纳米脂质体组合物、其制备方法及滴眼剂与流程

本发明涉及纳米脂质体领域，具体而言，涉及纳米脂质体组合物、其制备方法及滴眼剂。
背景技术：
：脂质体作为一种生物降解性和生物相容性功能性成分药物载体，具备一定的靶向性和缓释性，它因以下几种优点近年来受到广泛的关注：(1)增加疏水性药物的溶解性；(2)增加药物在体内的稳定性；(3)延长治疗剂的释放时间；(4)降低了正常组织对药物的摄取，一定程度上减少了治疗剂的副作用；(5)通过对脂质体进行功能化修饰，从而增加患病部位对药物敏感性、定点释放药物以及增加细胞对药物的吞噬量。脂质体一般在水中所形成的囊泡，其直径一般在25-500nm之间，膜壁厚度在5nm左右。而利用药物的亲/疏水性，或将亲水性药物包载入脂质体内部的水相，或将疏水性药物插入脂质分子构成的双分子层中。而且通过调节脂质分子亲/疏水部分的比例，可以改变囊泡的形态，从而增加对不同药物的荷载量。蒙花苷是野菊花中活性最高的黄酮类成分，现代药理学研究表明，蒙花苷具有抗炎镇痛的作用，能抑制炎症介导素类如肿瘤坏死因子、白细胞介素的表达，并且对大鼠晶状体的醛糖还原酶有抑制活性。此外蒙花苷还具有抗衰老作用、抗缺氧作用、抗不良刺激作用、对机体双向调节作用、抗疲劳作用、抑制血糖升高作用。目前市售的野菊花滴眼剂多为复方制剂，含有多种成分，共同发挥着疗效。而蒙花苷作为野菊花的特征性化学成分，其提取纯化主要采用回流提取法、醇提水沉法、高效制备液相色谱法，大孔吸附树脂法等。但是上述操作工艺复杂且较容易破坏化合物结构，导致现有的野菊花滴眼剂中各活性成分包括蒙花苷的药物浓度可能较低，且操作工艺复杂、周期长，费时费溶剂，导致野菊花的药物利用度较低，造成大量的原料浪费，出现原料药大量投入，但收率甚微的现象。此外，蒙花苷具有低溶解度、低透过性的特性，在水中的平衡溶解度为0.059μg/mL，几乎不溶于水，在碱性溶液中的溶解度有所增加，脂溶性差，难以被机体吸收，导致生物利用度差。目前关于蒙花苷的制剂研究甚少，大大限制了其在临床上的应用。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种纳米脂质体组合物，所述纳米脂质体组合物具有以蒙花苷或其提取物为活性成分，并将其负载于纳米脂质体上；所述纳米脂质体组合物载药量适宜，提高了蒙花苷的溶解度和稳定性，能够达到较高的抗炎浓度，大大改善了蒙花苷的生物利用度。本发明的第二目的在于提供上述纳米脂质体组合物的制备方法，该方法操作简单高效、周期短，溶剂利用量少且能够循环利用，同时能够有效避免制备过程对活性成分化合物结构的破坏。本发明的第三目的在于提供包括上述纳米脂质体组合物的滴眼剂。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：纳米脂质体组合物，其包括纳米脂质体以及负载在所述纳米脂质体上的活性组分；所述活性组分选自蒙花苷或蒙花苷提取物；所述纳米脂质体的载药量为0.05mg/mL～0.1mg/mL。作为活性成分，蒙花苷是一种具有良好应用前景的抗血管炎症损伤的有效单体。蒙花苷(5、10、20μmol/L)能有效抑制LPS诱导的NF-κB蛋白过量表达；同时，蒙花苷(10、20μmol/L)能够明显降低MAPK家族蛋白的磷酸化，抑制NF-κB的活化，从而降低炎性因子和黏附因子的产生，减弱血管内皮炎症损伤程度。可选地，所述纳米脂质体的载药量下限可以独立地选自0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL。可选地，所述纳米脂质体的载药量上限可以独立地选自0.055mg/mL、0.06mg/mL、0.065mg/mL、0.07mg/mL、0.075mg/mL、0.08mg/mL、0.085mg/mL、0.09mg/mL、0.095mg/mL、0.1mg/mL。可选地，所述纳米脂质体的粒径为100nm～300nm。