一种肿瘤靶向性纳米粒、制备方法及其应用与流程

本发明涉及光热纳米材料技术领域，具体为一种肿瘤靶向性纳米粒、制备方法及其应用。

背景技术：

近年来，随着全球环境恶化和生活压力增加，许多癌症的发病率呈现持续上升的趋势，早发现、早治疗已是各方共识。因此，癌症诊断和治疗手段的突破和创新，对实体瘤类型的肿瘤而言，着重在于开发高效安全、精准的肿瘤诊断和治疗方法。

众多研究表明，当肿瘤细胞周围温度高于43℃时会导致细胞凋亡，故近年来光热治疗受到越来越多的关注。光热治疗的原理是将肿瘤细胞中的纳米材料吸收的近红外光(波长700～1100nm)转化为热量，用于热成像或荧光成像诊断肿瘤，进而利用升温效应致肿瘤热消融用于肿瘤治疗。与手术切除，放射治疗和化疗等癌症治疗的其他手段相比，光热治疗的优点在于无创性、靶向性、高效性及非侵入性。与紫外线或可见光不同，近红外光可通过相对低强度的光照射，一定程度地穿透到组织中而不引起组织异常损伤。针对各种癌症类型优化近红外光的穿透深度，可实现高效的肿瘤治疗。研究表明，光热治疗的治疗功效关键取决于光热材料，理想的光热材料应该在近红外光区域(650～950nm)具有较强的吸收，低毒性，具有靶向性。目前各种光热纳米治疗材料(包括贵金属纳米材料，碳纳米材料，过渡金属硫化物/氧化物纳米材料和有机纳米材料)已被广泛研究，有大量文献报道涌现，目前的纳米光热材料与流式监测细胞孵育两个小时以后的结合率在60％以下，靶向性较差，影响成像效果。

技术实现要素：

本发明意在提供一种肿瘤靶向性纳米粒、制备方法及其应用，可以通过术前光声成像、ct成像、近红外荧光成像评估肿瘤，术中近红外荧光引导下最优化切除肿瘤，并在术中通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

为了解决上述技术问题，本申请提供如下技术方案：

一种肿瘤靶向性纳米粒，所述肿瘤靶向性纳米粒为球形壳核结构，包括pfob核心以及环绕在pfob核心外的ir780核脂质体膜，所述ir780核脂质体膜包括脂质体层以及ir780碘化物颗粒，所述肿瘤靶向性纳米粒的粒径范围为220～320nm。

说明：

pfob指的是：全氟辛烷基溴化物。

进一步，所述肿瘤靶向性纳米粒的电位为-28.32～-19.48mv，载药量为3.87％～4.87％，包封率为85.7％～87.9％。

本发明技术方案的有益效果为：本发明技术方案中的肿瘤靶向性纳米粒，通过使用pfob作为核心并设置ir780核脂质体膜环绕在pfob核心外，可以有效的增加细胞与纳米粒的结合效率，孵育两个小时以后的结合率在80％以上，极大地提高了结合率，可以用更少的药品形成更好的成像效果；并且光热转换效率以及光热稳定性高，红外光照射1分钟即可达到40℃以上；且本发明的肿瘤靶向性纳米粒在水溶液中分散良好：生物相容性良好，肿瘤靶向性高，无毒副作用，可以通过术前光声成像、ct成像、近红外荧光成像评估肿瘤，术中近红外荧光引导下最优化切除肿瘤，并在术中通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

本申请还公开了一种肿瘤靶向性纳米粒的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将dspc、dspe-peg2000、胆固醇以及ir780碘化物混合并溶于二氯甲烷中；

(2)避光旋转蒸发；

(3)加入磷酸盐缓冲液进行水化洗膜；

(4)加入pfob化合物；

(5)将溶液进行冰水浴声振；

(6)声振结束后对溶液进行离心；

(7)使用磷酸盐缓冲液多次清洗后，收集纳米粒成品；

(8)在2℃～5℃的环境下避光保存。

说明：

dspc指的是：二硬脂酰磷脂酰胆碱；

dspe-peg2000指的是：二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-n-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000。

本方法具有简单、便捷，产物的粒径均一，分散性良好等特点，通过本方法制备的肿瘤靶向性纳米粒生物相容性良好，肿瘤靶向性高，无毒副作用，可以通过术前光声成像、ct成像、近红外荧光成像评估肿瘤，术中近红外荧光引导下最优化切除肿瘤，并在术中通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

