一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒、其制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医用新材料领域，尤其涉及一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒、其制备方法及应用。
背景技术：
：光热疗法(ptt)作为一种较新的癌症治疗方法，引起了人们的广泛关注。光热剂使吸收的近红外(nir)光转化为热能，使肿瘤细胞凋亡。与传统的肿瘤治疗方法相比，ptt具有侵袭小、效率高、组织浸润深、治疗无创等优点。(参见dul,qinh,mat,zhangt,xingd.invivoimaging-guidedphotothermal/photoacousticsynergistictherapywithbioorthogonalmetabolicglycoengineering-activatedtumortargetingnanoparticles.acsnano.2017；11(9)：8930.)。为了提高光热治疗的效果，有必要对肿瘤组织进行早期准确的诊断，如肿瘤大小和位置等信息。在现有的成像诊断模式中，光声成像(pai)是一种新兴的诊断技术，其优点结合了光学成像的高选择性和超声成像的高分辨性，以及较强的组织穿透能力。另一方面，纳米粒子在肿瘤中更好的聚集需要光热治疗新策略的发展。多功能纳米粒子具有良好的诊断和治疗功能，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。然而，作为一种常见的肿瘤靶向策略，几乎所有的纳米颗粒都是基于epr效应进入肿瘤的，这限制了纳米颗粒在肿瘤部位的积累。(参见m,thurechtkj,michaelm,scottam,carusof.bridgingbio-nanoscienceandcancernanomedicine.acsnano.2017；11(10)：9594-613.)。此外，复杂的制备工艺和体内毒性都限制了多功能纳米颗粒的应用。细胞介导策略可以帮助纳米颗粒有效规避生物屏障，实现肿瘤主动靶向。(参见xingy,zhangj,chenf,liuj,caik.mesoporouspolydopaminenanoparticleswithco-deliveryfunctionforovercomingmultidrugresistanceviasynergisticchemo-photothermaltherapy.nanoscale.2017；9(10)：1039.c7nr01857f.)。所述天然的具有运输功能的细胞包括人的细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、神经干细胞(nscs)、间充质干细胞(mscs)、t细胞(t-cells)和巨噬细胞。细胞介导的纳米颗粒要求材料毒性低，具有优异的光热性能和成像能力。这就需要开发出低毒或无毒的光热材料，且具有成像功能，可以进行精准的光热的治疗。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒、其制备方法及应用，本发明提供的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒可以主动靶向肿瘤部位，具有优良的光声成像特性，并且在光声成像的指导下，进行有效的光热治疗。本发明提供了一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒，由配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育后得到；所述配位聚合纳米颗粒由包括多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的原料制备得到。优选的，所述具有运输功能的细胞包括人的细胞因子诱导的杀伤细胞、神经干细胞、间充质干细胞、t细胞和巨噬细胞中的一种或几种。优选的，所述三价铁盐为氯化铁。优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为10000～100000。优选的，所述配位聚合物纳米颗粒的粒径为60～100nm。本发明还提供了一种上文所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a)将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮在ph＝7.4的条件下反应，得到配位聚合物纳米颗粒；b)将配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育，离心、清洗后得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。优选的，所述多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1～100：1：1～150。优选的，所述反应的温度为25～45℃；所述反应的时间为1～72h；所述共孵育的温度为30～40℃；所述共孵育的时间为1～48h。本发明还提供了一种上文所述的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒或上文所述的制备方法制备的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在制备治疗剂中的应用，所述治疗剂包括光热治疗剂。