一种过表达Nurr1的细胞混合液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种过表达nurr1的细胞混合液及其制备方法和应用。

背景技术：

神经干细胞(neuralstemcell，nsc)是指存在于神经系统中，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞移植是将神经干细胞移植到宿主体内，使神经干细胞向神经系统病变部位趋行、聚集，并存活、增殖、分化为神经元和/或胶质细胞，从而促进宿主缺失功能的部分恢复的一种技术。近年来，神经干细胞研究成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的热点。神经干细胞移植在临床应用中有广阔的前景，对它的研究一直是近年来的热点。

小胶质细胞(microglia)是神经组织中唯一来源于中胚层的细胞。此细胞在中枢神经系统内分布较少。在灰质内多位于神经元胞体附近或在小血管周围，在白质内也可见到。功能相当于巨噬细胞。

nurr1是nur相关因子，属于孤儿核受体的超家族。人类的nurr1位于2号染色体上，有8个外显子，在中枢神经系统内有广泛的表达，与中脑多巴胺能神经元的发生、发育和存活有密切关系。

帕金森病(parkinsondisease，pd)是中老年常见的中枢性神经系统退行性疾病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势步态异常等一系列神经系统症状。如今，pd已成为危害中、老年人健康的第2位神经系统变性性疾病。65岁以上的老人中pd患病率达1％。随着人口的老龄化，pd的发病率必将进一步上升。因此积极寻找有效的预防和治疗措施一直是研究的热点。

目前，pd的治疗方法主要有传统的药物治疗和外科治疗。药物治疗包括多巴胺替代治疗、抗胆碱能制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚-氧位-甲基转移酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂等，这些药物只能减轻症状但不能阻止病情发展，而且长期应用不但会引起疗效下降，还会出现各种并发症如开-关现象、剂末现象及运动障碍等。外科治疗以苍白球和丘脑的毁损为主要方法，由于手术创伤大，使用对象局限，并非一种理想的治疗手段。

pd的细胞移植治疗始于20世纪中期，人们先后将不同种类的细胞作为供体细胞，经过许多的实验研究发现，将多巴胺神经元向纹状体移植治疗pd的大鼠模型能缓解pd相关症状。细胞移植在pd治疗的研究中已经取得了较多的进展，其应用于临床将有光辉的前景。但是，现有的研究仍然面临很多问题，如优化移植方案，抑制细胞数量以及是否需要免疫抑制剂，移植神经干细胞后其存活、定植等出现困难等。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种过表达nurr1的细胞混合液及其制备方法和应用，所述细胞混合液是将过表达nurr1基因的nscs和过表达nurr1基因的小胶质细胞按一定比例混合而得，所得细胞混合液可以用于治疗帕金森病。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种过表达nurr1的细胞混合液，其中包括过表达nurr1基因的nscs和过表达nurr1基因的小胶质细胞。

进一步，上述过表达nurr1的细胞混合液中，所述过表达nurr1基因的nscs和过表达nurr1基因的小胶质细胞的数量比是4～3:2～1。

优选的，上述过表达nurr1的细胞混合液中，所述过表达nurr1基因的nscs和过表达nurr1基因的小胶质细胞的数量比是2：1。

进一步，上述过表达nurr1的细胞混合液，液体成分是无菌的生理盐水。

进一步，上述的过表达nurr1的细胞混合液中，其中的细胞浓度为4.5×10⁷～4.5×10⁹个/ml。

优选的，上述的过表达nurr1的细胞混合液中，其中的细胞浓度是9×10⁷个/ml。

本发明还提供上述过表达nurr1的细胞混合液的制备方法，包括以下步骤：

①原代小胶质细胞的分离与鉴定；

②原代nscs的分离与鉴定；

③过表达nurr1基因的nscs和小胶质细胞的分别构建；

④细胞混合液的制备。

上述过表达nurr1的细胞混合液在制备防治帕金森病药品中的应用。

有益效果：

本发明通过实验证明：过表达nurr1基因的nscs表达分泌的nurr1可以提高多巴胺相关因子th和dat的表达量，从而促进nscs分化成多巴胺能神经元，可用于神经修复；过表达nurr1基因的小胶质细胞表达分泌的nurr1可以提高神经营养因子bdnf和gdnf的表达量，从而促进小胶质周围nscs的生长，可用于神经修复；小胶质细胞中高表达的nurr1使促炎细胞因子的表达量显著降低，缓解炎症反应，可以为nscs提供良好的生长环境。

