抗凝血剂、凝血改善装置、凝血改善方法、血管内皮细胞功能改善方法和代谢改善方法与流程

本发明涉及包含氢气或包含含有氢气的混合气体或包含含有氢分子的水的抗凝血剂、凝血改善装置、凝血改善方法、血管内皮细胞功能改善方法和代谢改善方法。

背景技术：

已知氢分子具有对活性氧的清除功能，氢的生命功能改善作用也被认为是以清除功能为中心的。

作为摄取为气态分子的氢的方法，通常使氢分子包含在水等适合生物体的液体中来饮用，但除此以外还有如下方法：吸入含有氢分子的气体、使用含有氢分子的液体而能直接供给电子的点滴、经皮吸收等。

近些年，氢的生命功能改善作用越来越受到注目，尤其对于人和宠物的健康而言逐渐变得不可缺少。然而，迄今为止，氢的生命作用基本上是通过清除功能、即向羟基自由基和过氧亚硝基等反应性极高的活性氧供给电子来阐释的(例如，非专利文献1、2)。在该范围中，只能说明氢分子的一部分生命作用，而这又最终限制了氢分子的应用、或使在理解其生命作用这样重要的方面受损。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：vascularhealthandriskmanagement、2014,10，591-597

非专利文献2：currentpharmaceuticaldesign、2013、19、6375-6381

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供：在医学·医疗·健康产业·农业·畜牧业·水产业的各领域中，用于使氢分子改善生命功能的、除了对活性氧的清除功能以外的方法、即线粒体的功能改善和利用了该方法的抗凝血剂、凝血改善装置、凝血改善方法、血管内皮细胞功能改善方法和代谢改善方法。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：氢具有除了对活性氧的清除功能以外的功能，以至完成了本发明。

由脑梗塞、心肌梗塞引起的损伤虽危及生命，但逐渐清楚了若那时对缺血状态的线粒体进行再灌注的同时供给氧，则会爆发性地产生活性氧，导致预后的恶化。认为：在分子水平上，对于原本在线粒体的呼吸链中电子沿正向从复合物i传递至iv的流动而言，例如在缺血状态下的再灌注时发生的ret(反向电子传递：reverseelectrontransport)中，电子逆流至复合物i，由此爆发性地产生活性氧。本发明人等发现：氢能够作用于线粒体、特别是电子传递系统而抑制该现象。

氢分子非常稳定，分子在生物体内的通常的状态下不会解离，但根据本发明人等的发现，尤其在线粒体的复合物i和iii中，氢分子解离成电子和质子，由此对由于逆流或停滞而成为活性氧的产生源的电子流动提供整流作用。

