一种靶向递送siRNA的核酸胶束及其制备方法与应用与流程

本公开具体涉及一种靶向递送sirna的核酸胶束及其制备方法与应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

癌症是威胁人类健康的恶性疾病之一。化疗是最常见的一种治疗方式，但由此引起的多药耐药性往往会导致治疗效果不佳，因此抑制多药耐药基因的表达对提高癌症的治疗效率具有十分重要的意义。

作为一种新型的治疗手段，rna干扰技术的基因沉默对疾病治疗效果显著，并为新药的研发提供了新思路。小干扰rna(sirna)具有安全性好、特异性高等优点，可用于多种疾病的治疗，但其在临床应用方面仍存在一些问题。例如，由于sirna的分子量较大，所带负电荷高，因此细胞膜渗透性较差，难以实现细胞内吞。其次，裸露的sirna不稳定，在体内循环过程中易被降解，因此需要建立稳定且高效的输送系统，以实现将sirna递送到肿瘤细胞的相关作用位点。

技术实现要素：

针对背景技术，本公开提供一种基于核酸胶束靶向递送两种sirna的制备方法及其应用，利用点击化学将疏水性的聚合物药物载体与亲水性的核酸连接起来，并通过自组装形成包含sirna且适配体封端的核酸胶束，适配体与细胞膜受体的结合可将两种sirna靶向递送至乳腺癌细胞mcf-7内，从而抑制多药耐药基因(mdr1)的表达。该方法操作简单、快速，表现出较高的基因沉默效率，有望广泛应用于癌症的基因治疗。

具体的，本公开采用以下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供一种靶向递送sirna的核酸胶束，该核酸胶束包括：以叠氮基改性的聚乳酸自组装形成的疏水性内核；以及，与所述疏水性内核相连接的核酸链；

其中，所述核酸链包括修饰炔基的连接链、两种包含sirna的核酸链、以及包含适配体的核酸链，所述修饰炔基的连接链与包含一种反义sirna的核酸链碱基互补，所述包含适配体的核酸链与包含另一种正义sirna的核酸链碱基互补，所述适配体特异性识别细胞膜受体。

在本公开的第二个方面，提供所述靶向递送sirna的核酸胶束的制备方法，包括以下步骤：

通过点击化学反应将修饰炔基的连接链与叠氮基改性的聚乳酸(n3-pla)连接，形成a-pla缀合物(其中a表示修饰炔基的连接链)；

a-pla缀合物自组装形成两亲性a-pla胶束结构；

包含反义sirna的核酸链与包含正义sirna的核酸链通过碱基互补配对形成两种包含sirna的结构单元，这两种结构单元通过碱基互补配对原则依次连接，最后与包含适配体的核酸链连接，得到所述靶向递送sirna的核酸胶束；

其中，所述sirna是正义sirna和反义sirna碱基互补形成的产物。

在本公开的第三个方面，提供所述靶向递送sirna的核酸胶束在制备抗癌药物中的应用。

在本公开的第四个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包括所述靶向递送sirna的核酸胶束。

在本公开的第五个方面，提供一种抗癌的产品，该产品包括所述药物组合物。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)具有良好的靶向性，有利于sirna在癌细胞中的积累。

(2)操作简便，具有良好的生物相容性，基因沉默效率高。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1：叠氮基改性的聚乳酸载体的制备方法。

图2：制备含有两种sirna的核酸胶束示意图。

图3：不同浓度cu⁺催化下所得a-pla缀合物的凝胶电泳图。

图4：自组装过程的凝胶电泳图。

图5：不同浓度核酸胶束对mcf-7细胞活性的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前需要更加稳定且高效的输送系统将sirna递送到肿瘤细胞的相关作用位点，为了解决如上的技术问题，本公开首先制备了叠氮基改性的聚乳酸载体，该方法易于操作，与多臂聚乳酸相比，所得到的产物为线性结构，空间位阻较小，经过实验验证，该叠氮基改性的聚乳酸有利于接下来反应的进行。其次，通过自组装技术构建以聚乳酸为疏水性内核，核酸链为亲水层的核酸胶束，可将两种sirna同时靶向递送至癌细胞(例如，mcf-7细胞)中，抑制多药耐药基因的表达，从而促进细胞凋亡。

在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种靶向递送sirna的核酸胶束，该核酸胶束包括：以叠氮基改性的聚乳酸自组装形成的疏水性内核；以及，与所述疏水性内核相连接的核酸链；

其中，所述核酸链包括修饰炔基的连接链、两种包含sirna的核酸链、以及包含适配体的核酸链，所述修饰炔基的连接链与包含一种反义sirna的核酸链碱基互补，所述包含适配体的核酸链与包含另一种正义sirna的核酸链碱基互补，所述适配体特异性识别细胞膜受体。

