面颈部美容制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医学美容领域，具体涉及一种面颈部美容制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

自古以来，人们一直渴望“容颜永驻”、“青春不老。”尝试应用各种方法或手段使自己看起来年轻。随着现代医学和生物科技的发展，面部年轻化这一理念上升到科学的高度，其涉及到的学科和技术领域也不断在拓展。

面部年轻化是指使老化的面部恢复年轻化外貌。面部老化的表现具体而言，是指肤色：肤色暗沉不均匀；质地：粗糙皱纹不平整；容积：松弛凹陷不紧致。面部年轻化主要是针对上述的表现去解决面部衰老。使面部年轻化手术和非手术的手段和方法很多。人们常常沉醉在自己面部皮肤的保养，而忽视颈部肌肤的年轻化。如果一个人拥有较年轻的面部肌肤，又有一个“火鸡颈”，想必面部年轻态也会大打折扣。

PRP是通过离心自体全血而得到的高浓度血小板血浆。其中富含多种生长因子。如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等。它的血浆成分中存在三种蛋白质：纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白，为皮肤的修护提供了良好的3D立体结构支架，还可以收紧松弛的皮肤。这些生长因子对促进细胞的增殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和沉降及组织的形成有着极其重要的作用，并且生长因子之间有良好的协同作用。

中国专利CN104906052A公开了一种自体来源富血小板血浆冻干粉的制备方法。该专利通过高浓度PRP的制备、PRP血小板部分冻干粉的制备、PRP血浆部分冻干粉及氯化钙激活PRP冻干粉的制备，使病人抽一次血就可以多次使用自体来源的PRP及细胞因子冻干粉。但是每次使用的PRP的浓度还是不高、并且没有完全定量，每次疗效得不到均一保障。中国专利CN106491544 A公开了富血小板血浆冻干粉及制法和用途。该专利制备富血小板血浆采用的是离心管，如果志愿者的采血量大的话需使用多个离心管，这样会造成富血小板血浆在离心分离时的损失。

综上所述，亟需一种非手术安全有效的面颈部年轻化美容制剂。通过一次采血就可以进行多次使用，每次使用浓度高、精准定量、效果均一。制备过程简单、易操作、回收率高。产品由权威第三方检测、把控，质量保障。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种面颈部美容制剂及其制备方法和应用，克服现有技术的缺陷。

本发明所采用的技术方案为：

面颈部美容制剂的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤一：将采集的新鲜全血从釆血袋转移至离血袋中，多次离心，获得富血小板血浆；

步骤二：在富血小板血浆中添加含有海藻糖和人血白蛋白的冷冻保护剂，并在恒温摇床中反应，之后将富血小板血浆和冷冻保护剂的混合液分装至多支西林瓶中，然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜，即进行预冻处理，再放入冻干机中冻干，得到冻干粉，即面颈部美容制剂。