可选地，所述纳米脂质体的粒径下限可以独立地选自100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、280nm、300nm。可选地，所述纳米脂质体的粒径上限可以独立地选自110nm、130nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm、280nm、300nm。可选地，所述纳米脂质体的粒径为120nm～250nm。可选地，所述纳米脂质体的粒径为150nm～200nm。可选地，所述纳米脂质体组合物的包封率为50％～100％。可选地，按重量份计，所述纳米脂质体包括15～30份的胆固醇和70～85份的卵磷脂。根据本发明的另一目的，提供了上述任一纳米脂质体组合物的制备方法，其包括步骤：a)按配比，获得活性组分、胆固醇和卵磷脂的溶液；b)将步骤a)中获得的所述溶液中的溶剂通过蒸发脱除，获得脂质薄膜；c)在40℃～60℃下，向步骤b)中获得的所述脂质薄膜中加入水，搅拌和/或超声，获得混悬液，过滤，获得纳米脂质体组合物。可选地，步骤a)中所述溶液的溶剂选自乙醇、甲醇、乙酸乙酯中的至少一种。可选地，步骤b)中脱除溶剂的温度为40℃～60℃。可选地，步骤a)中所述溶液的溶剂为乙醇。可选地，步骤b)中脱除溶剂的温度为45℃。可选地，步骤b)中脱除溶剂的方法为旋转蒸发。可选地，步骤c)中所述水和所述脂质薄膜的混合体积比为2～10:1。可选地，步骤c)中所述搅拌的转速为200～600rpm。可选地，步骤c)中所述搅拌为磁力搅拌。可选地，所述超声的功率为100～300W，频率为10～40Hz，超声时间为10～30min。可选地，所述过滤为微孔过滤，所述微孔过滤的孔径为0.2～0.45μm。可选地，所述微孔过滤的孔径为0.22μm或0.45μm。可选地，制备得到的纳米脂质体组合物在低温下保存。可选地，所述低温为0～5℃的温度范围。可选地，所述低温为4℃。本发明采用薄膜分散-磁力搅拌法制备纳米脂质体组合物，能够较大的增加蒙花苷的水中溶解度，提高生物利用度。作为一种实施方式，纳米脂质体组合物的制备方法包括步骤：a)称取蒙花苷提取物0.01～1.00mg、胆固醇8.00～15.00mg、卵磷脂25.00～35.00mg于50mL茄形瓶中，加入10mL无水乙醇溶解，获得溶液；b)在45℃水浴下，将上述溶液置于旋转蒸发仪上旋蒸，无水乙醇完全回收后，茄形瓶内壁上形成一层乳白色均匀薄膜；c)向上述均匀薄膜中加入超纯水10mL，在40℃～60℃水浴下加热搅拌或水浴加热超声，均匀混合后，得乳白色均匀混悬液，过0.45m微孔滤膜，获得纳米脂质体组合物；d)4℃下保存、备用。根据本发明的另一目的，提供了包括上述任一纳米脂质体组合物的滴眼剂。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的纳米脂质体组合物，提高了蒙花苷的溶解度和稳定性，能够达到较高的抗炎浓度，大大改善了蒙花苷的生物利用度。(2)本发明提供的纳米脂质体组合物，载药性能好，包封率高，可以用作眼用药物，如滴眼剂。(3)本发明提供的纳米脂质体组合物的制备方法，操作简单高效、周期短，溶剂利用量少且能够循环利用，同时能够有效避免制备过程对活性成分化合物结构的破坏。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明一种实施方式中纳米脂质体组合物的粒径表征结果；图2为本发明一种实施方式中纳米脂质体组合物的电位图；图3为本发明一种实施方式中纳米脂质体组合物的透射电镜照片；图4为本发明一种实施方式中制备得到的纳米脂质体组合物中蒙花苷与纯蒙花苷的体外释放性能的比较结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1纳米脂质体组合物的制备1#纳米脂质体组合物a)称取蒙花苷提取物1.00mg、胆固醇8.00mg、卵磷脂35.00mg于50mL茄形瓶中，加入10mL无水乙醇溶解，获得溶液；b)在45℃水浴下，将上述溶液置于旋转蒸发仪上旋蒸，无水乙醇完全回收后，茄形瓶内壁上形成一层均匀分布的乳白色脂质薄膜；c)向上述均匀的脂质薄膜中加入超纯水10mL，在40℃水浴下加热搅拌，搅拌速率为500rpm，均匀混合后，得乳白色均匀混悬液，过0.45μm微孔滤膜，获得纳米脂质体组合物；d)4℃下保存、备用。