本发明提供的过表达nurr1的细胞混合液移植入pd大鼠模型的纹状体中，并与其它单细胞或非过表达细胞混合液移植组进行比较，结果发现，本发明所提供的过表达nurr1的细胞混合液在pd大鼠纹状体中能提高da相关因子的表达量，从而促进神经干细胞向多巴胺神经元细胞分化；长期移植实验发现，所移植的过表达nurr1基因的nscs和小胶质细胞在pd大鼠纹状体中可以长期稳定存在，解决了现有的细胞移植疗法nscs移植后死亡率高等问题。

本发明所提供的过表达nurr1的细胞混合液可应用于治疗pd，并能解决现有的细胞移植技术所存在的许多问题，具有应用前景。

附图说明

各图中，“*”“△”“#”“≠”标记的是nnsc+nmg组分别与其他组相比的差异性。

图1是小胶质细胞免疫荧光染色cd11b/c阳性结果图；

图2是nscs免疫荧光染色细胞鉴定阳性结果：图2a：nestin阳性；图2b：gfap阳性；图2c：tuj1；

图3是nscs和小胶质细胞过表达nurr1的结果：图3a：nscs慢病毒转染阳性结果；图3b：westernblot检测nscs中过表达的nurr1；图3c：小胶质细胞慢病毒转染阳性结果；图3d：westernblot检测小胶质细胞中过表达的nurr1；与对照组相比，*p<0.01，***p<0.001。

图4是过表达nurr1对nscs和小胶质细胞分泌物的影响结果：图4a-d：westernblot和rt-pcr检测过表达nurr1的nscsth和dat表达量；图e、f：elisa检测过表达nurr1的小胶质细胞神经营养因子和促炎因子表达量；与对照组相比，*p<0.01，**p<0.01；***p<0.001。

图5是细胞移植后的pd大鼠旋转频率变化统计结果：

图中，“*△#≠”标记的是nnsc+nmg组与其他组相比的差异性，各自表示的意思是：*，与假手术组相比，p<0.01；△，与nnsc+mg组相比，p<0.05；#，与nsc组相比，p<0.05；≠，与nnsc组相比，p<0.05。

图6是pd大鼠纹状体中nurr1、th、dat、pitx3的表达量：图6a、b：rt-pcr法检测nurr1、th、dat、pitx3的mrna表达量；图6c、d：westernblot检测nurr1、th、dat、pitx3蛋白量；*，与假手术组相比，p<0.05；△，与nsc组相比，p<0.05；#，与nnsc组相比，p<0.05；≠，与nnsc+mg组相比，p<0.05。

图7是细胞移植12周后在体荧光免疫th阳性细胞数量统计结果：△，与nscs组相比，p<0.05；#，与nnsc组相比，p<0.05；≠，与nnsc+mg组相比，p<0.05。

图8是细胞移植12周后在体荧光免疫iba1阳性细胞数量统计结果：△，与nsc组相比，p<0.05；#，与nnsc组相比，p<0.05；≠，与nnsc+mg组相比，p<0.05。

图9是移植nnscs+nmg手术后5个月的免疫荧光实验结果：蓝色荧光表示th阳性细胞，绿色(gfp)和红色(rfp)荧光表示慢病毒。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

关于实施例相关检测蛋白介绍：

pitx3：pituitaryhomeobox3，脑垂体同源框3，由pitx3基因转录的蛋白。pitx3特异表达于大脑da神经元，对于脑多巴胺能神经元的分化与成熟起着关键性作用，被认为是中脑多巴胺能神经元特异性发育所必需的转录因子。

th：tyrosinehydroxylase，酪氨酸羟化酶，是负责催化氨基酸l-酪氨酸转变为二羟基苯丙氨酸(多巴)的酶。多巴是多巴胺的一个前体，故th促进多巴胺生成。

dat：dopaminetransporter，多巴胺转运体，位于中枢多巴胺能神经元末梢，是一种膜蛋白，其生理作用为将突触间隙内已发挥生理效应的多巴胺(da)重新摄入突触前膜，以备再次利用，同时终止神经细胞间的信息传递，现有研究表明，早期帕金森病病人的dat水平明显降低。

bdnf：brainderivedneurotrophicfactor，脑源性神经营养因子，是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用。脑源性神经营养因子能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。

gdnf，glialcellline-derivedneurotrophicfactor，胶质细胞源性神经营养因子，于1993年由lin等从大鼠神经胶质细胞系b49的培养液中首先纯化并命名。目前已在多种神经细胞和神经相关细胞的培养中发现gdnf表达，具有靶源性神经营养因子的作用。