步骤一中，多次离心过程具体为：

第一次离心的转数为2000-2500rpm，温度为20-24℃，时间为1-5min；

第二次及后续多次离心的转数为3600-4000rpm，温度为20-24℃，时间为3-6min；

离心的次数至多4次。

步骤二中，冷冻保护剂中海藻糖的含量为45~55mM，人血白蛋白含量为3~8%；

海藻糖和人血白蛋白混合到0.9%的氯化钠注射液中形成冷冻保护剂。

步骤二中，恒温摇床反应的温度为20~25℃，时间为20~40min。

步骤二中，添加冷冻保护剂的富血小板血浆中，血小板含量达到10亿/mL。

步骤二中，富血小板血浆和冷冻保护剂混合液为14mL，分装至7支西林瓶中，每支2mL。

步骤二中，西林瓶放入超低温冰箱中过夜为预冻处理，超低温冰箱的温度设定为-80℃，西林瓶放入超低温冰箱过夜的时间超过12h。

如所述的制备方法制得的面颈部美容制剂。

如所述的面颈部美容制剂的应用，其特征在于：

所述制剂应用于医学美容。

所述制剂的使用方法包括以下步骤：

步骤一：对面颈部皮肤进行清洁和消毒；

步骤二：用0.9%的氯化钠注射液与冻干粉充分混匀后，采用促渗仪器导入至面颈部；完成后用温开水或0.9%的氯化钠注射液将面颈部残留液体擦拭干净；

步骤三：贴敷面膜和颈膜对面颈部进行保湿；

步骤四：使用成品仪器的蓝光冰导探头配合介质对面颈部皮肤进行镇静；

步骤五：使用防晒乳或防晒霜或防晒喷雾进行防晒。

本发明具有以下优点：

本发明可制备获得高浓度血小板血浆，再采用海藻糖和人血白蛋白作为血小板的冻干保护剂，对细胞膜在降温和干燥过程中进行保护，防止血小板的聚集。通过一次采血就可以进行多次使用，每次使用的浓度高、精准定量、效果均一有保障；制备过程简单、易操作、回收率高。

制剂中含有多种高浓度的生长因子，由于制剂来源于自体全血，各生长因子的比例和体内正常比例几乎一致，使生长因子之间有最佳的协同作用，并且不会出现外源性生长因子的免疫排斥，也不会出现异体移植中存在的疾病传播的风险。含有的大量的细胞粘合蛋白、纤维素、纤粘连蛋白和亲玻粘连蛋白，为皮肤修护提供了良好的3D立体支架结构。

本发明来源无传染性疾病，在生产制备过程中坚持每次只处理一个样品，能够有效防止交叉感染。制备过程采用离血袋而非离心管，能过减少富血小板血浆在离心分离过程中的损失，提高回收率。

每瓶FDP都精准定量为2B（即二十亿），有效性能够得到均一保障。产品最终由权威第三方检测、把控，质量得到保障。

附图说明

图1为志愿者1做完三次和三个月后皮肤状态对比图（毛孔）。

图2为志愿者1做完三次和三个月后皮肤状态对比图（皱纹）。

图3为志愿者2做完三次和五个月后皮肤状态对比图（毛孔）。

图4为志愿者2做完三次和五个月后皮肤状态对比图（皱纹）。

图5为志愿者2做完三次和五个月后皮肤状态对比图（斑点）。

图6为志愿者2做完三次和五个月后皮肤状态对比图（紫外线照射下）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种面颈部美容制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将采集的新鲜全血从釆血袋转移至离血袋中，同时取适量用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程对照、监控（例如约0.5mL，例如约0.1mL）；多次离心，获得富血小板血浆。

多次离心过程具体为：

第一次离心的转数为2000-2500rpm，例如2200-2300rpm，例如2250rpm，温度为20-24℃，例如20-22℃，例如20℃，时间为1-5min，例如1-3min，例如3min；离心完后将血袋在等离子提取器中静置10-30min，以让红细胞更好地沉降。使用注射器抽出贫血小板血浆层，标记该注射器并放在一边。使用新的注射器，取出含有富血小板血浆的中间层，将富血小板血浆混合到一个新的离心袋内；

第二次及后续多次离心的转数为3600-4000rpm，例如3700-3900rpm，例如3880rpm，温度为20-24℃，例如20-22℃，例如20℃，时间为3-6min，例如4min；每次离心完后，都需将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。

如果血小板数量达到10亿（±1000百万血小板），则停止离心；如未达到，则继续离心。离心的次数至多4次，每次离心后均需取适量用于测定其中血液中血小板的数量，以便判断离心是否结束。

采血前需对使用者进行体检，体检包括输血前四项的检测，梅毒、艾滋、乙肝两对半及丙肝，还包括血压和血红蛋白的检测。若输血前四项不合格，不能进行治疗。若血压或血红蛋白不合格，待恢复正常后再进行治疗。正式采血前一周注意饮食清淡和睡眠充足。

步骤二：在富血小板血浆中添加含有海藻糖和人血白蛋白的冷冻保护剂，并在恒温摇床中反应，之后将富血小板血浆和冷冻保护剂的混合液分装至多支西林瓶中，然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜，再放入冻干机中冻干，得到冻干粉，即面颈部美容制剂。