2#纳米脂质体组合物2#纳米脂质体组合物的制备过程与1#纳米脂质体组合物大致相同，不同之处在于：步骤a)中各物质的添加量分别为：蒙花苷提取物0.01mg、胆固醇15.00mg、卵磷脂25.00mg于50mL茄形瓶中，加入10mL无水乙醇溶解，获得溶液；步骤c)中，将“在40℃水浴下加热搅拌”替换为“在60℃水浴下加热超声”，且超声功率为300W，频率为40Hz，超声时间为10min。3#纳米脂质体组合物3#纳米脂质体组合物的制备过程与1#纳米脂质体组合物大致相同，不同之处在于：步骤a)中各物质的添加量分别为：蒙花苷提取物0.8mg、胆固醇10.00mg、卵磷脂30.00mg于50mL茄形瓶中，加入10mL无水乙醇溶解，获得溶液。实验例1纳米脂质体组合物的表征载药量和包封率以实施例1中制备得到的1#～3#纳米脂质体组合物为典型，采用1100LC高效液相法(HPLC)测定其载药量和包封率，测定方法具体为：蒙花苷标准曲线的绘制：取1mg原料药于烧杯中，加入适量甲醇溶解，将溶液移至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，制备成0.1mg/mL的蒙花苷甲醇母液。分别吸取一定量母液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度分别为0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.06mg/mL，0.08mg/mL的标准溶液，用HPLC测定，测定波长为326nm，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制备标准曲线。载药量和包封率的测定方法：准确称取蒙花苷脂质体包溶液适量，加入少量甲醇溶解超声30min，结束后转移至10mL容量瓶中，加入稀释至刻度。以甲醇为空白，在326nm波长处测定包合物的峰面积，根据回归方程得到包合物中蒙花苷的含量，根据公式计算载药量：包封率＝质体中蒙花苷的质量/蒙花苷投入量载药量＝包合物中蒙花苷的质量/包合物的质量经测定和计算，1#纳米脂质体组合物的载药量为0.054mg/mL，包封率为54.491％；2#纳米脂质体组合物的载药量为0.05mg/mL，包封率为51.626％；3#纳米脂质体组合物的载药量为0.051mg/mL，包封率为51.232％。粒径测定以实施例1中制备得到的3#纳米脂质体组合物为典型，取用3份3#纳米脂质体组合物，用超纯水稀释到适当倍数，使用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测定其粒径分布情况，粒径结果及电位图分别如图1和图2所示。由图1可知，3#纳米脂质体组合物的粒径范围在100nm～300nm，平均粒径为151nm，粒径分布(PDI)为0.401。形貌表征以实施例1中制备得到的3#纳米脂质体组合物为典型，肉眼观察蒙花苷脂质体呈乳白色，有白色乳光；采用使用HT7700150kV型透射电镜观察其形貌，由图3的透射电镜照片可以发现，纳米脂质体组合物的形状规整，呈圆形微粒，分布较均匀，颗粒间彼此分散、独立。实验例2纳米脂质体组合物的稳定性将实施例1中制备得到的3#纳米脂质体组合物置于25±2℃的环境中，分别在放置的第0、1、3、5、7、9天的情况下观察其外观，测定粒径、电位，考察制剂的稳定性，结果如表1中所示，由表中数据可知，放置9天后，纳米脂质体组合物在外观上并未发生肉眼可见的变化，仍然保持为乳白色均一溶液，微观粒径和载药量也保持了很好的稳定性。