羧基化的含氮多壁碳纳米管在小鼠体重增加和免疫增强中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及碳纳米管的新用途，具体涉及一种羧基化的含氮多壁碳纳米管在小鼠体重增加和免疫增强中的应用。

背景技术：

碳纳米管(carbonnanotubes，cnts)作为一种纳米级别的新型碳材料，因其独特的电、磁、热和机械特性，早已广泛应用于电子元件、复合材料和能源利用等领域。近年来，以cnts生物学特性应用为目标的探索又成为该纳米材料一个新的研究领域。单壁碳纳米管(singlewallcarbonnanotubes，swcnts)是由单层石墨构成的管状结构(直径为1-2nm)；而多壁碳纳米管(multiwallcarbonnanotubes，mwcnts)是由多个石墨圆柱体组成的同心圆结构(直径为2-25nm)。cnts的生物学特性得以深入研究的前提是良好的生物相容性和无(弱)毒副作用等。然而，近几年有报道指出，swcnts在临床应用中常引起机体氧化应激、炎性反应和其他副作用。为此，寻找一种副作用更小的swcnts替代物就显得尤为重要。

有研究表明，mwcnts掺杂氮元素后，会使该材料的电子传递能力显著增加，对还原性辅酶和抗坏血酸等生理过程的电催化作用显著增强，表现出特有的生物学特性。目前，mwcnts的相关研究主要集中在该材料的物理、化学特性以及识别或阻止特定蛋白质等方面。但对生物体代谢和免疫等方面的研究至今未见。特别是对小鼠体重增加和免疫增强中的作用研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种羧基化的含氮多壁碳纳米管(mwcntn-cooh)在小鼠体重增加和免疫增强中的应用。

本发明首次发现，通过肌肉注射mwcntn-cooh可显著增加小鼠的体重，且对小鼠的免疫水平有明显增强作用，由此提出了本发明。

本发明的第一方面，提供羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管在促进哺乳动物体重增长中的应用。

优选的，所述哺乳动物为小鼠。

本发明的第二方面，提供羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管在提高哺乳动物免疫水平中的应用。

优选的，所述哺乳动物为小鼠。

优选的，所述提高免疫水平包括：提高体液免疫和细胞免疫水平，促进补体系统激活。

本发明的第三方面，提供羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管在制备免疫增强药物中的应用。

本发明的第四方面，提供羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管在制备疫苗佐剂中的应用。

进一步优选的，上述应用中，所述羧基化的含氮多壁碳纳米管的粒径为2-4μm，管径为10-20nm，氮元素含量为3-4％。

本发明的第五方面，提供一种免疫增强药物，其以羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管为有效成分。

本发明的第六方面，提供一种疫苗，其以羧基化的含氮多壁碳纳米管或含氮多壁碳纳米管为佐剂。

本发明的有益效果：

本发明研究发现，使用剂量为1.0mg/kg的mwcntn-cooh可显著增加小鼠的体重，且对小鼠的免疫水平有明显增强作用，可作为疫苗佐剂的候选材料，这对于疫苗的开发和利用提供了良好的物质基础，填补了mwcntn-cooh在生物体代谢和免疫学研究方面的空白。

附图说明

图1：羧基化的含氮多壁碳纳米管(mwcntn-cooh)的物理特性示意图，其中a和b为mwcntn-cooh的扫描电镜图；c为mwcntn-cooh的粒径分布图，该纳米材料的粒径主要分布在2-4μm之间；d和e为该纳米材料的透射电镜图；f图为该纳米管的管径分布，管径在10-20nm之间；g为mwcntn-cooh的全元素分析xps图；h为mwcntn-cooh混于生理盐水状态下的吸光度曲线图；i为mwcntn-cooh主要元素的所占比例分析。

图2：不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠体重(a)、肝脏(b)和脾脏(c)重量变化。

图3：不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠血液白细胞cd4+/cd8+比值变化。

图4：不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠血清中细胞因子变化，其中igg反应体液免疫；il-2、il-4、il-6、il-10、ifn-γ和tnf-γ反应细胞免疫水平；c3和c5a反应补体水平；chol(总胆固醇)反应肥胖水平。