步骤二中：

冷冻保护剂中海藻糖的含量为45~55mM，优选50mM，人血白蛋白含量为3~8%，优选5%；海藻糖和人血白蛋白混合到0.9%的氯化钠注射液中形成冷冻保护剂。

恒温摇床反应的温度为20~25℃，优选20℃，时间为20~40min，优选30min；

将富血小板血浆和冷冻保护剂混合液14mL（血小板含量达到10亿/mL）分装至7支西林瓶中，每瓶2mL（每支血小板含量为20亿，即2billions简称2B），然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜，再放入冻干机中冻干，得到最终产品，室温下真空保存。西林瓶放入超低温冰箱中过夜为预冻处理，超低温冰箱的温度设定为-80℃，西林瓶放入超低温冰箱过夜的时间超过12h。

用11-15mL 0.9%的氯化钠注射液作为溶媒，对最终产品进行第三方无菌检测，保证产品的高质量。第三方无菌检测包括对真菌的培养，对厌氧细菌的培养，还包括对需氧细菌的培养。

以下为制备方法的具体实施例：

实施例1：冻干粉的制备（一）

1. 采血前的准备

志愿者正式治疗之前须接受输血前四项（乙肝、丙肝、梅毒、艾滋）的检测，测量血压和血红蛋白。若输血前四项不合格，不能进行治疗。若血压或血红蛋白不合格，待恢复正常后再进行治疗。正式采血前一周注意饮食清淡和睡眠充足。

2.高浓度的血小板血浆的制备

① 称量采血袋并记录其重量，接着将抗凝全血转移至离血袋中，取0.3mL血液进行血小板计数，得到血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

② 将离心袋放入离心机吊篮中，以2250rpm，在20℃时离心3min。离心完后将血袋在等离子提取器中静置20min，以让红细胞更好地沉降。使用注射器抽出贫血小板血浆层，标记该注射器并放在一边。使用新的注射器，取出含有富血小板血浆的中间层，将富血小板血浆混合到一个新的离心袋内，同时取出0.3mL用于测定其中血小板的数量。

③ 再次将离心血袋放入离心机吊篮中，以3880rpm，在20℃，离心4min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出测定其中血液中血小板的数量，如果血小板数量达到10亿（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤④。

④ 将离血袋放入离心机吊篮中以3880rpm，在20℃，离心4min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.3mL，测定其中血小板的数量。如果血小板数量达到10亿/mL（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤⑤。

⑤ 将离血袋放入离心机吊篮中以3880rpm，在20℃，离心4min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.3mL，测定其血小板的数量。每个志愿者血液样品最多离心4次。

3.冻干粉的制备

将步骤2制备的高浓度血小板血浆用含有50mM海藻糖和5%的人血清白蛋白的冷冻保护液在25℃的恒温摇床中反应30min后，将富血小板血浆和冷冻保护剂混合液14mL（血小板含量达到10亿/mL）分装至7支西林瓶中，每瓶2mL（每支血小板含量为20亿，即2billions简称2B），然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜（超低温冰箱的温度设定为-80℃，西林瓶放入超低温冰箱过夜的时间超过12h），再放入冻干机中冻干，得到最终产品。

4.冻干粉的检测

用11mL 0.9%的氯化钠注射液作为溶媒与冻干粉混溶，送往第三方做真菌培养、需氧细菌培养、厌氧细菌培养，以确保产品无菌。

实施例2：冻干粉的制备：

1. 采血前的准备

同实施例1。

2.高浓度的血小板血浆的制备

① 称量采血袋并记录其重量，接着将抗凝全血转移至离血袋中，取0.2mL血液进行血小板计数，得到血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

② 将离心袋放入离心机吊篮中，以2000rpm，在22℃时离心1min。离心完后将血袋在等离子提取器中静置10min，以让红细胞更好地沉降。使用注射器抽出贫血小板血浆层，标记该注射器并放在一边。使用新的注射器，取出含有富血小板血浆的中间层，将富血小板血浆混合到一个新的离心袋内，同时取出0.2mL用于测定其中血小板的数量。

③ 再次将离心血袋放入离心机吊篮中，以3600rpm，在22℃，离心3min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出测定其中血液中血小板的数量，如果血小板数量达到10亿（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤④。

④ 将离血袋放入离心机吊篮中以3600rpm，在22℃，离心3min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.2mL，测定其中血小板的数量。如果血小板数量达到10亿/mL（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤⑤。

⑤ 将离血袋放入离心机吊篮中以3600rpm，在22℃，离心3min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.2mL，测定其血小板的数量。每个志愿者血液样品最多离心4次。

