竹节参总皂苷在制备治疗或改善结肠炎症的药物上的应用的制作方法

本发明涉及竹节参总皂苷的制药用途，具体涉及竹节参总皂苷在制备治疗或改善结肠炎症的药物上的应用。

背景技术：

近年来人口老龄化问题越来越严重，老年人口占总人口的比例也逐渐增加，因此老年人的健康问题变得越来越重要。肠道既是机体消化吸收的主要器官，也是机体抵御有害物质如细菌内毒素、病毒等一道重要屏障。肠道炎症反应可引起肠道粘膜屏障功能受损，肠道内细菌发生移位进入机体多个系统(肝、心、脑等组织)，导致机体处于慢性炎症反应状态，并进一步引发或加重其他系统相关疾病，加速机体的衰老进程。

肠道屏障能够阻挡有害物质进入机体，从而引起炎症等多种反应。肠道机械屏障的一个重要部分是肠道上皮细胞间的紧密连接，它能调节肠道上皮的通透性。肠碱性磷酸酶(intestinalalkalinephosphatase，iap)是一种单酯磷酸水解酶，主要在肠上皮细胞广泛表达。研究发现，iap可使lps去磷酸化，进而抑制lps介导的肠道炎症。神经氨酸苷酶3(neuraminidase3，neu3)是一种哺乳动物唾液酸酶，主要在肠上皮细胞表达，可使iap去唾液酸化，从而活性减弱。近期有研究表明，肠道反复间断低剂量的细菌感染可导致肠上皮细胞的neu3活性增强，并伴随iap活性减弱进而导致肠道炎症反应加剧。近期研究显示，实验性结肠炎模型中，减轻炎症因子tnf-α、il-1β的表达，可以增加肠上皮紧密连接蛋白zo-1、occludin蛋白的表达，改善肠上皮屏障功能。我们前期研究发现衰老大鼠结肠炎症反应增加，肠屏障功能减弱。但是衰老大鼠结肠炎症反应是否与neu3/iap通路相关有待研究。

技术实现要素：

本发明涉及竹节参总皂苷通过neu3/iap通路调节衰老大鼠结肠炎症反应，改善肠屏障功能。研究衰老肠道中neu3/iap通路的抗炎作用的制药用途。

针对上述新用途，竹节参总皂苷在降低结肠炎症蛋白tnf-α、nlrp3的表达的药物上的应用。

针对上述新用途，竹节参总皂苷在增高结肠紧密连接蛋白zo-1、claudin-5的表达的药物上的应用。

针对上述新用途，竹节参总皂苷在增高十二指肠和结肠组织iap表达的药物上的应用。

附图说明

图1为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠长度和组织中mpo水平的影响。其中，(1)为结肠长度照片，(2)为结肠长度数据图，(3)组织中mpo活力效果数据图。其中，a.青年组，b.自然衰老组，c.spj低剂量组，d.spj高剂量组，青年组比较，^**p＜0.01；与自然衰老组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

图2为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠tnf-α、nlrp3表达的影响图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组。

图3为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠tnf-α、nlrp3表达的影响数据图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组，注：与青年组比较，^**p＜0.01；与自然衰老组比较，^##p＜0.01。

图4为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠紧密连接蛋白zo-1、claudin-5表达的影响图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组。

图5为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠紧密连接蛋白zo-1、claudin-5表达的影响数据图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组，注：与青年组比较，^**p＜0.01；与自然衰老组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

图6为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠十二指肠和结肠组织中iap、结肠组织中neu3表达的影响图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组。

图7为竹节参总皂苷对自然衰老大鼠十二指肠和结肠组织中iap、结肠组织中neu3表达的影响数据图，其中，a.青年组b.自然衰老组c.spj低剂量组d.spj高剂量组，注：与青年组比较，^**p＜0.01；与自然衰老组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01。

具体实施方式

实施例1

本发明所用的实验动物如下：

spf级sd雄性大鼠，购自三峡大学医学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：scxk(鄂)2011-0061。

本发明所用的药物与试剂如下：

竹节参采购于湖北省恩施州椿木营竹节参种植基地，三峡大学生物与制药学院邹坤教授鉴定其为五加科植物竹节参panaxjaponi-cusc.a.mey的干燥根茎。取竹节参根茎，制备竹节参根茎粗粉，将60％乙醇加入后加热回流，然后合并滤液，浓缩干燥后得到竹节参干燥总提物，采用比色法鉴定，以人参皂苷re为对照品，测量结果显示竹节参总皂苷的含量为67.66％。mpo试剂盒(a044)，南京建成生物工程有限公司；rna逆转录试剂盒，日本takara公司；β-actin、iap、neu3引物，生工生物工程有限公司提供(表1)；一抗zo-1、claudin-5苏州睿瀛生物有限公司；nlrp3、tnf-α，santacruz公司。

表1pcr引物序列

主要仪器

cx41光学倒置显微镜，日本olympus公司；eg1150h石蜡包埋机；tp1020脱水机；ultracutr超薄切片机；veriti^tm96-wellthermalcycler梯度pcr仪，德国appliedbiosysterms公司；1-15k离心机，德国sigma公司。