图5：剂量为1.0mg/kg的mwcntn-cooh所引起的小鼠血清h9n2抗体效价的变化。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前，mwcnts的相关研究主要集中在该材料的物理、化学特性以及识别或阻止特定蛋白质等方面。但对生物体代谢和免疫等方面的研究至今未见。本发明研究发现，含氮多壁碳纳米管能够增加小鼠体重和提高小鼠的免疫水平。但由于含氮多壁碳纳米管在水中的分散性欠佳，为此，本发明进一步的以羧基化的含氮多壁碳纳米管作为试验材料，配制成不同浓度的水溶液，以研究羧基化含氮多壁碳纳米管的浓度对小鼠体重和免疫水平的影响。结果发现，使用剂量为1.0mg/kg的mwcntn-cooh可显著增加小鼠的体重，且对小鼠的免疫水平有明显增强作用，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的实验试剂、耗材等均可通过商业途径获得。实施例中的实验技术方法均为常规方法和试剂说明书所建议的方法。

其中，本发明实施例中所使用的羧基化的含氮多壁碳纳米管(mwcntn-cooh)购自于中国科学院成都有机化学有限公司(中国科学院成都有机化学研究所)，产品编号为tnmcn7-cooh。本发明对实施例中所使用的mwcntn-cooh的物理特性进行了分析，结果如图1所示。

实施例1：mwcntn-cooh对小鼠体重和免疫水平的影响

1.试验方法：

准备无特定病原微生物(spf级)的昆明白雄性小鼠180只，体重为20±1g，随机分为六组(包括：五个试验组和一个对照组)，每组30只。

将mwcntn-cooh用无菌生理盐水配制成不同剂量浓度，通过腿部肌肉注射的方式分别注入到上述六组的小鼠体内，其中五个试验组分别注射0.3mg/kg、0.6mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg和6.0mg/kg剂量浓度的mwcntn-cooh；对照组注射0.0mg/kg剂量浓度的mwcntn-cooh。

在注射后的第2天、第7天和第14天，记录小鼠体重、采集并小鼠肝脏和脾脏重量。尾静脉采集小鼠血液，使用红细胞裂解液分离血液中的白细胞，使用流式细胞仪分析血液白细胞cd4+/cd8+比值，使用elisa试剂盒检测体液免疫(血清igg)和细胞免疫(血清il-2、il-4、il-6、ifn-γ和tnf-γ等)等指标。

2.试验结果：

不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠体重(a)、肝脏(b)和脾脏(c)重量变化见图2，由图2可以看出，在2dpi时，剂量为1.0mg/kg组的小鼠体重、肝脏重量和脾脏重量显著增加。

不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠血液白细胞cd4+/cd8+比值变化见图3，由图3可以看出，剂量为1.0mg/kg时的小鼠白细胞中的cd4+/cd8+比值显著增加，说明在该剂量下的mwcntn-cooh对小鼠的免疫系统有显著增强作用。

不同剂量的mwcntn-cooh所引起的小鼠血清中细胞因子变化见图4，由图4可以看出，剂量为1.0mg/kg时的mwcntn-cooh可显著提高体液免疫(igg)、细胞免疫(如il-2、il-6等)和总胆固醇(chol)水平，促进补体系统激活(即c3降解和c5合成)。

实施例2：mwcntn-cooh对疫苗保护效果的影响

1.试验方法：

准备spf级昆明白雄性小鼠60只，体重为20±2g，随机分为对照组和试验组两组，每组30只。

用鸡胚扩增h9n2禽流感病毒(h9n2aiv)，血凝抑制试验检测该病毒的毒力ha为10⁸。

用甲醛按照0.1％的体积比例加入到毒力ha为10⁸中的病毒液中，37℃摇床24h，灭活该病毒。

将剂量(1.0mg/kg)的mwcntn-cooh作为免疫佐剂与甲醛灭活h9n2aiv病毒联合，制备h9n2aiv纳米疫苗。

将上述所制备的h9n2aiv纳米疫苗通过腿部肌肉注射的方式注入到上述的试验组小鼠中。将生理盐水与甲醛灭活的h9n2aiv疫苗通过同样的方式注入到对照组小鼠中。

在小鼠被接种该纳米疫苗后的第2天、第7天和第14天，采集试验组和对照组小鼠的血液，离心取上清，用血凝抑制试验检测h9n2aiv的抗体效价。

2.试验结果：

结果见图5，由图5可以看出，试验组(h9n2aiv+mwcntn-cooh)小鼠的抗体效价从接种后的12天(12dpi)就显著高于对照组(h9n2aiv+生理盐水)小鼠的抗体效价，说明mwcntn-cooh有较好的免疫原性，可提高疫苗的保护效果，也可延长疫苗的有效保护时间。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。