本发明还提供了一种上文所述的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒或上文所述的制备方法制备的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在制备成像剂中的应用，所述成像剂包括光声成像剂。本发明提供了一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒，由配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育后得到；所述配位聚合纳米颗粒由包括多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的原料制备得到。本发明提供的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒可以主动靶向肿瘤部位，具有优良的光声成像特性，并且在光声成像的指导下，进行有效的光热治疗。本发明还提供了一种上文所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a)将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮在ph值＝7.4的条件下反应，得到配位聚合物纳米颗粒；b)将配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育，离心、清洗后得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。本发明制备的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒可以主动靶向肿瘤部位，具有优良的光声成像特性，并且在光声成像的指导下，进行有效的光热治疗。另外，本发明提供的制备方法中，不需要提纯，不采用有机溶剂，就可以直接应用到细胞介导策略中，简单快捷，同时，原料价格低廉，毒性较低。附图说明图1为实施例4制备的配位聚合物纳米颗粒的扫描电镜图；图2为实施例8得到的实验组细胞和对照组细胞中铁的含量；图3为实施例4得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在肿瘤部位的光声信号随时间的变化情况图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒，由配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育后得到；所述配位聚合纳米颗粒由包括多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的原料制备得到。在本发明的实施例中，所述具有运输功能的细胞包括人的细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、神经干细胞(nscs)、间充质干细胞(mscs)、t细胞(t-cells)和巨噬细胞中的一种或几种。本发明对所述人的细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、神经干细胞(nscs)、间充质干细胞(mscs)、t细胞(t-cells)和巨噬细胞的来源并无特殊的限制，可以为一般市售。本发明中，所述配位聚合纳米颗粒由包括多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的原料制备得到。在本发明的某些实施例中，所述三价铁盐为氯化铁。在本发明的某些实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为10000～100000。在某些实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为10000～60000。在某些实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为40000。在本发明的某些实施例中，所述多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1～100：1：1～150。在某些实施例中，所述多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1～30：1：20～100。在某些实施例中，所述多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1.4：1：30、2.1：1：30、2.8：1：30、1.4：1：18、2.1：1：18或2.8：1：18。在本发明的某些实施例中，所述配位聚合物纳米颗粒具有均一的粒径，为60～100nm。本发明提供了一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒，由配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育后得到；所述配位聚合纳米颗粒由包括多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮的原料制备得到。本发明提供的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒可以主动靶向肿瘤部位，具有优良的光声成像特性，并且在光声成像的指导下，进行有效的光热治疗。