另外获知：由氢带来的线粒体的电子流动的整流作用抑制活性氧的产生的结果是，改善生物体的血管内皮细胞功能。

进而，本发明人等发现：若对生物体给予氢，则能够增强线粒体的氢化酶活性、以及能够改善生物体的凝血性，以至完成了本发明。

进而，本发明人等发现：若对生物体给予氢，则引起线粒体的解偶联(uncoupling)，作为结果，可以带来体温上升等代谢改善作用，以至完成了本发明。

本发明为以下的[1]～[10]。

[1]一种抗凝血剂，其特征在于，包含氢气或含有氢气的混合气体。

[2]一种抗凝血剂，其特征在于，包含含有氢分子的水。

[3]根据[1]或[2]的抗凝血剂，其中，氢分子通过增强线粒体的氢化酶活性来改善凝血。

[4]一种凝血改善装置，其特征在于，向对象供给氢气或含有氢气的混合气体。

[5]根据[4]的凝血改善装置，其中，氢分子通过增强线粒体的氢化酶活性来改善凝血。

[6]一种凝血改善方法，其特征在于，具备向对象给予含有氢分子的水或氢气的工序。

[7]一种血管内皮细胞功能改善方法，其特征在于，具备向对象给予含有氢分子的水或氢气的工序。

[8]根据[7]的血管内皮细胞功能改善方法，其中，氢分子通过介由线粒体中的电子的整流作用来抑制活性氧的产生，从而改善血管内皮细胞功能。

[9]一种线粒体的保护方法，其中，氢分子通过介由线粒体中的电子的整流作用来抑制活性氧产生，改善线粒体的功能或保护线粒体。

[10]一种代谢改善方法，其具备向对象给予氢分子的工序，氢分子在对象内通过对线粒体的解偶联作用来降低线粒体膜电位。

发明的效果

氢是在地球上不存在氧的太古时支撑生命能量的供电子分子，通过担负氢离子还原和氢分子氧化而使原始生命得以进化的氢化酶与线粒体呼吸链中的复合物i在进化上相关联，是一种能源。可认为，由氢带来的线粒体氢化酶活性的增强作用与如下作用相关联：在包括人在内的特别是高等生物中，对于作为其生命功能的根源的细胞呼吸的功能障碍、线粒体在病理状态下的电子的逆流、泄漏(electronleakage)、特别是ret(反向电子传递：reverseelectrontransport)而言，通过使氢分子在线粒体内解离成电子和质子而发挥整流作用，由此有助于健康。

本发明的由氢分子带来的、氢分子在线粒体的电子传递系统中的整流作用、氢化酶活性的增强作用、凝血的改善作用和利用了该方法的血管内皮细胞功能改善剂、凝血改善剂、装置，是通过以往已阐释的、氢分子作为活性氧清除剂的功能所无法阐明的新的作用/用途。

本发明及成为其背景的新见解可以更清楚地阐明由摄取氢带来的生物体作用，能够有助于新的氢摄取方法等。更重要的是，由此，对于一直以来难以从细胞外进行控制的线粒体所担负的电子传递功能这样的构成生命的能量代谢根源的部分而言，还有助于发现用于使该病理状态健康化的药物，产业上的有效性不可估量。

本发明作为没有副作用的医疗或健康增进方法是极其有效的，为将来的药物发现提供基本信息，不仅在健康方面有利，在产业上的有效性也是不可估量的。

附图说明

图1是表示实施例8的结果的图。

具体实施方式

本发明的抗凝血剂包含：气态的氢分子(氢气)或含有其的混合气体、或含有氢气的水。

氢气或含有氢气的混合气体的情况，可以使用现有公知的氢气供给装置对对象者(或动物)给予氢气。给予具体而言有吸入含有氢分子的气体、经皮吸收等。关于氢气的给予量，每1kg的生物体每天优选为70～350mg，更优选为100～200mg。混合气体的情况，只要对生物体无害，除氢气以外的含有气体就没有特别限定，例如可列举出氧气、大气等。在深海潜水中，自1990年以来已经实际使用了氢气与氦气、氧气的混合气体。

含有氢气的水可以通过直接供于饮用而向生物体给予。水中含有氢气时，含有浓度没有特别限定，优选为1.6ppm～8ppm，更优选为7ppm～8ppm。

另外，含有氢气的水还可以包含盐、营养成分等即使向生物体给予也无毒的现有公知的成分。

本发明的抗凝血剂能够减少血管性血友病(vonwillebrand)因子活性。血管性血友病因子(vwf)是由血管内皮细胞、骨髄巨核细胞产生的高分子量的糖蛋白，其形成多聚体结构，分子量从约500kda至大到20000kda。vwf是在初级凝血(primaryhemostasis)中发挥重要作用的因子，具有在血管的损伤部位将血小板粘附于皮下结缔组织的功能。vwf以多聚体的形式存在，且大小各种各种，但多聚体的分子量越高，则止血能力越高。另外vwf还具有与凝血因子viii(fviii)结合而使血浆中的fviii稳定化的功能。降低vwf因子活性意味着不易使血液凝固。

另外，本发明的抗凝血剂能够延长血液的凝血酶原时间。凝血酶原是凝血因子中的第ii因子，当加入促凝血酶原激酶这一物质时会发生凝固。因此将测定在血浆中加入促凝血酶原激酶至发生凝固为止的时间定义为凝血酶原时间。另外，本发明的抗凝血剂能够延长血液的部分促凝血酶原激酶时间(partialthromboplastintime)。部分促凝血酶原激酶时间是测定内源性系统的凝血能力的检查。凝血的过程有被称为内源性系统的路径和被称为外源性系统的路径，各自涉及多种凝血因子。