iba1：在巨噬细胞/小胶质细胞中特异性表达，并且在这些细胞活化期间上调，iba1是m-csf诱导的膜起皱所必需的巨噬细胞/小胶质细胞特异性肌动蛋白交联蛋白。

实施例一：一种过表达nurr1的细胞混合液的制备

1原代小胶质细胞的体外培养及鉴定

取新生24-48小时的sd乳鼠大脑皮层用于小胶质细胞体外培养，使用含10％胎牛血清的dmem/f12完全培养基培养混合原代胶质细胞10d，细胞呈现分层生长，纯化后细胞处于静息状态，呈梭形、分支状等形态。pbs处理3h后形态较静息状态无明显变化；lps(10μg/ml，sigma)处理3h，细胞突起缩短或消失，胞体变大、变圆，可见伪足，似阿米巴状，呈活化状态。小胶质细胞纯化后经细胞免疫荧光染色，显示cd11b/c阳性，阳性结果如图1所示。

2原代神经干细胞的体外培养及鉴定

取孕12.5-14.5d的sd胎鼠中脑腹侧组织用于原代神经干细胞培养，培养液组成：无血清的dmem/f12、100u/ml青链霉素、2％b27(gibco，usa)、20ng/mlbfgf(peprotech，usa)、20ng/ml表皮生长因子(peprotech，usa)。培养环境：37℃，5％co2。培养5-7d后可形成直径150-200μm大小的神经球，经细胞免疫荧光染色，显示巢蛋白(nestin)阳性，如图2a所示。将培养至第7d的神经球进一步分化培养，在分化培养培养基作用下，神经球逐渐分化，球体周围生长出突起，分化培养至7d后大部分神经球分化，经细胞免疫荧光染色，显示胶质纤维酸性蛋白(gfap)阳性结果，如图2b、微管蛋白(tuj1)阳性结果，如图2c。

3nscs及小胶质细胞过表达nurr1细胞模型的构建

将过表达cdna插入到pcdh(inbavio公司，中国上海)中的多克隆位点中，在cmv启动子调控下表达nurr1。pcdh-copgfp-nurr1和pcdh-coprfp-nurr1慢病毒载体购自inbavio。该空骨架载体(pcdh-copgfp和pcdh-coprfp)用作阴性对照。将慢病毒载体转染到hek293细胞(invitrogen，usa)中，培养72小时后收获含有病毒颗粒的上清液。将病毒滴度调节至3.1×10⁹个颗粒/ml。携带gfp的重组慢病毒载体(pcdh-copgfp-nurr1)和rfp(pcdh-coprfp-nurr1)分别转染nscs和小胶质细胞，转染72小时检测转染结果。对过表达nurr1基因的nscs和小胶质细胞进行荧光标记和westernblot检测，结果如图3所示。

检测到绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白转染pcdh后72小时的神经球和小神经胶质细胞分别为pcdh-gfp-nurr1和pcdh-rfp-nurr1(图3a和3c)。蛋白印迹分析确定nurr1在nscs和小胶质细胞中稳定表达。结果表明，nurr1转染组和空白载体对照组相比，nurr1的蛋白质表达量上升，二者具有显著性差异，p＜0.05(图3b和3d)。

4细胞混合液的制备

将步骤3所得的过表达nurr1的nscs和小胶质细胞离心后重悬、于无菌生理盐水中，细胞数量比：nscs：小胶质细胞＝2：1，细胞混合后总细胞浓度为9×10⁷个/ml。

实施例一展示了nscs和小胶质细胞的分离及鉴定过程、过表达nurr1细胞系的建立过程和细胞混合液制备过程，同时提供阳性结果参照。操作简单，实验人员容易实施。

实施例二：源于nscs和小胶质细胞的nurr1在多巴胺神经元分化中的作用

nurr1已经被证明在多巴胺神经元分化中起到关键作用，将过表达的nurr1的nscs和小胶质细胞混合后进行移植治疗，有利于改善神经元细胞移入体内后的身存环境，降低死亡率。

实验步骤如下：

1将神经球(神经干细胞产生)随机分成两组进一步检查nurr1过表达对nscs的影响：空载体组(用空载体转染)和nurr1组(转染pcdh-gfp-nurr1的)。

2将这些细胞培养在1％fbs培养基中，培养基中无bfgf。分化培养7天后，用westernblot和rt-pcr技术检测th和dat的表达。结果如图4a-d所示，nurr1的过表达可以引起th和dat表达量的显著提高，p<0.01。