多药耐药是导致化疗失败的主要原因，因此抑制多药耐药基因的表达显得极其重要。bcl-2家族成员在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，其蛋白质产物能抑制细胞的凋亡。在本公开的一个或一些实施方式中，所述两种sirna为bcl-2特异性sirna，均起到诱导mrna降解的作用，从而抑制翻译的完成，促进细胞凋亡。

一种bcl-2sirna，

正义链：5'-gcugcaccugacgcccuucuu-3'，

反义链：5'-gaagggcgucaggugcagcuu-3'；

另一种bcl-2sirna，

正义链：5'-guacauccauuauaagcuguu-3'，

反义链：5'-cagcuuauaauggauguacuu-3'。

本公开所选用的两种sirna正义链分别如表1中seqidno.3和seqidno.5中划线部分所示，sirna反义链分别如seqidno.2和seqidno.4中划线部分所示，所述两种sirna分别是seqidno.3中的5'-gcugcaccugacgcccuucuu-3'与seqidno.2中的5'-gaagggcgucaggugcagcuu-3'，seqidno.5中的

5'-guacauccauuauaagcuguu-3'与seqidno.4中的

5'-cagcuuauaauggauguacuu-3'碱基互补形成的双链结构。

根据所选的修饰炔基的连接链，包括但并不仅仅限于：5'-ch≡c-ttttttttttttttttgcuggaggga-3'，如seqidno.1所示。

根据所选的包含适配体的核酸链，包括但并不仅仅限于：

5'-gcagttgatcctttggataccctggucccuccagc-3'，如seqidno.6所示。其中划线部分是粘蛋白muc1的适配体序列，其自身结构呈发夹状，muc1在mcf-7细胞表面过表达。

在本公开的第二个典型的实施方式中，提供所述靶向递送sirna的核酸胶束的制备方法，包括以下步骤：

通过点击化学反应将修饰炔基的连接链与叠氮基改性的聚乳酸(n3-pla)连接，形成a-pla缀合物(其中a表示修饰炔基的连接链)；

a-pla缀合物自组装形成两亲性a-pla胶束结构；

包含反义sirna的核酸链与包含正义sirna的核酸链通过碱基互补配对原则形成两种包含sirna的结构单元，这两种结构单元通过碱基互补配对原则依次连接，最后与包含适配体的核酸链连接，得到所述靶向递送sirna的核酸胶束。

在本公开的一个或一些实施方式中，为了能够得到生物相容性较好的胶束，本公开的胶束选择叠氮基改性的聚乳酸，进一步的，本公开提供一种叠氮基改性的聚乳酸的制备方法，利用2-叠氮基乙醇，在催化剂1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)的作用下将dl-丙交酯开环聚合，得到叠氮基改性的聚乳酸。

更进一步的，选择聚合度为5.50的叠氮基改性的聚乳酸，化学结构为经过实验验证，与多臂聚乳酸分子相比，本申请选择的叠氮基改性的聚乳酸有利于后续的反应，同时能够得到更加稳定的核酸胶束。

本公开通过控制开环聚合时间得到聚合度为5.50的叠氮基改性的聚乳酸。

本公开的点击化学反应的基本原理是炔基与叠氮基发生环加成反应，在本公开的一个或一些实施方式中，具体方法包括：将所述叠氮基改性的聚乳酸与修饰炔基的连接链混合，在cu⁺的催化下于37℃下反应3h，得到a-pla缀合物(其中a表示修饰炔基的连接链)。

在本公开的一个或一些实施方式中，提供一种自组装的方法，包括a-pla缀合物、两种包含sirna的结构单元以及包含适配体的核酸链通过碱基互补配对依次连接。

具体自组装过程包括：a-pla缀合物与两种包含sirna的结构单元在37℃下反应2h，最后加入包含适配体的核酸链，在37℃下继续反应2h，得到靶向递送sirna的核酸胶束。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，提供一种靶向递送sirna的核酸胶束的制备方法，包括以下具体的方法：

核酸的配制：用te缓冲液分别将各条核酸链稀释备用，包含适配体的核酸链退火处理：将该链加热退火，冷却；

核酸胶束的制备：将2-叠氮基乙醇、dl-丙交酯以及dbu溶于氘代氯仿中，加热并搅拌30min，将得到的产物与修饰炔基的连接链按照设定比例混合，加入cu⁺催化反应的进行，于37℃下反应3h得到a-pla缀合物；

自组装过程：a-pla缀合物与两种包含sirna的结构单元在37℃下反应2h，最后加入包含适配体的核酸链在37℃下继续反应2h，得到靶向递送sirna的核酸胶束。