本发明还提供了一种上文所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a)将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮在ph＝7.4的条件下反应，得到配位聚合物纳米颗粒；b)将配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育，离心、清洗后得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。所述原料的组分和配比同上，在此不再赘述。本发明先将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮在ph＝7.4的条件下反应，得到配位聚合纳米颗粒。具体的，将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮混合，将混合后的溶液的ph值调节为7.4，然后进行反应；或：将多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮和水混合，调节ph值为7.4，加入氯化铁，反应后，得到配位聚合纳米颗粒。在本发明的实施例中，调节溶液的ph值采用ph值调节剂，所述ph值调节剂可以为氢氧化钠，磷酸缓冲盐溶液，或dmem培养基。调节溶液的ph值至7.4，有利于直接孵育细胞。在本发明的实施例中，所述反应的温度为25～45℃。在本发明的某些实施例中，所述反应的温度为37℃。在本发明的实施例中，所述反应的时间为1～72h。在本发明的某些实施例中，所述反应的时间为6～60h。在某些实施例中，所述反应的时间为24h或4h。所述反应后，无需再进行其他步骤，可以直接得到配位聚合物纳米颗粒。得到配位聚合物纳米颗粒后，将配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育，离心、清洗后得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。在本发明的实施例中，将配位聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育具体为：将具有运输功能的细胞培养至对数生长期，加入配位聚合物纳米颗粒的溶液，进行共孵育。在本发明的某些实施例中，所述配位聚合物纳米颗粒的溶液浓度为0.05～1mg/ml。所述配位聚合物纳米颗粒的溶液的溶剂为dmem无血清无酚红培养液。本发明对所述dmem无血清无酚红培养液的来源和种类并无特殊的限制，可以为一般市售，在本发明的某些实施例中，所述dmem无血清无酚红培养液包含4.0mmol/l的l-谷氨酸和4500mg/l的葡萄糖。在本发明的实施例中，所述共孵育的温度为30～40℃。在本发明的某些实施例中，所述共孵育的温度为37℃。在本发明的实施例中，所述共孵育的时间为1～48h。在本发明的某些实施例中，所述共孵育的时间为1～12h。在某些实施例中，所述共孵育的时间为2h，4h，6h，8h，12h，18h或24h。在本发明的某些实施例中，所述离心的转速为1000rpm，所述离心的时间为5min。在本发明的实施例中，所述清洗后，还包括收集细胞，得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。本发明还提供了一种上文所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：a)将多巴胺、三价铁盐和聚乙烯吡咯烷酮在ph值＝7.4的条件下反应，得到配位聚合纳米颗粒；b)将聚合物纳米颗粒与具有运输功能的细胞共孵育，离心、清洗后得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。本发明制备的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒可以主动靶向肿瘤部位，具有优良的光声成像特性，并且在光声成像的指导下，进行有效的光热治疗。另外，本发明提供的制备方法中，不需要提纯，不采用有机溶剂，就可以直接应用到细胞介导策略中，简单快捷，同时，原料价格低廉，毒性较低。本发明还提供了一种上文所述的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒或上文所述的制备方法制备得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在制备治疗剂中的应用，所述治疗剂包括光热治疗剂。本发明还提供了一种上文所述的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒或上文所述的制备方法制备得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在制备成像剂中的应用，所述成像剂包括光声成像剂。本发明中，所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒将应用于光声成像和光热治疗。本发明优选按照以下方法进行：1)细胞培养：在本发明中，选用4t1、mcf-7、hela、cho、3t3、l929、mscs、raw264.7等细胞系。所述细胞培养的方法没有特殊限制，根据本领域技术人员熟知的方法即可。本发明中，优选含10％的胎牛血清对细胞进行培养，所述培养条件优选在体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养，培养温度优选37℃。