动物分组及给药

雄性sd大鼠分为青年组(6月龄)、自然衰老组(24月龄)和竹节参总皂苷低、高剂量组。取12只6月龄大鼠作为青年组。另取36只18月龄大鼠，将其分为自然衰老组、竹节参总皂苷低、高剂量组，每组12只，spj低、高剂量组分别通过饲料连续给药10mg/kg、30mg/kg竹节参总皂苷6个月，自然衰老组给予正常饲料至24月龄，每天给药一次。给药结束后，称量并记录大鼠体重，10％乌拉坦麻醉，将大鼠固定在鼠板上，剪开腹部取血后，分离大肠和小肠组织，测量结肠长度。取新鲜结肠组织约2cm，放入包埋盒后立即并投入4％多聚甲醛，生理盐水清理剩下结肠组织粪便后，放至-80℃冰箱保存。

结肠组织中mpo活力检测

电子天平称量新鲜结肠组织(约50mg)于1.5mlep管中，加入适量冰的生理盐水，在冰上进行电动匀浆，静置10min后，4℃，4000r/min离心10min，分装上清备用。后续步骤按mpo试剂盒说明书进行。

免疫组织化学染色

组织脱水包埋后，用切片机进行石蜡切片，每张切片厚4μm，切完冷水、热水摊片后，放于烘箱中60℃烤4h。经过常规脱蜡后，蒸馏水浸泡3min，配制柠檬酸盐修复液，高压修复6min，修复完后切片自然冷却至室温。pbs冲洗3次/5min，甩干后滴加3％h2o2于37℃孵育10min，pbs冲洗3次/5min，甩干玻片后，每个组织滴加1滴5％bsa室温封闭1h，pbs冲洗并甩干水分，加一抗放于湿盒中4℃孵育过夜，pbs冲洗干净，每个组织滴加1滴二抗室温孵育1h，pbs冲洗，1ml蒸馏水配制dab显色液，显色完成后立即用流水冲洗，甩干水分后滴加苏木素40s，氨水冲洗反蓝，盐酸酒精分化1s，流水冲洗5min，风干水分树脂封片。

碱性磷酸酶染色

按照说明书进行脱蜡，蒸馏水冲洗30s，试剂二/试剂三按20/1的比例配制适量基质液，甩干玻片上的水，立即滴加基质液，37℃避光孵育15min，不要水洗，甩掉多余的液体，滴加试剂四染色10min，蒸馏水洗30s后，甩干水分滴加试剂五5min，蒸馏水洗30s后，试剂六复染5s，蒸馏水洗后风干，中性树脂封片。显微镜下取图，用image-proplus7.0软件分析，计算其阳性率。

rt-pcr

电子天平称取约50mg新鲜结肠组织，提取组织中的总rna，得到的rna用depc水溶解，核酸测定仪测定其浓度及d(λ)260/d(λ)280比值，得到的结果重复测定1次，两次结果均在1.8～2.2范围内，并且两次测得浓度相差不得超过20ug/ml。按照逆转录试剂盒步骤逆转录，并进行扩增，扩增反应体系总体积为25μl：10.5μldepc水，12.5μlpcrmastermix，β-actin、iap、neu3引物上下游各0.5μl，以1μlcdna模板。扩增条件为94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，goto2，30times，72℃5min，4℃，以β-actin作为内参。配制2％琼脂糖凝胶，将扩增得到的产物加入到配制好的凝胶孔中，电泳30min，应用凝胶成像仪拍照，并imagej软件计算iap、neu3与β-actin光密度的比值。

统计学处理

用graphpadprism5软件对实验结果进行统计学分析，数据以表示，各组之间采用单因素方差分析(one-wayanova)，以p<0.05为差异有统计学意义。

竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠长度和结肠组织中mpo水平的影响

结果如图1所示，与青年组比较，自然衰老组结肠长度显著增加(p<0.01)，组织中mpo活力显著降低(p<0.01)。与自然衰老组相比，spj不同剂量组结肠长度显著减短(p<0.05)，组织中mpo活力显著增高(p<0.01)。

竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠炎症相关蛋白tnf-α、nlrp3的影响

结果如图2、3所示，与青年组相比，自然衰老组大鼠结肠组织tnf-α、nlrp3表达显著增高(p<0.01)，与自然衰老组相比，spj不同剂量组tnf-α、nlrp3表达显著降低(p<0.01)。

竹节参总皂苷对自然衰老大鼠结肠紧密连接蛋白zo-1、claudin-5影响

结果如图4、5所示，与青年组相比，自然衰老组大鼠结肠组织紧密连接蛋白zo-1、claudin-5表达显著降低(p<0.01)，与自然衰老相比，spj不同剂量组紧密连接蛋白zo-1、claudin-5表达显著增高(p<0.01或p<0.05)。

竹节参总皂苷对自然衰老大鼠肠道iap的影响

结果如图6、7所示，与青年组相比，自然衰老组大鼠十二指肠和结肠组织中iap表达显著降低(p<0.01)，neu3表达显著增加，与自然衰老组相比，spj不同剂量组十二指肠和结肠组织iap表达显著增加(p<0.01或p<0.05)，neu3表达显著降低(p<0.01)。