人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用。

背景技术：

骨性关节炎(osteoarthlritis，oa)是一种慢性进行性骨关节病，由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。oa多见于老年人，发病率随年龄增大而增高，是以慢性进行性软骨破坏和新骨形成为主要特点的退行性疾病。骨关节炎是在力学因素和生物学因素的共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成失衡的一种慢性、进展性关节疾病。它主要侵害关节软骨、骨和滑膜组织，可见局灶性、侵蚀性软骨破坏、软骨下硬化、囊性变和代偿性骨赘形成等，主要累及的关节为手的小关节和负重关节，导致关节疼痛、畸形和功能障碍，从而影响病人的活动能力和生活质量。

骨关节炎是中老年人关节致残的大敌。世界卫生组织统计，50岁以上人群中，骨关节炎的发病率为50％，55岁以上的人群中，发病率为80％。我国骨关节炎的发病情况约占总人口的8.1％。根据who预测，到2015中国骨病患者将达到1.5亿，中国将成为世界骨关节炎患病人数最多的国家之一。

骨关节炎的治疗方法有药物治疗、手术治疗。药物治疗一般以缓解疼痛为主，不能根本上改变关节受损情况。手术治疗在后期骨关节炎治疗中占有重要地位，特别是当病人有持续性疼痛或进行性畸形时，根据不同的病变部位及程度选取不同的手术方式。手术的主要目的是改善下肢生物力线、消除病因、改善局部血液供应、降低病变关节周围骨内压、去除病变软骨、稳定关节，但手术治疗只能减轻关节炎带来的症状，也无法修复受损软骨。最早用于治疗oa的细胞治疗技术是自体软骨细胞移植，其优势在于使用自己细胞降低了免疫原性，成功率高，并获得fda批准等，其劣势在于两次手术增加患者的痛苦，取材及软骨细胞扩增数量有限，细胞增殖能力随年龄增长而下降等。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用，以缓解现有技术中缺少一种可以安全、高效治疗骨关节炎的技术手段。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用，所述人脐带间充质干细胞通过以下培养方法得到：

将脐带组织放置在第一培养基中进行第一阶段的培养，然后在第二阶段、第三阶段和第四阶段依次用第二培养基、第三培养基和第四培养基进行培养；

所述第一阶段、所述第二阶段和所述第三阶段的培养均独立地在细胞融汇度为80％-90％时进入下一阶段的培养；

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基均独立地包括基础培养基、血清和细胞因子；

所述基础培养基包括dmem/f12、dmem或αmem；

所述血清包括fbs或nbcs；

所述细胞因子包括egf和bfgf。

进一步地，所述预防和/或治疗骨关节炎药物中人脐带间充质干细胞的含量为1×10⁶-1×10⁸cells/ml。

进一步地，所述第一培养基包括9-11％血清、15-25μg/legf和15-25μg/lbfgf。

进一步地，所述第二培养基包括7-9％血清、15-25μg/legf和15-25μg/lbfgf。

进一步地，所述第三培养基包括3-5％血清、35-45μg/legf和35-45μg/lbfgf。

进一步地，所述第四培养基包括0.1-3％血清、50-70μg/legf和50-70μg/lbfgf。

进一步地，在第一阶段进入第二阶段、第二阶段进入第三阶段和第三阶段进入第四阶段中细胞传代密度均独立地为1×10³/cm²-1×10⁵/cm²。

进一步地，第一阶段培养时需要每隔1-3天更换新的第一培养基。

进一步地，第一阶段培养结束后细胞经消化处理为单细胞再进入第二阶段培养；

优选地，所述消化的步骤包括：0.15％-0.35％胰酶消化3-7min。

进一步地，培养条件包括：在温度36-38℃，4-6％co2和饱和湿度的条件下进行细胞培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用，其中，人脐带间充质干细胞通过特定的方法分离制备得到，该人脐带间充质干细胞的免疫排斥反应小，异源性污染低，细胞分化能力强，有效改善骨关节炎的症状，减轻关节软骨的破坏情况，使得软骨组织得到修复，见效快，安全有效，可以从根本上治愈骨关节炎。

附图说明

图1为本发明实施例1中大鼠骨关节炎模型建立的流程图；

图2a为本发明实施例3中对比例sd大鼠膝关节大体标本图；

图2b为本发明实施例3中手术后通过mscs治疗sd大鼠膝关节大体标本图；

图3为本发明实施例3中sd大鼠膝关节组织学观察结果图；

图4为本发明实施例3中sd大鼠膝关节切片染色全景扫描结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。

本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。

本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。

本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用，其中，人脐带间充质干细胞通过以下培养方法得到：

将脐带组织放置在第一培养基中进行第一阶段的培养，然后在第二阶段、第三阶段和第四阶段依次用第二培养基、第三培养基和第四培养基进行培养，第一阶段、第二阶段和第三阶段的培养均独立地在细胞融汇度为80％-90％时进入下一阶段的培养；