本发明中，所述4t1、mcf-7、hela、cho、3t3、l929、mscs、raw264.7等细胞系的来源均为一般市售，本发明对此并无特殊的限制。2)细胞毒性：在本发明中，选用4t1、mcf-7、hela、cho、3t3、l929、mscs、raw264.7、mscs等细胞系。用96孔板，以1×104/孔的密度接种，加入200μl培养液，培养过夜后，加入不同浓度的配位聚合纳米颗粒溶液，共同培养时间分别为2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h。加入20μl浓度为5mgml-1的噻唑蓝溶液，4h后，将培养液吸出，加入150μl的二甲基亚砜。酶标仪振荡5min后，检测在490nm下每孔的吸光度值。并通过以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(a样品/a空白)×100。本发明中，所述4t1、mcf-7、hela、cho、3t3、l929、mscs、raw264.7、mscs等细胞系的来源均为一般市售，本发明对此并无特殊的限制。3)经配位聚合物纳米颗粒处理的细胞含铁量测定：在本发明中，选用mscs、raw264.7细胞系，将配位聚合纳米颗粒加入到生长到对数期的mscs、raw264.7细胞系中，用未经处理的mscs、raw264.7细胞作为空白对照。培养温度为37℃，培养时间分别为4h。用pbs缓冲液洗净多余材料，将细胞收集并离心计数，加入发烟硝酸溶解，用油浴锅加热，从65℃缓慢升高温度到135℃。完全溶解后，样品送icp-ms测试铁元素含量。4)光声成像及肿瘤蓄积：在本发明中，实验选用接种有4t1肿瘤balb/c裸鼠模型，待瘤体积长至100～150mm3时，将细胞介导的配位聚合物纳米颗粒通过尾静脉注入老鼠体内，采用光声成像仪器检测0h、6h、12h、24h、48h、72h时肿瘤区域的信号情况。测试过程中，选用波长范围在680-800nm，优选为800nm。光声成像测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。5)光热治疗：在本发明中，所述的光热治疗测试包括体外光热治疗和体内光热治疗。体外光热治疗和体内光热治疗的测试方法并无特殊限制，按照本领域技术人员熟知的方法即可。体外光热治疗测试选用4t1，mcf-7，hela细胞系。将以上细胞接种在96孔板上，接种密度为1×104/孔，培养过夜。将细胞介导的配位聚合物纳米颗粒分别以细胞数为0，100×104，200×104，300×104，400×104加入到96孔板中。采用808nm激光器进行照射，激光器功率优选为0.8～1.2w/cm2，更优选为1.0～1.2w/cm2；照射时间优选为3～8min，最优选为4～6min。照射完成后，将细胞介导的配位聚合物纳米颗粒小心吸出，加入200μl培养液，继续培养24h，每孔加入噻唑蓝溶液20μl，4h后，加入二甲基亚砜溶解，用酶标仪检测490nm下每孔吸光度值。细胞存活率采用以下公式计算：细胞存活率(％)＝(a样品/a空白)×100。在本发明中，体内实验选用接种有4t1肿瘤balb/c裸鼠模型，待瘤体积长至100～150mm3时，将细胞介导的铁-多酚配位聚合物纳米颗粒通过尾静脉注入老鼠体内，配合光声成像结果，当肿瘤蓄积量达到最大时，采用激光器照射肿瘤处，进行光热治疗，激光器功率优选为0.8～1.2w/cm2，更优选为1.0～1.2w/cm2；照射时间优选为3～8min，最优选为4～6min。照射完成后，每3天测试测量一次肿瘤体积大小和老鼠体重的变化，整个实验过程共跟踪24天。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(v)＝(长度)×(宽度)2/2为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种细胞介导的配位聚合物纳米颗粒、其制备方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。以下实施例所用的原料均为一般市售。实施例1～6将多巴胺、氯化铁和聚乙烯吡咯烷酮混合，采用磷酸缓冲盐溶液将混合后的溶液的ph值调节为7.4，在37℃反应24h后，得到配位聚合纳米颗粒。巨噬细胞培养至对数生长期，加入配位聚合物纳米颗粒，在37℃下共孵育4h，离心、将多余的材料洗净后，收集细胞，得到细胞介导的配位聚合物纳米颗粒。其中，聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量为40000。多巴胺、氯化铁和聚乙烯吡咯烷酮的质量比见表1。表1实施例1～6中多巴胺、氯化铁和聚乙烯吡咯烷酮的质量比实施例多巴胺、氯化铁和聚乙烯吡咯烷酮的质量比11.4：1：3022.1：1：3032.8：1：3041.4：1：1852.1：1：1862.8：1：18利用扫描电镜对实施例4制备得到的配位聚合物纳米颗粒进行扫描电镜分析，得到的扫描电镜图如图1所示。图1为实施例4制备的配位聚合物纳米颗粒的扫描电镜图。从图1可以看出，配位聚合物纳米颗粒具有均一的粒径，为60～100nm。实施例7将4t1、mcf-7、hela、cho、3t3、l929、mscs、raw264.7、mscs等细胞系。用96孔板，以1×104/孔的密度接种，加入200μl培养液，培养过夜后，加入不同浓度的实施例4制备得到的配位聚合物纳米颗粒溶液，共同培养时间分别为2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h。