本发明的抗凝血剂还可以期待通过抑制血液的凝固来预防脑梗塞、心肌梗塞等栓塞症、血栓症、动脉硬化之类的疾病的发生。

本发明的抗凝血剂优选通过增强线粒体的氢化酶活性来改善凝血。

本发明的凝血改善装置的特征在于，向对象供给氢气或含有其的混合气体，只要能向对象(人、动物)供给氢气或含有其的混合气体，其构成就没有特别限定，可以使用现有公知的医疗用氢气(氢混合气体)供给装置。作为现有公知的医疗用氢气(氢气混合气体)供给装置，例如可列举出ecomointernational公司的氢气发生装置。

另外，本发明的凝血方法的特征在于，具备向对象给予含有氢分子的水或氢气的工序。

本发明的血管内皮细胞功能改善方法具备向对象(是指人或动物。)供给氢气的工序，氢分子通过介由线粒体中的电子的整流作用来抑制活性氧的产生、从而改善血管内皮细胞功能或保护线粒体。血管内皮细胞功能的改善可以通过reactivehyperemiaindex(反应性充血指数、rhi)进行评价。rhi反映出血流介导的血管扩张功能。即，通过氢分子可发挥线粒体的电子的整流作用效果，使血管扩张、血流量增大。

线粒体是如下能量转换装置：其将来自食物的能量主要转化为nadh或fadh2的形式，其中将从nadh获取的电子借助包括复合物i在内的电子传递系统传递至氧并还原为水，同时夹持膜而形成质子的浓度梯度，由此来驱动atp合成装置(复合物v)。

从nadh到氧的电子流动是正常呼吸中的正向电子传输(forwardelectrontransport(fet))，但细胞因血流不足、缺血等而陷入低氧状态(hypoxia)时，例如琥珀酸等会上升，在复合物ii中由醌(q：人的情况为q10)还原的醌醇(qh2)逆流至复合物i，相反在复合物i中nad+被还原为nadh(反向电子传递，reverseelectrontransport(ret))。由于该电子流动而使比通常更多的电子泄漏(electronleakage)，例如在进行再灌注时，若供给大量的氧，则氧因泄漏的电子而以非酶的方式被还原一个电子，产生大量超氧化物，其结果因所生产的过氧化氢(h2o2)、羟基自由基而引起细胞、组织障碍。

在对血管功能极为重要的血管内皮细胞中，若上述活性氧过多，则基于一氧化氮(no)的正常的血管扩张作用受到阻碍，成为在众多生活习惯疾病中起到核心作用的血管内皮细胞功能障碍的主要原因。

本发明中，例如，使用了氢气(h2)，但氢气仅由电子和质子构成，只要质子能在线粒体的电子传递系统中解离而供给质子和电子，则在电子传递系统中供给以往未知的电子的流动。特别是复合物i是由以氢作为供电子源的氢化酶进化而来的，特别是处于其活性中心的结构在进化中被很好地保留。关于氢能否针对在缺血状态下成为问题的上述ret或fet中的超氧化物的产生而改变电子流动(即发挥整流作用)、从而改善病理性活性氧过量状态这一点，在以下的实验中能够作为实施例而获得。

这意味着能够与氢同样地适宜提供电子和质子这两者的分子能够作为在线粒体的电子传递系统中具有优异的整流功能的分子而有益于健康。

实施例

以下通过实施例对本发明进行详细地说明。

[实施例1]

对于每天饮用1瓶(约500ml)7ppm氢水(ecomointernational公司)、共饮用4周的成人，在4周后依据公知的方法测定了该成人的血管性血友病因子活性、pt(凝血酶原时间)和ptt(部分促凝血酶原激酶时间)。