其中，第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基均独立地包括基础培养基、血清和细胞因子，基础培养基包括dmem/f12、dmem或αmem，血清包括fbs或nbcs，细胞因子包括egf和bfgf。

脐带间充质干细胞是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。与其他来源的msc相比，uc-msc更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，uc-msc不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。uc-msc不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。人脐带间充质干细胞的制备方式不同，细胞成分也就不同，品质也有好坏之分。

本发明中，保证细胞融汇度80％-90％达到人脐带间充质干细胞富集的目的，同时保证细胞的活力。

基础培养基优选为dmem/f12。dmem/f12为dmem与f12以1:1结合得到的培养基，作为无血清配方的基础，具有较丰富、高浓度的营养成分。

fbs为胎牛血清，是一种浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；nbcs为小牛血清，取自出生10-30天的小牛。血清优选为fbs。

bfgf为碱性成纤维细胞生在因子，是细胞形态发生和分化的诱导因子，可诱导多种细胞的增殖和分化。

egf(epidermalgrowthfactor，表皮生长因子)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增殖，增强表皮细胞的活力，延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。

本发明提供的人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用，其中，人脐带间充质干细胞通过特定的方法分离制备得到，该方法中通过四种培养基的连续培养，可以高效地从脐带组织中分离得到免疫排斥反应小，异源性污染低，细胞分化能力强的人脐带间充质干细胞，该人脐带间充质干细胞可以异源有效改善骨关节炎的症状，减轻关节软骨的破坏情况，使得软骨组织得到修复，见效快，安全有效，可以从根本上治愈骨关节炎。

在优选地实施方式中，预防和/或治疗骨关节炎药物中人脐带间充质干细胞的含量为1×10⁶-1×10⁸cells/ml。由于本发明中的人脐带间充质干细胞的品质好，批间差小，质量稳定，所以制备药物时有效含量低，适合大规模生产。预防和/或治疗骨关节炎药物中，单位剂量的人脐带间充质干细胞的含量为1×10⁶-1×10⁸cells。

在优选地实施方式中，第一培养基包括9-11％血清、15-25μg/legf和15-25μg/lbfgf。血清含量典型但非限制性的为9％、10％或11％；egf含量典型但非限制性的为15μg/l、17μg/l、20μg/l、23μg/l或25μg/l；bfgf含量典型但非限制性的为15μg/l、17μg/l、20μg/l、23μg/l或25μg/l。

在优选地实施方式中，第二培养基包括7-9％血清、15-25μg/legf和15-25μg/lbfgf。血清含量典型但非限制性的为7％、8％或9％；egf含量典型但非限制性的为15μg/l、17μg/l、20μg/l、23μg/l或25μg/l；bfgf含量典型但非限制性的为15μg/l、17μg/l、20μg/l、23μg/l或25μg/l。

在优选地实施方式中，第三培养基包括3-5％血清、35-45μg/legf和35-45μg/lbfgf。血清含量典型但非限制性的为3％、4％或5％；egf含量典型但非限制性的为35μg/l、37μg/l、40μg/l、43μg/l或45μg/l；bfgf含量典型但非限制性的为35μg/l、37μg/l、40μg/l、43μg/l或45μg/l。

在优选地实施方式中，第四培养基包括0.1-3％血清、50-70μg/legf和50-70μg/lbfgf。血清含量典型但非限制性的为0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％；egf含量典型但非限制性的为50μg/l、55μg/l、60μg/l、65μg/l或70μg/l；bfgf含量典型但非限制性的为50μg/l、55μg/l、60μg/l、65μg/l或70μg/l。

通过四种培养基的连续培养，逐级降低血清的使用量，达到人脐带间充质干细胞简单高效培养的目的，得到的人脐带间充质干细胞免疫排斥反应小，异源污染小，细胞纯度高同时干性好。

在优选地实施方式中，在第一阶段进入第二阶段、第二阶段进入第三阶段和第三阶段进入第四阶段中细胞传代密度均独立地为1×10³/cm²-1×10⁵/cm²。以1×10³/cm²-1×10⁵/cm²的细胞传代密度进行传代，既保证了细胞的活性，又保证了细胞在短时间内的传代次数。

在优选地实施方式中，第一阶段培养时需要每隔1-3天更换新的第一培养基。通过培养基的更换，去除杂细胞和杂质，同时提供人脐带间充质干细胞增殖与生长足够的营养。

本发明中更换培养基时，采用离心的方式分离人脐带间充质干细胞和用过的培养基，条件优选为1200rpm离心5min，再用pbs缓冲液清洗人脐带间充质干细胞后，再加入新的培养基进行培养。