加入20μl浓度为5mgml-1的噻唑蓝溶液，4h后，将培养液吸出，加入150μl的二甲基亚砜。酶标仪振荡5min后，检测在490nm下每孔的吸光度值。并通过以下公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝(a样品/a空白)×100实验结果表明，所述细胞介导的配位聚合物纳米颗粒中，配位聚合物纳米颗粒的浓度在0.1～0.9mg/ml的浓度范围内细胞存活率约为90％，证明材料是低毒或无毒的，有利于在体内进一步应用。实施例8将实施例4制备的配位聚合物纳米颗粒分别加入到生长到对数期的mscs、raw264.7细胞系中，作为实验组；未经配位聚合物纳米颗粒处理的mscs、raw264.7细胞作为空白对照，为对照组。在37℃下培养时间分别为4h。用pbs缓冲液洗净多余材料。将细胞收集并离心计数，加入发烟硝酸溶解，用油浴锅加热，从65℃缓慢升高温度到135℃。完全溶解后，样品送icp-ms测试铁元素含量。经配位聚合物纳米颗粒处理的细胞含铁量，以及未经配位聚合物纳米颗粒处理的细胞含铁量如图2所示。图2为实施例8得到的实验组细胞和对照组细胞中铁的含量。从图2可以看出，未经配位聚合物纳米颗粒处理的细胞含铁量(1μg)远低于经配位聚合物纳米颗粒处理的细胞含铁量(超过6μg)，证明配位聚合物纳米颗粒被成功吞噬到细胞内。实施例9接种有4t1肿瘤balb/c裸鼠模型，待瘤体积长至100～150mm3时，将实施例4得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒尾静脉注入老鼠体内，采用光声成像仪器检测0h、6h、12h、24h、48h、72h时，肿瘤区域的信号情况。测试过程中，选用波长范围在680-800nm，优选为800nm。光声成像测试方法选用本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制。实验结果表明，肿瘤部位的信号逐渐增加，注射24h时后，此时的光声信号最强，之后逐渐降低，如图3所示。图3为实施例4得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在肿瘤部位的光声信号随时间的变化情况图。从图3可以看出，在0h，肿瘤部位的光声信号很弱，随着时间的推移，细胞介导的配位聚合纳米颗粒逐渐积累到肿瘤部位，令光声信号逐渐增强，在24h，信号最强，随后逐渐降低。说明实施例4制备的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒具有光声成像功能，且检测到当细胞介导的配位聚合物纳米颗粒注射至老鼠体内24h时，光声信号最强，可以指导进一步的光热治疗实验。实施例10体外光热治疗测试选用4t1，mcf-7，hela细胞系细胞系。将以上细胞接种在96孔板上，接种密度为1×104/孔，培养过夜。将实施例4得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒分别以细胞数为0，100×104，200×104，300×104，400×104加入到96孔板中。采用808nm激光器进行照射，激光器功率为1w/cm2；照射时间为6min。照射完成后，将细胞介导的配位聚合物纳米颗粒小心吸出，加入200μl培养液，继续培养24h，每孔加入噻唑蓝溶液20μl，4h后，加入二甲基亚砜溶解，用酶标仪检测490nm下每孔吸光度值。细胞存活率采用以下公式计算：细胞存活率(％)＝(a样品/a空白)×100体内实验选用接种有4t1肿瘤balb/c裸鼠模型，待瘤体积长至100～150mm3时，将细胞介导的配位聚合物纳米颗粒通过尾静脉注入老鼠体内，配合光声成像结果，当肿瘤蓄积量达到最大时，采用激光器照射肿瘤处，进行光热治疗，激光器功率为1.0w/cm2；照射时间为6min。照射完成后，每3天测量一次肿瘤体积大小和老鼠体重的变化，整个实验过程共跟踪24天。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(v)＝(长度)×(宽度)2/2实验结果表明，在体外光热实验中，随着细胞数的增加，在808nm激光器照射下对肿瘤细胞的毒性越大，当肿瘤细胞数为300×104时，肿瘤细胞存活率低于10％。证明细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在激光照射下，能够有效的将近红外光转换成热能，显著杀死肿瘤细胞。在光声成像指导下，在尾静脉注射24h后，对肿瘤部位进行光热治疗。结果表明，治疗组的肿瘤不再生长，被显著抑制。24天后，绝大部分肿瘤被治愈。而未治疗组肿瘤在24天后体积大于1500mm3，证明实施例4得到的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒能够在体内有效的将近红外光转化为热能，杀死肿瘤组织。体内光声成像结果表明，通过尾静脉注射的细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在24h时，肿瘤部位的信号值达到最大，之后逐渐降低。并且实验组与仅注射配位聚合物纳米颗粒的对照组相比，细胞介导的配位聚合物纳米颗粒在肿瘤部位的光声信号明显高于配位聚合物纳米颗粒，这进一步表明了细胞介导的配位聚合物纳米颗粒具有主动靶向肿瘤部位的能力，在光声成像指导下，对肿瘤部位进行光热治疗。结果表明，治疗组的肿瘤不再生长，被显著抑制。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12