一种用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗纳米喷雾及其制备方法与流程

本发明属于术后治疗领域，特别涉及一种用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗纳米喷雾及其制备方法。

背景技术：

癌症已经成为威胁人类健康和生命的首要杀手。据《2018年全球癌症统计数据》报道，2018年全球新增癌症病例1810万，960万人因癌症死亡。目前，手术切除仍是临床实体肿瘤患者主要且有效的治疗方法。然而，由于手术切缘程度受限于肿瘤边界，患者切除肿瘤手术后容易发生微观残留肿瘤的复发和转移，严重降低了患者的长期生存率。因此，发展术后辅助治疗方法对于提高癌症病人的长期生存率具有极为重要的意义。

光动力治疗作为一种有前途的肿瘤治疗方法，由于其无创性和只对肿瘤部位局部照射的高选择性引起了广泛关注。在光动力治疗中，光敏剂能够被特定波长的近红外光照射，产生毒性单线态氧来杀死肿瘤。近红外光在组织中的穿透深度约为1厘米，十分接近术后微观残留肿瘤需要辐照的边缘宽度，因此光动力治疗可作为一种有效的辅助治疗方法来抑制临床术后肿瘤复发。

由于光动力治疗是利用光敏剂将吸收的光能转到肿瘤组织中的氧气来产生毒性单线态氧，肿瘤中氧气供应不足会大大降低光敏剂的光动力效率。而在大多数实体肿瘤，尤其是微观残留肿瘤中，肿瘤血管的微循环和肿瘤的扩散恶化容易造成缺氧，且光动力的发生也会通过不断消耗氧气和血管关闭作用使缺氧进一步恶化，从而使得光动力治疗难以在体内发挥高疗效。传统优化肿瘤氧气含量的方法主要以通入低频射线或高压氧吸入法为主。这些方法虽然能有效改善肿瘤部位的低氧环境，但无法逆转光动力治疗期间的肿瘤氧含量，且容易产生氧气过量的潜在毒性，在临床实际应用中存在局限性。

cn105561306a公开了一种含有单线态氧保护剂的组合物，其通过乳化剂将功能性物质制成乳剂，与光敏剂协同递送到肿瘤组织内，由此提高光动力治疗的药效。但是其产品形态是一种纳米或微米乳剂，生物相容性并非最佳；同时，其形成的纳米乳剂粒径不太均一(20～2000nm)，易导致光动力治疗效果差异大，临床实际使用存在局限性。

目前，专门用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗产品尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗纳米喷雾及其制备方法，该纳米喷雾具有优异的生物相容性和生物安全性，与乳滴型产品相比不会引起严重的毒副作用，同时大大提高了术后光动力的治疗效果。

本发明提供了一种用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗纳米喷雾，原料包括经过亲水改性的脂质双分子层液膜、光敏剂和全氟化物。

所述亲水改性的脂质双分子层液膜的制备方法包括：将胆固醇、磷脂酰胆碱和磷脂溶于有机溶剂中，进行超声处理，完全溶解后，将溶液旋转蒸干，即得经过亲水改性的脂质双分子层液膜。

优选的，所述胆固醇、磷脂酰胆碱和磷脂的质量比为1:4-8:1-2，具体可为1:5:1。

优选的，所述磷脂酰胆碱为二棕榈酸磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二辛酰基磷脂酰胆碱中的至少一种；所述磷脂为甲氧基聚乙二醇磷脂、羟基聚乙二醇磷脂、氨基聚乙二醇磷脂中的至少一种。

优选的，所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。

优选的，所述超声处理条件为：功率为50-100w，具体可为100w；超声时间为1-10min，具体可为5min。

优选的，所述光敏剂为吲哚菁绿。

优选的，所述全氟化物为全氟化碳、全氟丁二烯、全氟辛基溴中的至少一种。

本发明纳米喷雾的平均水合粒径为200.8-400.5nm，具体可为306.8±4.1nm。

本发明还提供了一种用于抑制术后肿瘤复发的富氧光动力治疗纳米喷雾的制备方法，包括：

(1)制备经过亲水改性的脂质双分子层液膜；

(2)将光敏剂溶液和全氟化物混合，进行超声处理，形成一次乳液；

(3)将经过亲水改性的脂质双分子层液膜和一次乳液混合，进行超声处理，形成二次乳液；(4)将二次乳液离心，收集下层沉淀，重悬至水溶性溶剂中，即得富氧光动力治疗纳米喷雾。