在优选地实施方式中，第一阶段培养结束后细胞经消化处理为单细胞再进入第二阶段培养。

在优选地实施方式中，消化的步骤包括：0.15％-0.35％胰酶消化3-7min。

在优选地实施方式中，培养条件包括：在温度36-38℃，4-6％co2和饱和湿度的条件下进行细胞培养。

在优选地实施方式中，用于制备预防和/或治疗骨关节炎药物的人脐带间充质干细胞通过以下方法得到：

1、脐带分离

1)取5cm长的健康捐赠脐带，用生理盐水冲洗，去掉血管组织。剪碎为1mm3的组织碎块；

2)组织碎块接种于150mm的培养皿，缓慢加入第一培养基至没过组织块，并于37℃，5％co2和饱和湿度的培养箱中培养；

3)每隔2天换一次第一培养基，直至从组织碎块爬出的贴壁细胞融汇度达到85％后传代(该细胞代次为p0代)；

2、脐带间充质干细胞传代培养(逐级驯化)

1)原代细胞(p0代)用0.25％的胰酶消化5min成单细胞，用第二培养基终止胰酶反应；

2)1200rpm离心5min，弃上清；

3)然后pbs清洗一遍间充质干细胞沉淀；

4)按1×10⁴/cm²的细胞密度传代培养，培养基为第一培养基，该细胞代次为p1代；

5)p1代细胞融汇度达到85％后继续传代，培养基为第二培养基，该细胞为p2代。p2代细胞冻存为种子库细胞；

6)继续传代培养操作，p3和p4代细胞用第三培养基培养，p4代细胞冻存为中间库细胞；

7)p5和p6代细胞用第四培养基培养，p5和p6代细胞冻存为工作库细胞。

其中，第一培养基：dmem/f12、10％fbs、20ug/legf和20ug/lbfgf。

第二培养基：dmem/f12、8％fbs、20ug/legf和20ug/lbfgf。

第三培养基：dmem/f12、4％fbs、40ug/legf和40ug/lbfgf。

第四培养基：dmem/f12、1％fbs、60ug/legf和60ug/lbfgf。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1骨关节炎模型建立

经过适应性培养的8周龄近交系spraguedawley(sd)雄性大鼠6只大鼠，使用阿佛丁注射液经腹腔注射进行麻醉，麻醉剂量为2.5g/mg，麻醉前禁食禁水12h。麻醉后，于双侧膝关节沿髌韧带内侧缘切口，打开关节腔后，切断前交叉韧带，保留后交叉韧带，术闭缝合伤口，不固定伤肢，自由活动，术后抗感染止痛。大鼠骨关节炎模型建立的流程图如图1所示。

实施例2人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎方法

细胞注射：实施例1中的骨关节炎大鼠模型建立4周后，阿佛丁注射液经腹腔注射进行麻醉，左侧膝关节腔内注射本发明中的培养方法得到的人脐带间充质干细胞注射液100μl(1×10⁷cells/ml，pbs)。同时以没有经过人脐带间充质干细胞治疗的大鼠作为实验对照组。

大鼠膝关节取材：注射人脐带间充质干细胞注射液4周后，通过co2窒息的方式处死sd大鼠并收集双侧膝关节标本。

膝关节脱钙处理：将浸泡在4％多聚甲醛溶液中的组织取出，置于10％edta磷酸盐缓冲液(pbs)中，进行脱钙处理，每隔3-4天更换一次脱钙液。

骨关节检测：脱钙后膝关节进行制备石蜡切片，进行检测。

实施例3人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎检测

sd大鼠膝关节大体标本如图2a-图2b所示，从图中可以看出，图2a中对比例(即手术侧，operation)和图2b中手术后通过mscs治疗(mscs侧，operation-mscs)的膝关节都有不同程度的损伤，但是对比例的损伤情况相较于mscs侧的损伤情况更加严重。

组织学观察结果如图3所示，其中，a为对比例he染色结果；b为mscs治疗例he染色结果；c为对比例甲苯胺蓝法(toluidineblue)染色结果；d为mscs治疗例甲苯胺蓝法(toluidineblue)染色结果；e为对比例masson检测结果；f为mscs治疗例masson检测结果。

膝关节切片染色全景扫描结果如图4所示，其中，a为对比例he染色结果；b为mscs治疗例he染色结果；c为对比例甲苯胺蓝法(toluidineblue)染色结果；d为mscs治疗例甲苯胺蓝法(toluidineblue)染色结果。

he和甲苯胺蓝染色可见对比例的软骨细胞排列紊乱，细胞簇集明显，有细胞消失，基质染色不均，软骨结构改变，表面凹凸不平，软骨层次较差等现象，表明软骨处于蜕变，骨关节炎形成；与对比例相比，手术后通过mscs治疗(mscs侧)的软骨细胞排列基本整齐，呈柱状，细胞增生较多，细胞簇集明显减少，潮线较完整。软骨表面相对平滑，表明软骨处于损伤修复中。mscs侧从组织学观察均优于对比例。masson染色观察结果显示，单一手术侧有明显炎性细胞浸润，软骨表面不平整，纤维化增加等现象，而mscs侧病变程度较轻。

上述结果可以看出本发明的人脐带间充质干细胞对改善关节炎，减轻关节软骨破坏和修复软骨组织具有显著的效果，作为预防和/或治疗骨关节炎的药物具有显著的效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。