一种新型稀土纳米双模态显像剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及影像医学技术领域，具体是一种新型稀土纳米双模态显像剂及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，多模态成像和诊疗一体化显像剂的开发已经成为分子影像学领域研究的热点。ct(电子计算机断层扫描)和mri(磁共振成像)优势互补，是临床最常用的肿瘤影像学检查手段。ct、mri双模态成像对比剂可提高对疾病的检出率和诊断准确性，有利于更准确勾勒肿瘤边界，为进一步放疗提供准确的定位。目前，临床常用的ct和mri对比剂尚不能很好地满足双模态成像需求。

一些学者进行ct、mri双模态成像对比剂的研究，主要包括fe-bi、fe-pt、gd-au、au或taox修饰fe3o4，这些纳米粒子mri成像主要是应用铁的氧化物。但铁氧化物的磁化在低磁场(<1t)已饱，而且其r2驰豫并未随着磁场从0.5t到9.4t的提高而增大。由于高空间分辨率和较短的成像采集的磁共振成像的需要，且高磁场mri(>3t)已经应用，开发高性能的、高磁场mri、ct双模态造影剂显得尤为重要。在所有镧系元素离子中，顺磁性的钬离子(ho³⁺)具有最高有效磁矩，可能是超高场磁共振成像最有前途的造影剂候选者。

mri的对比图像是基于不同组织之间的质子密度差异和不同的纵向(t1)和横向(t2)驰豫时间。ct成像主要是基于不同密度物质对x射线不同的衰减能力。钬离子(ho³⁺)可成为t2对比剂由于其具有更短的电子弛豫时间(10-13s)和高效磁矩(约10.6μb)。bu等率先报道掺杂ho³⁺的naybf4纳米粒子可用于3tmri成像，同时实现上转换发光和ct成像。2016年，ni等首次报道dspe-peg5k涂层的nahof4的纳米颗粒可作为高磁场mri和ct双模态对比剂。

胰腺癌在临床上需要采用综合治疗，尤其对于局部晚期患者，放射治疗更是必、可少的治疗手段，尽管如此，胰腺癌治疗后依然存在复发及远处转移，主要原因是在放射治疗过程中，肿瘤细胞对放射线耐受及周围重要组织脏器的射线损伤，其中氧自由基起到关键作用，研究表明，ceo2是体内氧自由基的调节者，可减轻由x射线对机体正常细胞的损伤，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

ceo2具有与抗氧化蛋白超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等类似的抗氧化活性，能够清除氧自由基ros。ceo2的这种特性与不同价态的ce³⁺和ce⁴⁺在相互转化的过程中能够与机体内的氧自由基结合有关。colon等研究表明ceo2纳米粒子能保护结肠上皮细胞，避免在辐射治疗中引起的伤害，并降低了ros，上调了超氧歧化酶，纳米ceo2降低了小鼠结肠正常细胞的凋亡。wason和baker的一项研究表明，用单纯辐射(rt)做对照组，对照组注射生理盐水，纳米ceo2+rt组为实验组，进行小鼠体内实验，结果表明，患胰腺癌的小鼠在放射治疗过程中用ceo2处理放疗效果更显著。

以镧系元素(ln³⁺)为基础的顺磁性纳米颗粒有很大的可能成为磁共振成像(mri)的显像剂，其中ho是所有镧系元素中顺磁性最强的物质。此外，ho的原子序数为67，高于碘的原子序数53，具有较高x线衰减能力。ceo2是一种依据环境酸碱度进行氧化还原反应的氧自由基的调节者，一方面可减轻由x射线对机体正常细胞(偏中性环境)的损伤，另一方面，在肿瘤的酸性环境中具有氧化作用，增强对肿瘤细胞的杀伤，具有放疗增敏作用。

ct和mri是胰腺癌临床诊断中最常用的两种影像学方法，两者相互补充。但目前常用的ct或mri对比剂通常不能进行双模态显像，也不具有治疗作用。如能开发一种同时具有ct、mri双模态成像和治疗作用的显像剂，无疑对胰腺癌的诊治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型稀土纳米双模态显像剂及其制备方法和应用，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型稀土纳米双模态显像剂，该显像剂为nahof4@ceo2纳米粒子。