进一步，dspc、dspe-peg2000、胆固醇以及ir780碘化物的质量比例为12:4:4:1。

进一步，步骤(2)中，旋转蒸发时长为50～70min。

进一步，步骤(5)中，冰水浴声振的功率为125w,时长为5～8min,on:off的参数设置为5s:5s。

进一步，步骤(6)中，离心的转速为6000～8000r/min。

本申请还公开了肿瘤靶向性纳米粒的应用，将所述肿瘤靶向性纳米粒用作近红外光热治疗试剂、近红外荧光成像探针、光声成像探针、磁共振成像和ct扫描成像的造影剂。

进一步，将所述肿瘤靶向性纳米粒通过近红外荧光引导应用于在肿瘤切除手术中。

进一步，将所述肿瘤靶向性纳米粒应用于术中，通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

附图说明

图1为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的结构示意图；

图2为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的在透射电镜下的形态图片；

图3为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的粒径统计图；

图4为不同浓度的肿瘤靶向性纳米粒的紫外吸收光谱；

图5为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的紫外吸收峰图谱；

图6为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的多模态成像实验的荧光成像图；

图7为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的多模态成像实验的光声成像图；

图8为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的多模态成像实验的ct成像图；

图9为不同浓度的肿瘤靶向性纳米粒在激光辐照下的温度曲线图；

图10为不同浓度的肿瘤靶向性纳米粒的为在激光辐照下不同时间点的热像图；

图11为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的实施例的寻靶实验中显微镜下癌细胞的对普通纳米粒和本申请的肿瘤靶向性纳米粒的吞噬情况照片；

图12为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒的实施例的寻靶实验中流式监测细胞与图11中两种纳米粒的结合率随时间变化的柱状图；

图13为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒实施例中的安全性试验结果图；

图14为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验的光声成像图；

图15为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验中为肿瘤区域内光声信号强度值柱状图；

图16为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验的ct成像图；

图17为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验中不同时间点肿瘤区域的信号强度与未注射靶向性纳米粒时的比值柱状图；

图18为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验的近红外荧光成像图；

图19为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于体内多模态成像实验中肿瘤区域近红外荧光强度值的柱状图；

图20为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中导航的实验中不同时间点近红外实时显像肿瘤及术后肿瘤组织的h&e染色图；

图21为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中导航的实验中不同时间点肿瘤组织与周围正常组织荧光强度的比值的柱状图；

图22为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中导航的实验中实验小鼠颈部淋巴结转移瘤的近红外荧光成像和luc生物发光显像；

图23为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中导航的实验中实验小鼠在术中近红外实时显像转移淋巴结及术后切除组织的h&e染色图；

图24为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验的光热治疗原理模式图；

图25为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验中各组实验小鼠的温度曲线图；

图26为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验中近红外热成像仪记录的不同时间点的热像图；

图27为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验中各治疗组小鼠肿瘤体积的变化曲线图；

图28为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验中各治疗组小鼠生存时间的变化图；

图29为本发明一种肿瘤靶向性纳米粒应用于术中辅助光热治疗实验中各治疗组小鼠体重的变化曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

如图1至图5所示,本实施例的肿瘤靶向性纳米粒，所述肿瘤靶向性纳米粒为球形壳核结构，包括pfob核心以及环绕在pfob核心外的ir780核脂质体膜，所述ir780核脂质体膜包括脂质体层以及ir780碘化物颗粒，所述肿瘤靶向性纳米粒的粒径范围为220～320nm。所述肿瘤靶向性纳米粒的电位为-28.32～-19.48mv，载药量为3.87％～4.87％，包封率为85.7％～87.9％。

本实施例还公开了一种肿瘤靶向性纳米粒的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将dspc、dspe-peg2000、胆固醇以及ir780碘化物按照质量比为12:4:4:1的比例混合并溶于15ml的二氯甲烷中；

(2)避光旋转蒸发50～70min，本实施例中选为1小时；

(3)加入2ml磷酸盐缓冲液进行水化洗膜；

(4)加入200ul的pfob化合物；

(5)将溶液进行冰水浴声振；冰水浴声振的功率为125w,时长为5～8min，本实施例中设置为6min,on:off的参数设置为5s:5s。

(6)声振结束后对溶液进行离心；离心的转速为6000～8000r/min，时长为4min～6min，本实施例中，转速为7000r/min，时长为5分钟。

(7)使用磷酸盐缓冲液清洗3次后，收集纳米粒成品；

(8)在2℃～5℃的环境下避光保存，优选为4℃的保存环境。

本方法具有简单、便捷，产物的粒径均一，分散性良好等特点，通过本方法制备的肿瘤靶向性纳米粒生物相容性良好，肿瘤靶向性高，无毒副作用，可以通过术前光声成像、ct成像、近红外荧光成像评估肿瘤，术中近红外荧光引导下最优化切除肿瘤，并在术中通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