3为了研究nurr1在小胶质细胞激活中的作用，小胶质细胞分为以下四组：

对照组，用pbs进行处理；

lps组，用lps(100ng/ml)处理；

nurr1组，转染nurr1后48小时用pbs处理；

lps-nurr1组，转染nurr1后48小时用lps(100ng/ml)处理。

4收集培养基，并在处理24小时后elisa法检测相关因子变化。具有显著高表达nurr1的小胶质细胞的神经营养因子bdnf和gdnf的表达升高(图4e)。相反，小胶质细胞中高表达的nurr1导致促炎细胞因子的表达量显著降低，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和(白细胞介素-1β(il-1β)(图4f)。

实施例二通过比较过表达和非过表达nurr1的nscs的多巴胺相关因子th和dat的表达量比较，表明过表达nurr1基因的nscs表达分泌的nurr1可以提高多巴胺相关因子th和dat，从而促进nscs分化成多巴胺能神经元，可用于神经修复；通过比较过表达和非过表达nurr1的小胶质细胞的神经营养因子bdnf和gdnf的表达量比较，表明过表达nurr1基因的小胶质细胞表达分泌的nurr1可以提高神经营养因子bdnf和gdnf的表达量，从而促进小胶质周围nscs的生长，可用于神经修复；通过比较过表达和非过表达nurr1的小胶质细胞在炎症条件下促炎细胞因子的表达量，表明小胶质细胞中高表达的nurr1使促炎细胞因子的表达量显著降低，缓解炎症反应，可以为nscs提供良好的生长环境。

实施例二的实验研究结果为过表达nurr1的nscs和小胶质细胞细胞混合液在治疗帕金森等神经系统退行性疾病中的应用提供了细胞水平的实验依据。

实施例三：过表达nurr1的细胞混合液在大鼠pd模型中的应用

1pd大鼠模型的建立

通过黑质-纹状体通路定位注射6-ohda建立大鼠pd模型，参照paxinos教授主编的《大鼠脑立体定向图谱》确定注射位置：第一点：前囟前0.7mm，中线右3.0mm，硬膜下4.5mm；第二点：前囟后0.2mm，中线右2.6mm，硬膜下6.0mm。调整针尖位置，利用牙科钻进行颅骨钻孔，用10μl微量注射器向右侧脑内两个预定靶点分别注入6-ohda，每点4μl。术后腹腔注射青霉素抗感染，连续一周。术后2周后，腹腔注射apo(阿扑吗啡)诱发旋转行为。注射10min后，手动计数sd大鼠旋转圈数，共记录30min。平均转速≥7转/min者定义为pd阳性，连续3周阳性的模型大鼠认为造模成功。

2pd大鼠细胞混合液移植

将上述定义为pd阳性的大鼠随机分成5组，每组细胞悬浮于无菌pbs中，且总细胞浓度一定：

(1)假手术组(n＝6)；

(2)nscs移植组(n＝6)；

(3)过表达nurr1的nscs移植组(nnsc组；n＝6)；

(4)过表达nurr1的nscs和未转染的小胶质细胞的细胞混合液移植组(nnsc+mg组；n＝6)；

(5)过表达nurr1的nscs和小胶质细胞的细胞混合液移植组(实施例一制得，nnsc+nmg组；n＝6)。

pd模型大鼠腹腔注射麻醉戊巴比妥钠(50mg/kg)并固定在立体定位框架中。使用22号针头，将5μl细胞混合液或单细胞悬液(约4.5×10⁵)注射到双侧纹状体中(a/p＝+0.5mm；l＝+3.0mm；v＝-5.0mm)。每次注射后将针留在原位5分钟。假手术大鼠注射等体积的无菌生理盐水。缝合切口，肌肉注射100ku青霉素以预防感染。在移植后3周，6周，9周和12周进行行为测试：以0.25mg/kg的剂量皮下注射阿扑吗啡(sigma)，监测30分钟内大鼠的旋转次数。

3westernblot和rt-pcr检测移植后纹状体内da(多巴胺)相关因子的变化

移植12w后分别提取各组pd大鼠纹状体组织，分别用于westernblot及rt-pcr检测各组间nurr1、dat、pitx3及th表达的变化。

手术12周后，用ripa裂解液提取大鼠纹状体组织总蛋白。westernblot所用抗体分别为：兔nurr1抗体(1：200；abcam)，多克隆兔th抗体(1：200；abcam)，多克隆兔pitx3抗体(1：200；abcam)，多克隆兔dat抗体(1：200；abcam)，单克隆小鼠β-actin抗体(1：2000；santa)。