一种新型稀土纳米双模态显像剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)nahof4纳米粒子的制备：往烧瓶中加入2mmolhocl3·6h2o、8ml油酸和30ml十八碳烯，在室温下搅拌1h，然后缓慢加热到120℃，再加热到160℃，在160℃下维持1h，冷却至室温，往烧瓶中加入10ml溶解有naoh和nh4f的甲醇溶液，在室温下搅拌三个小时，之后缓慢加热到230℃，并在230℃下维持15min，冷却至室温，对反应后的混合液进行离心分离，收集上清液即为nahof4溶液，将nahof4溶液加入到5mldspe-peg5k的氯仿溶液中，搅拌15min，之后在60℃下进行旋转蒸发，然后添加5ml去离子水，超声5min，得到peg-nahof4；

(2)ceo2纳米粒子的制备：称取适量的ce(no3)3·6h2o，配制成浓度为0.15mol·l^-1的ce(no3)3的水溶液，先往上述ce(no3)3的水溶液中滴加适量3％的h2o2，再在磁力搅拌下滴加浓度为2mol·l^-1的nh3·h20，直到溶液的ph值大于9为止，然后进行离心分离，对沉淀进行超声震荡水洗3次，收集沉淀，然后将沉淀在120℃下恒温干燥12h，得到浅黄色ceo2纳米粒子；

(3)nahof4@ceo2纳米粒子的制备：称取一定量步骤(2)所制得的ceo2纳米粒子放入去离子水中，超声分散30min，得到分散均匀的水溶胶，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，调节水溶胶的ph值为6.3，往上述水溶胶中滴加步骤(1)所制得的nahof4溶液，继续搅拌1h，使nahof4充分吸附到ceo2纳米粒子表面，然后将反应液加热到70℃，在70℃下反应2h，得到nahof4@ceo2纳米粒子(nps)。

进一步地，步骤(1)中10ml的甲醇溶液中溶解5mmolnaoh和8mmolnh4f。

进一步地，步骤(1)中dspe-peg5k的氯仿溶液的浓度为20mg/ml。

进一步地，步骤(3)中nahof4与ceo2的摩尔比为1:15。

一种新型稀土纳米双模态显像剂的应用，该显像剂在ct和mri双模态显像中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一是本发明制备的nahof4@ceo2纳米粒子中的钬(ho)和铈(ce)均具有较高的原子序数，钬(ho)和铈(ce)的原子序数分别为67和58，均高于碘(i)的原子序数(i的原子序数为53)，ho的衰减系数高于i(在100kev条件下，ho的衰减系数为3.49cm².g^-1，i的衰减系数为1.94cm².g^-1)，该纳米粒子可作为ct成像对比剂；该纳米粒子的尺寸小(1-100nm)，该纳米粒子可以更容易进入内径为微米尺寸的毛细血管内，由于癌变组织的高通透性和滞留效应，纳米颗粒可更多的沉积在癌变组织内，对癌变区域成像效果更佳；

二是本发明制备的nahof4@ceo2纳米粒子中的ho具有很强的顺磁性作用，能够明显缩短t2弛豫时间；另一方面，通过ho和ce高原子序数对x射线衰减能力强的作用，可用于ct成像，其成像效果优于临床碘对比剂，因此，nahof4@ceo2纳米粒子具有成为mri、ct双模态显像剂的价值，本发明进一步通过体外实验研究表明该纳米粒子能明显增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用，具有体外放疗增敏作用；

三是本发明制备的nahof4@ceo2纳米粒子并未影响ceo2自身固有的结构，通过体外mtt实验及细胞克隆增殖实验，证实它具有良好的放疗增敏效果，本发明所用的胰腺癌细胞内酸性环境，可使ce³⁺向ce⁴⁺转化，清除射线产生的氧自由基ros，提高肿瘤细胞对射线的敏感性，而正常细胞受到射线损伤时，ceo2启动还原反应，从而保护正常组织，减轻辐射损害。