本实施例还公开了肿瘤靶向性纳米粒的应用，将所述肿瘤靶向性纳米粒用作近红外光热治疗试剂、近红外荧光成像探针、光声成像探针、磁共振成像和ct扫描成像的造影剂。将所述肿瘤靶向性纳米粒通过近红外荧光引导应用于在肿瘤切除手术中。将所述肿瘤靶向性纳米粒应用于术中，通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

通过本发明技术方案制备的肿瘤靶向性纳米粒，可以有效的增加细胞与纳米粒的结合效率，孵育两个小时以后的结合率在80％以上，极大地提高了结合率，可以用更少的药品形成更好的成像效果；并且光热转换效率以及光热稳定性高，红外光照射1分钟即可达到40℃以上；且本发明的肿瘤靶向性纳米粒在水溶液中分散良好：生物相容性良好，肿瘤靶向性高，无毒副作用，可以通过术前光声成像、ct成像、近红外荧光成像评估肿瘤，术中近红外荧光引导下最优化切除肿瘤，并在术中通过辅助光热治疗杀灭残余病灶。

为了验证本实施例的效果，本实施例中进行了以下实验：

1、体外多模态成像实验：

通过小动物活体成像仪检测肿瘤靶向性纳米粒的近红外成像能力，具体参数：激发波780nm，发射波长845nm，结果如图6所示，随着浓度的增加，纳米粒的荧光强度增加。

通过小动物光声成像仪检测纳米粒的光声成像能力，具体参数：频率21mhz，pagain：36db；2dgain：18db；wavelength：780nm。结果如图7所示，随着浓度的增加纳米粒的光声强度增加。

通过飞利浦ct系统检测本实施例的纳米粒的ct成像能力具体参数：tubecurrent：400ma；tubevoltage：120kv。如图8所示，随着纳米粒浓度的增加，ct信号值增强。

经过上述实验可知，本实施例的肿瘤靶向性纳米粒具有良好的多模态成像能力。

2、体外光热实验：

将不同浓度的肿瘤靶向性纳米粒溶于磷酸盐缓冲液后，用近红外激光辐照，设置激光波长808nm，功率：1w/cm²，辐照时间：5分钟。用近红外热成像仪监测纳米粒的温度变化。如图9和图10所示，可以看出相对于磷酸盐缓冲液以及ir780碘化物，肿瘤靶向性纳米粒经激光辐照后温度明显上升，且随着浓度的增加，温度上升的速度明显加快，且照射1分钟左右，肿瘤靶向性纳米粒的温度就可以上升到40℃左右，因此具有很高的光热效率，且持续照射5分钟，温度在后续保持平稳不变，具有很好光热稳定性。

3、寻靶实验：

将50μg/ml普通纳米粒(np)以及肿瘤靶向性纳米粒(np-ir780)与小鼠乳腺癌细胞4t1/luc(表达荧光素酶基因)共孵育0.5h、1h、2h后，分别通过倒置荧光显微镜和流式细胞术监测两种纳米粒的靶向能力。实验结果如图11和图12所示，通过图11可以看出，癌细胞在相同的时间内可以吞噬更多的肿瘤靶向性纳米粒，通过图12可以看出，普通的纳米粒在孵育两个小时以后的结合率在60％以下，而本实施例的肿瘤靶向性纳米粒孵育两个小时以后的结合率在80％以上，极大地提高了结合率。

4、安全性评估实验：

为了证明本实施例的肿瘤靶向性纳米粒的安全性，本实施例中，取健康的babl/c小鼠，经尾静脉注射剂量分别为25mg/kg、50mg/kg的肿瘤靶向性纳米粒14天后，取血分别做血细胞分析和生化分析，如下表1所示，对器官(心，肝，脾，肺，肾)做病理h&e检查，结果如图13所示，通过与对照组(注射pbs)相比较，可见各项数据未见明显差异。说明本实施例的肿瘤靶向性纳米粒在本实验所用剂量50mg/kg以内生物安全性良好，无明显毒性。

