含有氟康唑的各组开始出现生长延迟，其中nbp/flc联用组处理的真菌生长延迟更明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。