附图说明

图1为本发明一种新型稀土纳米双模态显像剂nahof4@ceo2纳米粒子的透射电子显微镜图；

图2为本发明mtt实验中不同浓度nps下haec、panc-1细胞存活率情况图；

图3为本发明尾静脉注射生理盐水(control)和不同浓度的nps裸鼠主要脏器组织的he染色切片图(200×)；

图4当中的a图为不同浓度iopamidol与nps的ct图；b图是对a图的统计；

图5当中的a图和b图分别为nps的浓度与弛豫率r1、r2之间关系图；

图6当中的a图为不同浓度nps下mrit2wi图；b图是对a图的统计；

图7当中的a图为mtt实验中不同浓度的nps培养后放疗对细胞生存率的影响图；b图为细胞克隆形成实验评价nps对细胞放疗增敏效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种新型稀土纳米双模态显像剂，该显像剂为nahof4@ceo2纳米粒子。

一种新型稀土纳米双模态显像剂的制备方法，该制备方法中主要的实验仪器及实验材料包括：

六水合氯化钬(hocl3·6h2o，>99.99％)、十八碳烯(oed，90％)、氟化铵(nh4f，>99.99％)、六水亚硝酸铈(ce(no3)3·6h2o，>99.99％)和甲氧基聚乙醇(dspe-mpeg5000，>99％)，从普迈生物公司(上海，中国)购买；

人主动脉内皮细胞(haec)、人胰腺癌细胞(panc-1)，由中国科学院上海肿瘤研究所提供；

256层ict显像仪器，由荷兰philips公司生产；

niumag0.5tmri小动物成像系统，由中国上海纽迈公司生产；

varian23ex直线加速器，由美国瓦里安公司生产。

该制备方法包括以下步骤：

(1)nahof4纳米粒子的制备：往烧瓶中加入2mmolhocl3·6h2o、8ml油酸和30ml十八碳烯，在室温下搅拌1h，然后缓慢加热到120℃，再加热到160℃，在160℃下维持1h，冷却至室温，往烧瓶中加入10ml溶解有5mmolnaoh和8mmolnh4f的甲醇溶液，在室温下搅拌三个小时，之后缓慢加热到230℃，并在230℃下维持15min，冷却至室温，对反应后的混合液进行离心分离，收集上清液即为nahof4溶液，将nahof4溶液加入到5mldspe-peg5k的氯仿溶液中，搅拌15min，之后在60℃下进行旋转蒸发，然后添加5ml去离子水，超声5min，得到peg-nahof4；

(2)ce02纳米粒子的制备：称取适量的ce(no3)3·6h2o，配制成浓度为0.15mol·l^-1的ce(no3)3的水溶液，先往上述ce(no3)3的水溶液中滴加适量3％的h2o2，再在磁力搅拌下滴加浓度为2mol·l^-1的nh3·h20，直到溶液的ph值大于9为止，然后进行离心分离，对沉淀进行超声震荡水洗3次，收集沉淀，然后将沉淀在120℃下恒温干燥12h，得到浅黄色ceo2纳米粒子；

(3)nahof4@ceo2纳米粒子的制备：称取一定量步骤(2)所制得的ceo2纳米粒子放入去离子水中，超声分散30min，得到分散均匀的水溶胶，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，调节水溶胶的ph值为6.3，往上述水溶胶中滴加步骤(1)所制得的nahof4溶液，nahof4与ceo2的摩尔比为1:15，继续搅拌1h，使nahof4充分吸附到ceo2纳米粒子表面，然后将反应液加热到70℃，在70℃下反应2h，得到nahof4@ceo2纳米粒子。

一种新型稀土纳米双模态显像剂的应用，该显像剂在ct和mri双模态显像中的应用。

效果例：

(1)实验对象：本发明实施例1所制得的nahof4@ceo2纳米粒子(nps)。

(2)实验方法：

(a)nahof4@ceo2纳米粒子理化特性及表征测定

透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscopy，tem)直观显示nps的形状、分散度、均匀度及团聚情况；用动态光散射仪测量nps在水溶液中的电动电势和平均粒径的分布情况；电感耦合等离子体光学发射仪测量nps中ho、ce元素的含量，计算摩尔质量；

