一种靶向GnRH受体的近红外荧光成像探针及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是有关于治疗生殖系统恶性肿瘤的肿瘤特异性荧光探针的制备方法与应用。

背景技术：

恶性肿瘤是人类健康的重要威胁。预计2018年全球有超过1800万新发癌症病例和960万因癌症死亡病例。在生殖系统相关恶性肿瘤中，男性中前列腺癌占新发肿瘤病例的13.5%，女性中乳腺癌、子宫体肿瘤和卵巢癌分别占新发病例的24.2%、4.4%和3.4%。

手术是实体肿瘤的重要治疗方式，手术彻底性与预后密切相关。为达到彻底切除，术中对病灶的准确识别是关键。现有的影像学手段如超声、ct、mri等为肿瘤非特异成像，难以在术中提供实时成像。荧光指导手术使用肿瘤靶向的荧光探针通过术中实时荧光成像指导病灶切除，有助于提高手术彻底性，进而改善预后。实现术中成像关键在于开发肿瘤特异性的荧光探针，这类探针多由靶向基团和成像探针两部分组成。

生殖系统恶性肿瘤与下丘脑-垂体-性腺轴相关激素关系密切，如促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasinghormone,gnrh）。生理条件下，gnrh受体的分布相对局限于垂体和生殖系统，包括卵巢、子宫内膜、胎盘、乳腺、前列腺等。研究证实，生殖系统相关恶性肿瘤中gnrh受体高表达，其中前列腺癌的表达率为86%，卵巢癌和子宫内膜癌为80%，乳腺癌为50%。以gnrh受体为靶点的肿瘤靶向治疗已取得系列进展，因此gnrh受体也可能成为肿瘤特异性成像的靶点。

与gnrh受体特异性结合的gnrh多肽片段可用作成像探针的靶向基团。目前已有多种gnrh受体的激动剂或拮抗剂进入临床应用，结构上类似天然gnrh多肽。以小分子多肽作为靶向基团是一种常用的靶向策略，在肿瘤靶向治疗领域已有较多应用，在肿瘤靶向成像的研究也逐渐增多。与单抗相比，小分子多肽具有免疫原性弱、体内快速分布、穿透性强、易于合成和修饰等优点。部分基于多肽的肿瘤靶向成像探针已进入临床试验阶段，如探针blz-100由多肽chlorotoxin与吲哚菁绿（indocyaninegreen,icg）偶联而成，探针ge-137由cmet靶向多肽与cy5偶联而成。

近红外荧光染料具有穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，更适合用于活体成像。icg是美国fda批准进入临床的近红外荧光染料，用于血管造影、肿瘤前哨淋巴结显像、肝功能检测等。文献报道，由于肿瘤组织血管通透性增加以及淋巴回流受阻，icg也可以在肿瘤组织聚集。但是icg不能特异性结合肿瘤细胞，其直接用于卵巢癌病灶显像的假阳性率高达62%。

因此，有必要在近红外荧光染料icg显像优势的基础上，增加其特异性显像能力。本发明将可特异结合gnrh受体的gnrh多肽与近红外荧光染料icg偶联，制备出一种靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针。该探针能够在体内外靶向识别高表达gnrh受体的肿瘤细胞和瘤灶，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明提供一种靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针及其制备方法与应用，所述靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针gnrha-icg由gnrh多肽（gnrha）和活化后的近红外荧光染料icg-nhs偶联而成，gnrha-icg的结构式如下：

所述近红外荧光染料icg-nhs的结构式如下：

所述gnrh多肽仅选用临床药物gnrh受体拮抗剂西曲瑞克cetrorelix的氨基酸序列，而不用该药物的修饰基团，序列式为d-2-nal-d-4-cl-phe-d-3-pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2，结构式如下：

一种靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针的制备方法，包括下列步骤：

（1）采用固相载体合成多肽gnrha；

（2）将步骤（1）所得多肽gnrha取3mg与20μln,n-二异丙基乙胺和0.5ml超干dmf加入到5ml反应瓶中，氮气保护下反应10min；将1mgicg-nhs加入dmf反应液中，室温下继续搅拌反应12h；

（3）将步骤（2）所得反应液用5ml乙醚沉降，得到绿色固体；

（4）将步骤（3）所得固体用少量甲醇溶解后，通过高效液相色谱分离、提纯、冻干，得到绿色固体产物2mg，产率为80%。

本发明靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针应用于：利用人肿瘤细胞系与裸鼠腹腔种植瘤模型检测探针与肿瘤细胞的结合能力，靶向探针gnrha-icg能够在体内外靶向识别高表达gnrh受体的肿瘤细胞和瘤灶。

通过人肿瘤细胞系检测探针与肿瘤细胞的结合能力，结果表明，靶向探针gnrha-icg的结合力强于icg；通过人卵巢癌细胞系裸鼠腹腔种植瘤模型检测探针的活体成像能力，结果表明，靶向探针gnrha-icg能与腹腔种植灶特异性结合，效果优于icg。