使用trizol-通用试剂(tiangenbiotech，中国北京)从组织中提取总rna(每组n＝4)，并合成互补dna(cdna)。nurr1，th，pitx3，dat和内参gapdh的扩增引物如下：

nurr1基因的引物序列：

f：5′-aagccaccttgcttgtaccaaa-3′，

r：5′-cttgtagtaaaccgacccgctg-3′；

th基因的引物序列：

f：5′-cagggctgctgtcttcctac-3′，

r：5′-gggctgtccagtacgtcaat-3′；

dat基因的引物序列：

f：5′-ttgcagctggcacatctatc-3′，

r：5′-atgctgaccacgaccacata-3′；

pitx3基因的引物序列：

f：5′-cttagtccctgccagtacgc-3′，

r：5′-gtgagccaagggtgaattg-3′。

rt-pcr反应条件如下：94℃，3分钟，35个循环；94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，1分钟；最后延伸72℃，10分钟。

4免疫荧光检测移植后纹状体内th和iba1的变化

细胞移植术后12周，提取nnsc+nmg联合移植组pd大鼠脑组织，制作成冰冻切片后荧光显微镜下观察，移植进去的小胶质细胞携带rfp红色荧光，而移植进去的nscs则携带gfp绿色荧光。将各组移植术后12周的大鼠提取脑组织作冰冻切片，通过免疫荧光观察各组pd大鼠纹状体内th阳性细胞和iba1阳性细胞的数量。另外，将单独3只nnsc+nmg细胞混合液移植组pd大鼠饲养至术后5个月后取大脑作冰冻切片，分别观察th阳性细胞和iba1阳性细胞的数量。

5实验结果

(1)pd大鼠模型行为观察

根据对细胞移植后的pd大鼠的行为观察结果，nurr1过表达的nscs和小胶质细胞混合液明显改善了pd大鼠的旋转行为。图5显示了移植后3周，6周，9周和12周各组pd大鼠对apo(阿扑吗啡)引发的旋转行为结果，四个移植含细胞的细胞液的实验组的pd大鼠都发生了旋转行为，但假手术组并没有发生旋转行为。nscs组在第六周旋转圈数达到一个平台期，后期有所上升；nnscs+nmg组随时间旋转圈数减少，各测量时间的旋转圈数与其他组相比都具有显著性差异。当移植12周时，nnscs+nmg组与假手术组相比，p<0.01；与nnsc+mg组、nsc组、nnsc组相比，p值均小于0.05。

(2)对da相关因子表达的检测

用荧光显微镜观察nnsc+nmg组pd大鼠的脑切片组织，具有红色和绿色荧光标记的pd大鼠为转染成功并且移植成功的大鼠模型。

将实验的pd大鼠处死，使用rt-pcr和westernblot分析测量nurr1，th，dat和pitx3的mrna和蛋白质表达水平，westernblot检测结果如图6c和6d所示，rt-pcr结果如图6a和6b所示。由检测结果可知，nnscs+nmg组的th，dat和pitx3的表达量多于假手术组及其他移植组，并且具有显著性差异，p值均小于0.05。

免疫荧光染色显示移植后12周，th阳性细胞数在nnscs+nmg组中pd大鼠的移植脑中与其他组相比显着增加，图8为th阳性细胞数统计结果；相反地，iba1阳性细胞数降低，表明nnscs+nmg组的小胶质细胞数量在移植后减少。

移植nnscs+nmg手术后5个月进行免疫荧光实验，以进一步研究长期细胞移植的效果。如图9所示，来自慢病毒的gfp和rfp在荧光显微镜下仍可被观察到；纹状体切片中可见th阳性细胞。结果表明nurr1基因过表达的小神经胶质细胞与nurr1基因过表达的神经干细胞的共同移植确保了体外移植的神经干细胞在pd大鼠大脑恶劣的纹状体环境中稳定存在并发挥作用。

实施例三通过将本发明的提供的过表达nurr1的细胞混合液移植入pd大鼠模型的纹状体中，并与其它单细胞或非过表达细胞混合液移植组进行比较，结果发现，本发明所提供的过表达nurr1的细胞混合液在pd大鼠纹状体中能提高da相关因子的表达量，从而促进神经干细胞向多巴胺神经元细胞分化；长期移植实验发现，所移植的过表达nurr1基因的nscs和小胶质细胞在pd大鼠纹状体中可以长期稳定存在，解决了现有的细胞移植疗法nscs移植后死亡率高等问题。

实施例三通过动物实验证明，本发明所提供的过表达nurr1的细胞混合液可应用于治疗pd，并能解决现有的细胞移植技术所存在的许多问题，具有应用前景。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。