其结果，在开始饮用氢水4周后，血管性血友病因子活性减少约7％，pt(凝血酶原时间)延长约4％、ptt(部分促凝血酶原激酶时间)延长约5％。在饮用前后，该成年男性的血管性血友病因子活性、pt(凝血酶原时间)和ptt(部分促凝血酶原激酶时间)均在正常值范围内。

[实施例2]

利用从人培养细胞中提取的线粒体，研究了氢对nadh的氧化或nad+的还原所产生的影响。作为观察ret的条件，将1mmnad+和10mm琥珀酸作为底物，在缓冲液(50mm磷酸(ph7.5)、1mmedta、0.2mmq10(泛醌10)0.1mg/ml牛血清白蛋白(bsa、不包含脂肪酸)内以30℃反应25分钟，测定了nadh浓度(每分钟的平均值)。

在没有氢的情况下检测出306pmol/ml的nadh，但在氢(约25μm)的存在下，nadh浓度减少至165pmol/ml，即nadh被氧化。

这意味着氢在ret的条件下使电子的流动倾向于fet。

[实施例3]

除了上述实施例2的实验条件之外，将作为复合物iii的抑制剂的嗜球果伞素b添加至实验体系中，在抑制了由复合物iii产生的活性氧的基础上，测定了来自复合物i的活性氧(在超氧化物歧化酶(sod)的存在下将超氧化物转化为h2o2，以h2o2的形式测定)，结果不存在氢的情况下为16.4μm，而在氢的存在下减少至约12分之一的1.36μm。

这意味着在引起ret的条件下，氢抑制活性氧的产生，且使电子流动移动至fet侧。

[实施例4]

为了与电子流动分开地对活性氧的产生进行进一步观察，使用作为复合物i的抑制剂且为水溶性的醌的q1来代替作为原本的电子传递体的q10(为脂溶性，在为脂质的线粒体膜内移动，作为电子传递系统中的电子和质子的载体发挥作用)，除此以外设为与上述实施例2同样的条件。其结果，不存在氢的情况下为10μm的h2o2，在氢的存在下变为195μm。与在上述q10的存在下的实验相反，h2o2上升至约20倍。

可认为这是因为：由解离的氢分子提供的电子在作为复合物iii的主要活性氧产生位点即qo位点使氧还原一个电子而产生超氧化物，以及在复合物i的醌结合位点，为电子受体但被完全还原而无法向膜内移动的水溶性的q1成为半醌自由基从而产生超氧化物。由该情况启示了：实际上氢在复合物i的醌结合位点或复合物iii的醌结合位点(qo)解离并释放出电子。相反存在q10等生理上在线粒体中接受电子的分子作为电子载体时，意味着氢是不产生活性氧的电子供体。

[实施例5]

进而，使用细胞渗透性阳离子荧光色素-四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamineethylester：tmre)，观察了氢对线粒体的膜电位产生的影响，结果表示膜电位的tmre的信号在氢分子的存在下降低约10％(引起了解偶联)。可认为这是因为：通过由在复合物i或复合物iii中解离的氢分子释放出的氧化还原能量，夹持膜的质子的浓度梯度发生了变化。

对于每天饮用2瓶(约500ml)7ppm氢水(ecomointernational公司)、共饮用约6个月的成人，在6个月后测量了体温，结果与饮用前相比基础体温在正常范围内上升约0.5℃。可认为这是由上述氢分子对脂肪细胞线粒体的解偶联作用所引起的。

这意味着膜电位的解偶联作用，意味着氢带来与在代谢改善中发挥重要作用的解偶联蛋白(uncouplingprotein)近似的作用。最近清楚了，褐色脂肪细胞、米色脂肪细胞的脂肪消耗及与其相伴的产热和代谢改善在预防生活习惯病等方面是重要的。

作为氢引起解偶联的条件，在线粒体的氢化酶活性被激活时，受到氢进行作用的时刻的线粒体的膜电位的影响，例如，作为复合物i中由nadh传递电子的一系列fe-s簇的最终电子接受簇的n2簇的氧化还原电位受到由质子梯度引起的电化学势(即，膜电位)的影响而发生变化，从而产生影响。作为氢引起解偶联的机制，可认为与作用时的膜电位、以及复合物i的n2簇或复合物iii中的细胞色素c、以及rieskefe-s簇、血红素bl、血红素bh等的氧化还原电位的关系性是重要的。