表1纳米脂质体组合物稳定性实验例3蒙花苷的体外释放性能精密称取蒙花苷5mg、纳米脂质体组合物10mg，分别置于含有10mL人工泪液的透析袋中，扎紧透析袋两端，将透析袋置于100mL人工泪液中，在37℃水浴中恒温振荡，在规定时间精密移取5mL外相介质，并同时补充5mL新鲜介质，在326nm处测定样品吸光度，以蒙花苷的累积释放量对时间作曲线图，考察蒙花苷的体外释放性能，结果如图4所示。由图4可知，负载于纳米脂质体组合物中的蒙花苷在8小时内的累积释放率保持在较稳定的水平，而纯蒙花苷的累积释放率则不断增大，说明本发明提供的纳米脂质体组合物能够明显的延缓活性组分蒙花苷的释放，延长蒙花苷的作用时间。实验例4蒙花苷的细胞毒性实验对纳米脂质体组合物的活性成分蒙花苷做细胞毒性实验(CCK-8法)，其实验方法具体包括步骤：a)将巨噬细胞培养至合适的状态，以细胞计数板计数，确定细胞悬液稀释倍数；b)制备细胞悬液，铺于96-孔板中培养24h至细胞贴壁；c)制备5-50μM/L的蒙花苷溶液，每孔加入100μL，放入培养箱培养24h；d)每孔加入10μL的CCK-8液，于培养箱中继续培养4h，于酶标仪检测450nm处的吸光度。吸光度结果如表2中所示：表2不同蒙花苷浓度的吸光度蒙花苷浓度(μM/L)51020304050空白调零吸光度平均值3.1153.2883.4403.2462.3902.0543.2840.160由表2可知，当蒙花苷的浓度大于30μM/L时，已经对细胞产生一定的毒副作用，所以其制备及用药浓度应当不超过20μM/L。实验例5纳米脂质体组合物的抗炎活性以实施例1中制备得到的3#纳米脂质体组合物为典型，研究纳米脂质体组合物的抗炎活性，其实验方法具体包括步骤：a)使用1μg/mL脂多糖(LPS)刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞系，筛选出合适的构建炎症细胞模型的LPS浓度；b)将RAW264.7细胞按细胞数1.5×104/孔接种于96-孔板内，培养24h后，弃去培养液；c)用含LPS的不同浓度蒙花苷药液和纳米脂质体组合物共同刺激24h后，收集细胞上清液进行ELISA实验，测定肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1(IL-1)水平。IL-1、IL-6与TNF-α是体内炎性损伤比较严重的细胞因子之一，由表3中的实验结果分析可知，脂多糖(LPS)可以较好刺激细胞并使细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的分泌水平增加。与LPS对照组比较纳米脂质体组合物在5～20μM时能够显著抑制TNF-α、IL-1、IL-6的分泌。表3抗炎活性实验中蒙花苷吸光度因素LPS组空白组5μM10μM20μM吸光度3.5280.4712.5261.8451.015实验例6纳米脂质体组合物用作滴眼剂兔眼刺激性实验以实施例1中制备得到的3#纳米脂质体组合物用作滴眼剂，进行兔眼的眼部刺激性实验，具体如下：取家兔5只，体重2-3kg，双眼健康，角膜的色泽及血管分布正常。将蒙花苷纳米脂质体组合物的混悬液2滴滴入家兔的一侧眼结膜囊内，另一侧作为空白对照，给药后使眼被动闭合1min～2min，记录给药后1h、2h、4h、6h、8h、24h的眼局部反应情况，用荧光素钠检查兔眼角膜损害情况，用裂隙灯检查角膜、虹膜、巩膜、结膜及是否有分泌物生产。采用Draize眼部刺激试验进行刺激性评分。刺激性判断标准：无刺激性，平均积分0-3；轻度刺激性4-7分；中度刺激性8-12分；13-16分为重度刺激性。实验结果列于表4中。表4兔眼刺激性实验中，滴入纳米脂质体组合物的眼部刺激分值时间(h)眼部刺激分值总和1122416381243由表4中结果可知，本发明提供的蒙花苷纳米脂质体组合物用作滴眼剂，使用后无明显的充血、流泪、羞明等刺激性症状出现，亦无局部吸收的全身反应出现，刺激程度属无刺激性。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页1 2 3