(b)体外、内细胞毒性的评估

采用haec、panc-1细胞通过mtt实验验证其细胞毒性，不同浓度(0、50、100、200、400和800μg/l)的nps对细胞生存率的影响，每个浓度复种5个复孔，实验重复三次，选取生长良好雄性裸鼠，记录体重，随机分为实验组与对照组，实验组设三组不同药物浓度组，每组3只，尾静脉注射不同浓度(0、5、10、20mg/kg)的ho粒子nps15ml，相同条件下饲养，隔天记录裸鼠体重，15天后，获取裸鼠血液和组织样本，血液样本行实验室检查，检测血常规：红细胞计数(redbloodcells，rbc)、白细胞计数(whitebloodcell，wbc)、血小板计数(bloodplatelet，plt)，肝功能：谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，alt)、谷草转氨酶(aspartatetransaminase，ast)，肾功能：血肌酐(creatinine，cre)、尿素氮(bloodureanitrogen，bun)，主要脏器(肺、心脏、肾脏、脾脏、肝脏、胰腺)进行组织he染色。

(c)体外ct、mri成像效果评价

使用philips256ict。扫描条件：120kv，130ma，层厚、层距均为1mm，扫描时间2s。分别对不同浓度测得不同浓度(0、1、2、4g/l)iopamidol与nps进行横断位ct检查，将得到的图像传输至图片存档及通信系统(picturearchivingandcommunicationsystems，pacs)，在pacs系统上选取获得图像最大断面测量ct值，记录数据，每组实验重复3次，求平均值。

使用niumag0.5tmri成像系统，应用nmr-caanalyzingsoftware造影剂专用分析软件，测定不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mm)nps造影剂t1、t2弛豫时间及弛豫效率r1、r2测试，每组实验重复3次，求平均值。应用nmrimagingsoftware成像软件获得不同浓度nps的二维图像评价显像效果，对比图像信号强度行统计学分析。

(d)体外放疗增敏研究

(a)mtt法检测nps对panc-1细胞放疗增敏效应

实验分组：①对照组，②纳米组(nps)，③照射组(ri)，④联合组(nps+ri)。取处于对数生长期的panc-1细胞，接种于96孔板中，复种5个复孔，待细胞贴壁生长后，加入不同浓度梯度(0nm、5nm、10nm、20nm)的nps培养液。24小时后，③组和④组进行x线照射，剂量为10gy(6mvx-ray，ssd100cm，加2cm等效物)，培养24小时后用mtt法检测各孔细胞的存活率。

(b)细胞克隆形成实验进一步评价nps对panc-1细胞放疗增敏效应

实验分组：①对照组，②纳米组(nps)，③照射组(ri)，④联合组(nps+ri)，其中③、④按不同照射剂量(0cy、2cy、4cy、6cy、8cy、10cy)分为不同的亚组。将对数生长期的细胞，活细胞比例>90％，细胞接种于6孔板中，每组复种3孔，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nm的nps培养液。24小时后弃培养液，各组均加入新鲜的培养液，③、④组中各亚组按不同剂量梯度进行照射，处理结束后将细胞置于培养箱中继续，直孔板中出现肉眼可见的克隆吋，终培养。最后，固定、染色、显微镜下观察计数>50个细胞的克隆数，计数存活分数。

(e)统计学方法

应用spss20.0统计软件分析，对于单一处理组实验采用双尾t检验，对于含有两处理组实验采用two-anova检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

(3)实验结果

(a)成功制得nahof4@ceo2纳米粒子(nps)

nahof4@ceo2纳米粒子为淡浅黄色、无味的粉末状固体颗粒。tem结果表明合成的nahof4@ceo2纳米粒子形状为类圆形，形成良好的单分散性，未见明显团聚现象，nps的平均直径约为16nm(如图1所示)；动态光散射结果显示nahof4@ceo2纳米粒子平均电势约为-6mv，粒子平均粒径呈正态分布，分布范围为13-20nm，中位粒径为17±0.8nm；电感耦合等离子体光学发射仪测量nahof4@ceo2纳米粒子中ho及ce的含量分别为2715.3mg/l和3976.1mg/l。