3.冻干粉的制备

将步骤2制备的高浓度血小板血浆用含有45mM海藻糖和3%的人血清白蛋白的冷冻保护液在20℃的恒温摇床中反应20min后，将富血小板血浆和冷冻保护剂混合液14mL（血小板含量达到10亿/mL）分装至7支西林瓶中，每瓶2mL（每支血小板含量为20亿，即2billions简称2B），然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜（超低温冰箱的温度设定为-80℃，西林瓶放入超低温冰箱过夜的时间超过12h），再放入冻干机中冻干，得到最终产品。

4.冻干粉的检测

用12mL 0.9%的氯化钠注射液作为溶媒与冻干粉混溶，送往第三方做真菌培养、需氧细菌培养、厌氧细菌培养，以确保产品无菌。

实施例3：冻干粉的制备（三）

1. 采血前的准备

同实施例2。

2. 高浓度的血小板血浆的制备

① 称量采血袋并记录其重量，接着将抗凝全血转移至离血袋中，取0.5mL血液进行血小板计数，得到血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。

② 将离心袋放入离心机吊篮中，以2500rpm，在24℃时离心5min。离心完后将血袋在等离子提取器中静置30min，以让红细胞更好地沉降。使用注射器抽出贫血小板血浆层，标记该注射器并放在一边。使用新的注射器，取出含有富血小板血浆的中间层，将富血小板血浆混合到一个新的离心袋内，同时取出0.5mL用于测定其中血小板的数量。

③ 再次将离心血袋放入离心机吊篮中，以4000rpm，在24℃，离心5min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出测定其中血液中血小板的数量，如果血小板数量达到10亿（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤④。

④ 将离血袋放入离心机吊篮中以4000rpm，在24℃，离心5min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.5mL，测定其中血小板的数量。如果血小板数量达到10亿/mL（±1000百万血小板），则进入步骤3。如未达到，则继续离心，进入步骤⑤。

⑤ 将离血袋放入离心机吊篮中以4000rpm，在24℃，离心5min。离心完后，将血袋放在等离子提取器中静置。用注射器抽取出含有贫血小板血浆的上层。在血袋的注射器端口取出0.5mL，测定其血小板的数量。每个志愿者血液样品最多离心4次。

3.冻干粉的制备

将步骤2制备的高浓度血小板血浆用含有55mM海藻糖和3%的人血清白蛋白的冷冻保护液在22℃的恒温摇床中反应20min后，将富血小板血浆和冷冻保护剂混合液14mL（血小板含量达到10亿/mL）分装至7支西林瓶中，每瓶2mL（每支血小板含量为20亿，即2billions简称2B），然后将西林瓶放入超低温冰箱中过夜（超低温冰箱的温度设定为-80℃，西林瓶放入超低温冰箱过夜的时间超过12h），再放入冻干机中冻干，得到最终产品。

4.冻干粉的检测

用15mL 0.9%的氯化钠注射液作为溶媒与冻干粉混溶，送往第三方做真菌培养、需氧细菌培养、厌氧细菌培养，以确保产品无菌。

本发明制备的美容制剂富含多种生长因子，这些生长因子对促进细胞的增殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和沉降及组织的形成有着极其重要的作用，并且生长因子之间有良好的协同作用。另外，冻干粉中存在三种蛋白质：纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白，为皮肤的修护提供了良好的3D立体结构支架，还可以收紧松弛的皮肤。

上述面颈部美容制剂的应用包括面颈部皮肤的保湿、镇静、营养和防晒。使用前需对面颈部进行清洁和消毒，清洁可以使用洗面奶、洁面泡沫、洁面慕斯、卸妆水、卸妆油、卸妆膏、卸妆棉签等，消毒可以使用75%的酒精或碘伏。

具体使用过程如下：

步骤一：未化妆的使用者使用洗面奶或洁面膏或洁面泡沫或洁面慕斯对面颈部皮肤进行清洁；化妆的使用者使用卸妆水或卸妆油或卸妆膏或卸妆棉签等进行面颈部皮肤清洁。采用75%的酒精或碘伏对志愿者面颈部皮肤消毒1~3遍。