表1

5、体内多模态成像实验：

首先建立小鼠乳腺癌肿瘤模型：在小鼠第二个乳腺的位置皮下注射5x10⁵个4t1/luc肿瘤细胞,等待7天左右即可成功建立小鼠原位乳腺癌肿瘤模型。

通过尾静脉注射剂量为25mg/kg的肿瘤靶向性纳米粒至荷瘤(4t1/luc)小鼠(babl/c)后在不同的时间点分别通过小动物光声成像仪、飞利浦ct系统和小动物活体成像仪监测纳米粒作为造影剂在体内的多模成像能力。具体参数见体外多模态成像实验。

因为肿瘤细胞4t1/luc表达荧光素酶，通过腹腔注射荧光素底物后，可通过小动物活体成像仪显示肿瘤，如图14至图19所示，可以发现注射纳米粒24h,48h后，小鼠肿瘤组织区域内的光声信号、ct信号以及近红外荧光信号明显增强，且与肿瘤组织生物发光信号一致，说明该纳米粒可以作为体内多模态显示肿瘤的造影剂。

6、术中导航应用实验：

小鼠乳腺癌肿瘤模型成功建立后，经尾静脉注射肿瘤靶向性纳米粒，在24h和48h后，经戊巴比妥钠麻醉小鼠后，切开肿瘤区域的皮肤，暴露肿瘤于体式荧光显微镜下，发现可以通过术中的近红外成像，可以实时的显示肿瘤，有助于术中精准的发现并切除肉眼看不见的肿瘤，切除发光的组织在术后病理提示肿瘤组织，正如图20和图21所示，其中，未予以纳米粒注射的荷瘤小鼠用于对照。体式荧光显微镜的参数：滤光片组：激发光710/75nm、发射光810/90nm、曝光时间：20s。

因此使用本实施例的肿瘤靶向性纳米粒配合近红外荧光可以实现术中导航。除此以外，淋巴结转移是乳腺癌最常见的转移途径，本实施例中通过建立小鼠乳腺癌淋巴结转移瘤模型，检测肿瘤靶向性纳米粒还可用于发现转移的淋巴结。

具体的，建立小鼠乳腺癌颈部淋巴结转移瘤模型：通过在耳廓皮下接种4t1/luc细胞，4周左右，通过小动物活体成像仪检测luc生物荧光报告基因，成功的建立淋巴结转移瘤模型且与经尾静脉注射np-ir780纳米粒48小时后，纳米粒的聚集部位一致，如图22所示。通过手术切开颈部皮肤，暴露淋巴结转移瘤于体式荧光显微镜下，如图23所示，发现可以通过术中的近红外成像，清晰的显示转移的淋巴结。通过近红外荧光导航，手术切除发光的组织，术后病理检查提示肿瘤转移病灶。说明本实施例的肿瘤靶向性纳米粒可以用于辅助术中发现并切除淋巴结转移灶。

7、术中辅助光热治疗应用实验：

对于手术无法切除的微小转移病灶可以通过术中光热进行辅助治疗，我们已经证实该本实施例的肿瘤靶向性纳米粒对肿瘤组织具有靶向性，且该纳米粒中的ir780颗粒为近红外的荧光染料，可用于光热治疗。

本实验中，通过手术切除大部分的肿瘤组织，模拟不完全的肿瘤切除术验证手术辅助光热治疗的效果。然后进行实验分组：

包括：对照组(control)、肿瘤靶向性纳米粒组(np-ir780：仅注射肿瘤靶向性纳米粒)、激光组(laser：功率1w/cm的808激光，辐照肿瘤区域10min)、光热治疗组(ptt：注射25mg/kg肿瘤靶向性纳米粒48h后，功率1w/cm的808激光，激光辐照肿瘤区域10min)，手术组(surgery：注射25mg/kg肿瘤靶向性纳米粒48h后，在近红外荧光导航下手术切除大部分肿瘤组织)；手术+光热治疗组(surgery+ptt：注射25mg/kg肿瘤靶向性纳米粒48h后，在近红外荧光导航下手术切除大部分肿瘤组织后，用808激光，功率1w/cm，辐照残存肿瘤区域和肿瘤床10min)。

治疗结束后，观察并记录各组小鼠体重、肿瘤体积变化和生存时间。如图24至图29所示，可以发现光热组和手术加光热组经激光辐照后肿瘤区域温度明显升高至50℃左右，而激光组未见明显的温度变化。治疗结束后观察手术+光热组的肿瘤体积最小且总的生存时间最长，证明手术辅助术中的光热治疗相对于单独的手术或者光热能明显改善荷瘤小鼠的愈后。而且在治疗后的2周内，各组小鼠的体重未见明显差异，说明该纳米粒介导的术中光热的生物安全性良好。

以上的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。