本发明的优点是：

1.本发明利用gnrh受体在卵巢癌等生殖系统肿瘤中高表达，基于gnrh多肽与gnrh受体特异性结合的原理，靶向识别肿瘤细胞。

2.本发明利用近红外荧光染料icg穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。

附图说明

图1gnrha-icg探针的合成和hplc表征；

图2gnrha-icg和icg的紫外吸收图谱和荧光图谱；

图3gnrha-icg和icg与肿瘤细胞的结合；

图4gnrha-icg和icg在裸鼠腹腔种植瘤模型中的显像。

具体实施方式

本发明提供的一种新型的靶向gnrh受体的近红外荧光成像探针gnrha-icg，由gnrh多肽（gnrha）和近红外荧光染料icg偶联而成。制备方法如下：

（1）采用固相载体合成多肽gnrha，序列d-2-nal-d-4-cl-phe-d-3-pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2；

（2）将步骤（1）所得多肽gnrha取3mg与20μln,n-二异丙基乙胺和0.5ml超干dmf加入到5ml反应瓶中，氮气保护下反应10min；将1mgicg-nhs加入dmf反应液中，室温下继续搅拌反应12h；

（3）将步骤（2）所得反应液用5ml乙醚沉降，得到绿色固体；

（4）将步骤（3）所得固体用少量甲醇溶解后，通过高效液相色谱分离、提纯、冻干，得到绿色固体产物2mg，产率为80%。

gnrha-icg探针的合成路线和hplc表征见附图1。

配置浓度为2.5μm的gnrha-icg和icg溶液（溶剂为dmso），使用分光光度计检测探针的紫外吸收光谱，使用荧光光谱仪检测探针的荧光光谱。结果见附图2。

实施例

上述近红外荧光探针在肿瘤靶向成像应用的具体实施方式如下：

将处于对数生长期的人卵巢癌细胞系a2780（高表达gnrh受体）和人肺癌细胞系h1299（低表达gnrh受体）接种于腔室载玻片，待细胞汇合度达50%开始实验。吸去培养液，pbs缓冲液洗1遍。分别加入60μm的gnrha-icg和icg，37℃条件下与肿瘤细胞孵育30min。吸净上清，pbs洗3遍。加入4%多聚甲醛于室温固定10min。吸去固定液，pbs洗1遍。加入细胞膜染料wga488于室温孵育10min。吸净膜染料，pbs洗3遍。用含dapi的荧光封片剂封片，共聚焦显微镜观察荧光强度。

将处于对数生长期的人卵巢癌细胞系a2780接种于12孔板，待细胞汇合度达60%开始实验。吸去培养液，pbs洗1遍。分别加入5μm的gnrha-icg和icg，37℃条件下与肿瘤细胞孵育30min。吸净上清，pbs洗3遍。胰酶消化制成细胞悬液，流式细胞仪检测荧光强度。

上述检测结果见附图3。gnrha-icg和icg探针呈红色荧光，细胞膜呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。靶向探针gnrha-icg的荧光强度高于icg，gnrh受体高表达的a2780细胞系的荧光强度高于受体低表达的h1299细胞系（图3a）。流式细胞仪检测结果与荧光显微镜观察结果一致，gnrha-icg的平均荧光强度高于icg（图3b）。结果表明，靶向探针gnrha-icg对表达gnrh受体的肿瘤细胞的结合力强于icg。

将人卵巢癌细胞系a2780消化后制成单细胞悬液，按每只1x10⁷/100ul接种于雌性裸鼠腹腔。肿瘤细胞在腹腔播散种植生长，2周后种植灶数量可超过10个，大小约0.1cm-1cm。

实验组荷瘤小鼠腹腔注射0.03mg（1.5mg/kg）靶向探针gnrha-icg，对照组荷瘤小鼠腹腔注射0.03mg（1.5mg/kg）icg。注射成像探针后2h牺牲小鼠，打开腹腔进行近红外荧光活体成像检测（激发波长为780nm，发射波长为845nm）。随后取出主要器官和肿瘤组织，进行体外荧光成像检测。取实验组小鼠的肿瘤、肝脏（阳性对照）和骨骼肌（阴性对照）冰冻切片，用含dapi的荧光封片剂封片，用共聚焦显微镜观察荧光强度。

成像结果见附图4。实验组探针gnrha-icg在腹腔种植灶和肝脏有明显信号、肠道无信号（图4a），冰冻切片共聚焦显微镜观察与活体成像结果一致（图4b）；对照组探针icg消化道信号强，无法区分肿瘤病灶（图4c）。通过对比靶向探针gnrha-icg和icg的成像结果，提示靶向探针对活体肿瘤病灶有更高的选择性，可显著减弱icg在肠道等消化系统的非特异性显像，对肿瘤组织有较好的活体成像效果。