步骤二：用0.9%的氯化钠注射液与冻干粉充分混匀后，采用促渗仪器导入至面颈部。完成后用温开水或0.9%的氯化钠注射液将面颈部残留液体擦拭干净。

步骤三：贴敷面膜和颈膜对面颈部进行保湿。

步骤四：使用成品仪器的蓝光冰导探头配合介质对面颈部皮肤进行镇静。

步骤五：室内使用SPF15~30的防晒乳或防晒霜或防晒喷雾进行防晒。户外使用SPF50的防晒乳或防晒霜或防晒喷雾进行防晒。

以下为使用方法的具体实施例：

选取2名年龄分别为34、36岁志愿者，将合格终产品7瓶中5瓶供志愿者使用，前3个月每个月1瓶，后面间隔2~3个月1瓶，1瓶留样、1瓶送检。

将FDP-2B通过促渗仪器导入至面颈部，具体步骤如下：

1. 面颈部皮肤清洁和消毒

未化妆的志愿者使用洗面奶或洁面膏或洁面泡沫或洁面慕斯对面颈部皮肤进行清洁；化妆的志愿者使用卸妆水或卸妆油或卸妆膏或卸妆棉签等进行面颈部皮肤清洁。采用75%的酒精对志愿者面颈部皮肤消毒3遍。

2. 面颈部导入冻干粉

用0.9%的氯化钠注射液与冻干粉充分混匀后，采用促渗仪器导入至面颈部。完成后用0.9%的氯化钠注射液将面颈部残留产品擦拭干净。

3. 面颈部保湿

贴敷面膜和颈膜。

4. 面颈部皮肤的镇静

使用成品仪器的蓝光冰导探头配合介质对面颈部皮肤进行镇静。

5. 面颈部营养

面颈部涂抹护肤液或乳或膏霜。

6. 面颈部防晒

室内使用SPF15~30的防晒乳或防晒霜或防晒喷雾进行防晒。户外使用SPF50的防晒乳或防晒霜或防晒喷雾进行防晒。

示例性的，本发明实施例进行了使用前后的两名志愿者个对比。

志愿者1做完三次，三个月后皮肤状态如图1、图2所示：

图1毛孔：

T区分别由42%下降为38%，25%下降为22%；

U区分别为19%下降为14%，22%下降为15%；

平均值从27%下降为22%。

由此可见，FDP-2B有收缩毛孔的作用。

图2皱纹：

眼底左侧由5%下降为3%；眼周右侧为2%下降为1%；平均值从3%下降为2%。

由此可见：FDP-2B有祛除皱纹的功效。

志愿者2做完三次，五个月后皮肤状态如下：

图3毛孔：

T区由53%下降为50%，36%下降为35%；

U区由41%下降为40%，47%下降为44%；

平均值从44%下降为42%。

由此可见，FDP-2B有收缩毛孔的作用。

图4皱纹：

右侧眼底由6%下降为4%，7%下降为6%;

眼周从4%下降为2%；

平均值由5%下降为4%。

由此可见：FDP-2B有祛除皱纹的功效。

图5斑点：

T区由16%下降为13%，15%下降为13%；

U区由16%下降为15%，20%下降为17%；

眼底右侧由8%下降为6%；

平均值从12%下降为11%。

由此可见，FDP-2B能够很好抑制斑点的形成并淡化、祛除斑点。

图6紫外线照射下（卟啉反应）：

皮脂分泌量T区由788eu下降为413eu，348eu下降为98eu；

U区由175eu下降为127eu，153eu下降为121eu；

平均值由366eu下降为190eu。

由此可见，FDP-2B对于油脂的分泌有很好地控制作用，对于痘痘肌肤有很好的疗效。

综上所述，本发明富含多种生长因子：如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等。它的血浆成分中存在三种蛋白质：纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白，为皮肤的修护提供了良好的3D立体结构支架，还可以收紧松弛的皮肤。这些生长因子对促进细胞的增殖和分化、增加胶原合成能力，促进基质合成和沉降及组织的形成有着极其重要的作用，并且生长因子之间有良好的协同作用，能够祛除皱纹、控制油脂分泌、收缩毛孔、淡化甚至抑制斑点地形成使用完本发明后，整个面颈部皮肤呈现的状态比之前年轻很多。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。