(b)体内、外细胞毒性的评估

(a)体外细胞毒性mtt实验

mtt实验结果表明不同浓度(0、50、100、200、400和800μg/l)nps处理haec和panc-1细胞后，haec细胞生存率分别为92.51％、91.45％、93.25％、92.43％、89.52％；panc-1细胞生存率分别为96.54％、93.28％、90.85％、92.56％、89.57％。实验结果表明，在不同浓度下，haec和panc-1细胞的存活率与对照组相比无显著差异(p>0.05；双尾t检验)，如图2所示。

(b)组织学评估体内

不同浓度(0、5、10、20mg/kg)ho³⁺尾静脉注射裸鼠15天后，血液样本实验室检查对照组血常规结果为：rbc计数：10.5×10⁶/mm³，wbc计数：7.91×10⁶/mm³，plt计数：770.5×10⁶/mm³；实验最高浓度(20mg/kg)组血常规结果为rbc计数：11.0×10⁶/mm³，wbc计数：8.11×10⁶/mm³，plt计数：690.5×10⁶/mm³。对照组肝肾功能主要指标结果为：alt：180iu/l，ast：241iu/l；cre：28.7mol/l，bun：7.81mmol/l，实验最高浓度组alt：201iu/l，ast：257iu/l，cre：27.9mol/l，bun：8.21mmol/l。实验结果表明，实验组裸鼠血细胞计数、肝肾功能结果与对照组相比无显著差异，差异有统计学意义(p>0.05；双尾t检验)。裸鼠主要组织器官(肺、肝、脾、肾脏、心和胰腺)h&e染色分析表明(如图3所示)，nps对裸鼠主要脏器未见明显的损伤。

(c)体外成像部分

(a)体外ct成像效果

philipsict测得不同浓度iopamidol的ct值分别为1hu、15hu、27hu、45hu；nps的ct值分别为2hu、28hu、74hu、234hu。以iopamidol0g/l为对照，统计结果显示(如图4所示)，随着两种药物浓度的增加，ct值均逐渐升高(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；双尾t检验)；iopamidol组和nps组相比，相同浓度下，nps组比iopamidol组的ct值更高，有显著差异(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；two-anova检验)。实验结果表明，nps可作为ct成像造影剂，且相同浓度下nps的ct造影效果优于iopamidol。

(b)mri成像效果评价

nmr-caanalyzingsoftware造影剂专用分析软件测定不同浓度nps的t1值分别为14285.7ms、7692.3ms、2380.5ms、1785.7ms、1282.5ms；t2值分别为217.3ms、92.5ms、48.9ms、40.3ms、24.4ms。依据r＝1/t计算出各样品弛豫率，对数据采用双尾t检验进行统计学处理(如图5所示)。结果表明，随着样品浓度的增加，t2值明显缩短，弛豫率r2增大，nps具有明显的短t2效应，使其可成为t2造影剂。

nmrimagingsoftware成像软件获取不同浓度nps2mrit2wi图像(如图6a所示)，随着样品浓度增加，mrit2wi图像逐渐变黑；统计结果(如图6b所示)随样品浓度的增加，mri图像信号强度均逐渐减小(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；双尾t检验)。

(d)体外放疗增敏

(a)体外放疗mtt实验

实验结果表明(如图7a所示)，单纯10nmnps培养后细胞生长未见明显抑制，存活率约为93.58％；单纯照射后细胞存活率降低，生长明显抑制；联合照射后细胞的生长抑制较单纯照射更为明显，其抑制率随着浓度的增加而升高，与浓度呈正相关，各组细胞存活率之间有显著差异(**，p<0.01；***，p<0.001；two-anova检验)。

(b)细胞克隆形成实验

实验结果表明(如图7b所示)，不同剂量射线照射后，细胞形成的克隆数明显减少，存活分数降低，且随着射线剂量的增加而减少，差异存在统计学意义(***，p<0.001；two-anova检验)。而单纯nps组与空白组之间细胞存活量之间并无统计学差异(p＞0.05，two-anova检验)。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。