[实施例6]

作为在ret的观察中使用的条件，为了更接近生理条件，对于上述实施例2的实验体系，加入1mmnad+和10mm琥珀酸，进而加入5μmnadh作为底物(通常在细胞内nadh/nad+比为1/100以下)，在缓冲液(50mm磷酸(ph7.5)、1mmedta、0.2mmq10(泛醌10)0.1mg/ml牛血清白蛋白(bsa、不包含脂肪酸)内以30℃反应25分钟，测定了nadh浓度(每分钟的平均值)。在不存在氢的情况下检测出282pmol/ml的nadh，但在氢的存在下(约25μm)，nadh浓度增加为1118pmol/ml，即nad+被还原为nadh。

这意味着，在ret的条件下，氢也因nadh的浓度使电子的流动进一步倾向于ret。

[实施例7]

在上述实施例6的实验体系中，通过作为复合物iii的抑制剂的嗜球果伞素b抑制由复合物iii产生的活性氧，在此基础上测定了来自复合物i的活性氧(在超氧化物歧化酶(sod)的存在下将超氧化物转化为h2o2，以h2o2的形式测定)，在不存在氢的情况下为23μm，而在氢的存在下减少至约5分之一即3.9μm。

这意味着，在nadh存在下，即使在增加ret的条件下，氢也抑制活性氧的产生，且因nadh的浓度而使电子流动进一步移动至ret侧。与上述实施例2的在不包含nadh的条件下的结果相比，由fet侧移动至ret侧，氢根据nadh的比率来调整电子流动的方向且在两个条件下抑制了活性氧的产生，因此氢具有抑制电子的泄漏且改变流动方向的电子的整流作用。

[实施例8]

测定了rhi值低于2的血管内皮功能障碍组32例(rhi<2、安慰剂组15例、7pppm氢饮用组17例)的rhi的改善。7pppm氢饮用组17例每天饮用约500ml包含7ppm的氢的水，安慰剂组每天饮用约500ml的纯水，测定了饮用前(初次测定)、饮用开始后1小时、饮用开始后24小时(共饮用2次)、经过2周时的rhi。rhi的测定使用日本光电的endo-pat2000(itamarmedical公司制)，依据其说明书进行。将从初次测定(baseline)起1小时、24小时、2周时的数据示于图1。

测定的结果是，通过持续摄取2周，显著观察到血管内皮功能障碍组32例(rhi值<2)中的由饮用7ppm氢水带来的rhi改善。作为持续饮用7ppm氢水对末梢微血管内皮细胞的意义，明确了对rhi值不良组、即对心/血管疾病相对高风险的组有可能改善血管内皮功能。

血管内皮细胞是衬在血管中的细胞，实际上是人体最大的内分泌器官，总重量约为1.5kg。对于消除生活习惯病而言，可以说这是首先必须确保健康功能的组织。

由无创endo-pat检测的指尖3d脉波得到的反应性充血指数(rhi：reactivehyperemiaindex)反映出在末梢血管中的内皮细胞功能。被认为是独立于代谢综合征等生活习惯病的风险系数的、能够预测人类生命预后的因素，且作为强大的体检工具在全世界的医疗机构中使用。

已证实rhi为低值的群体未来罹患心血管疾病的风险极高。作为改善该群体的血管功能的方法，现状是除了药物之外只有运动、饮食控制。作为没有副作用的无创的改善方法，重要的是阐明氢对患有心脏血管疾病的风险高的rhi低值群体所发挥的作用。

[实施例9]

在氰化物存在下，在阻碍氧还原成水的线粒体呼吸链中混入氢分子，而测定了线粒体的呼吸活性。

[实施例10]

在氰化物存在下，在阻碍氧还原成水的线粒体呼吸链中混入氢分子而测定了线粒体复合物iii的呼吸活性。