在本公开的第三个典型的实施方式中，提供所述靶向递送sirna的核酸胶束在制备抗癌药物中的应用。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述靶向递送sirna的核酸胶束作用于mcf-7细胞。

在本公开的第四个典型的实施方式中，提供一种药物组合物，该药物组合物包括所述靶向递送sirna的核酸胶束。

在本公开的第五个典型的实施方式中，提供一种抗癌的产品，该产品包括所述药物组合物。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述产品为药物。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1实验原理

如图1，2所示，首先利用2-叠氮基乙醇，在催化剂1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)的作用下将dl-丙交酯开环聚合，得到叠氮基改性的聚乳酸。该体系包括6条核酸链，分别是5'端修饰炔基的连接链(a)，包含一种反义sirna的核酸链(b)、包含一种正义sirna的核酸链(c)、包含另一种反义sirna的核酸链(d)、包含另一种正义sirna的核酸链(e)以及包含适配体的核酸链(f)。在cu⁺的催化作用下，5'端修饰炔基的a链与叠氮基改性的聚乳酸连接形成a-pla缀合物，该缀合物在水溶液中自组装形成两亲性a-pla胶束。在自组装的过程中，首先将a-pla缀合物与两种包含sirna的结构单元(b-c、d-e)以1:10:10的比例混合反应，最后加入f链以形成包含sirna且适配体封端的核酸胶束。通过膜受体与适配体的特异性结合，将该胶束靶向递送至mcf-7细胞中，在dicer酶的作用下分解成sirna，抑制mdr1的表达，从而促进细胞凋亡。

实施例2一种靶向递送sirna的核酸胶束的制备方法，包括以下步骤：

(1)核酸的配制：用te缓冲液(10nmtris-hcl缓冲液，1mm乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，12.5mmmgcl2，ph8.0)分别将a、b、c、d、e、f链稀释至10μm。f链退火处理：将10μm的f链加热至95℃运行5min，随后以0.1℃/s冷却至25℃，并在25℃下继续稳定2h。

(2)a-pla缀合物的制备：称取0.0251g2-叠氮基乙醇，0.5gdl-丙交酯以及0.066gdbu溶于5ml氘代氯仿中，加热并搅拌30min得到叠氮基改性的聚乳酸。将上述产物与修饰炔基的a链以质量比为4×10⁴:1混合，加入不同浓度的cubr催化反应的进行，于37℃下反应3h得到a-pla缀合物。

(3)自组装过程：将10μl10μm的b、d链分别与10μl10μm的c、e链混合，于37℃下反应2h得到两种包含sirna的结构单元(b-c、d-e)，随后加入1μl10μm(2)中制备的a-pla于37℃下继续反应2h，最后加入1μl10μm的f链，于37℃下反应2h，得到包含sirna且适配体封端的核酸胶束。

表1本公开中用到的核酸序列

实施例3mtt法检测mcf-7细胞存活率：

将mcf-7对数期细胞以3×10³/孔接种于96孔板中200μl培养基中，在37℃下培养24h。将含有不同浓度核酸胶束(1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的溶液与细胞孵育24h，其中cu⁺的浓度为200μm。弃去产物的上清液，每孔用150μldmso溶解，振荡10min，采用mtt法用酶标仪读取490nm处的吸光度，计算mcf-7细胞的存活率。

实验结果：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证修饰炔基的a链与叠氮基改性的聚乳酸间的连接，并验证自组装过程。如图3所示，泳道1表示a链，泳道2-4表示cu⁺的浓度分别为2μm，20μm以及200μm时a链与pla反应后的产物，随着cu⁺浓度的增加，反应效率增加，证明了a链与pla间的连接。图4泳道1-3分别表示a-pla:b-c:d-e＝1:1:1，a-pla:b-c:d-e＝1:10:10，以及a-pla:b-c:d-e:f＝1:10:10:1(均为摩尔比)反应后的产物，证明了自组装过程的进行。

mtt法检测mcf-7细胞存活率：

细胞存活率结果如图5所示，结果表明核酸胶束制剂在mcf-7细胞中表现出剂量依赖性的细胞毒性作用。随着核酸胶束浓度的增加(1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)，mcf-7细胞存活率逐渐降低(92％，85％，82％，75％，66％)。说明核酸胶束可以成功地将sirna输送到细胞中，且核酸胶束浓度越大，促进mcf-7细胞凋亡的效果越好。

实施例4

一种抗mcf-7细胞的药物制剂，其包括采用实施例2的方法制备得到的靶向递送sirna的核酸胶束，该制剂的产品形式为注射剂。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

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<110>青岛大学

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