所述步骤(2)中的光敏剂溶液和全氟化物的体积比为1:1-5，具体可为1:3。

所述步骤(2)中的光敏剂溶液的浓度为10-20mg/ml，具体可为20mg/ml。

所述步骤(2)中的超声处理条件为：功率为50-100w，具体可为100w；超声时间为10-20min，具体可为20min。

所述步骤(3)中的经过亲水改性的脂质双分子层液膜和一次乳液的体积比为10-20:1，具体可为10:1。

所述步骤(3)中的超声处理条件为：功率为50-100w，具体可为100w；超声时间为10-20min，具体可为15min。

所述步骤(4)中的离心处理条件为：离心力为5000-10000rcf，具体可为8000rcf；离心时间为1-10min，具体可为10min；离心次数为1-5次，具体可为3次。

所述步骤(4)中的水溶性溶剂为二次去离子水、磷酸缓冲液中的至少一种。

本发明的原理是：手术过程中肿瘤切除后暴露于空气中，本发明可从空气中持续不断吸取氧气，有效降低了肿瘤组织的缺氧，提高了光敏剂之间的碰撞能量转移和氧气，从而大大提高了术后光动力的治疗效果。

有益效果

本发明具有优异的生物相容性和生物安全性，与乳滴型产品相比不会引起严重的毒副作用，同时大大提高了术后光动力的治疗效果；制备简单、重复性好、对人员无特殊技术要求；另外，其样品需求量小，成本低，疗效高，易于实现临床指导癌症患者的光动力治疗。

附图说明

图1为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾的动态光散射图。

图2为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾的紫外吸收光谱图。

图3为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾的共定位成像图。

图4为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾单线态氧的产生与近红外光照射时间之间的关系。

图5为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾单线态氧的产生与浓度之间的关系。

图6为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾的体外肿瘤细胞杀伤效果图。

图7为实施例1富氧光动力治疗纳米喷雾的体内术后抑制肿瘤复发效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

富氧光动力治疗纳米喷雾的制备

称取5mg胆固醇、25mg二棕榈酸磷脂酰胆碱(dppc)和5mg甲氧基聚乙二醇磷脂(dspe-peg2000)溶于10ml二氯甲烷中，100w超声2min，完全溶解后，溶液转移至圆底烧瓶中并旋转蒸干，形成液膜。配制20mg/ml的吲哚菁绿(icg)溶液，取0.2ml吲哚菁绿溶液和0.6ml的全氟辛基溴(pfob)混合，100w超声20min，形成一次乳液。取2ml液膜加入0.2ml一次乳液中，混合均匀，100w超声15min，形成二次乳液。将二次乳液在8000rcf转速下离心10min，保留下层沉淀，水洗三次，最后用二次去离子水重悬，即得到富氧光动力治疗纳米喷雾(lip-pfob-icg)。

图1显示富氧光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg的水合粒径为306.8±4.1nm。

图2显示富氧光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg分别809nm和782nm处显示出强的吸收峰，表明吲哚菁绿负载成功。

图3显示吲哚菁绿的绿色荧光和脂质壳层的红色荧光完美重合，表明吲哚菁绿成功封装在脂质双分子层中，而不是吸附在表面。

实施例2

实施例1制备的富氧光动力治疗纳米喷雾的单线态氧检测：

单线态氧检测试剂盒(sosg)购买于美国英杰生命技术有限公司。

将实施例1制备的富氧光动力治疗纳米喷雾配制成一系列icg终浓度为1.25μg/ml的lip-pfob-icg溶液，再分别加入10μl、浓度为5mm的sosg二甲亚砜溶液。用808nm,1w/cm²近红外激光连续照射0,1,2,3,4,5min后，然后分别进行溶液的荧光强度测定。单线态氧产生的激发波长为504nm,发射波长为525nm.以相同浓度的纯icg溶液作为对照。

将实施例1制备的富氧光动力治疗纳米喷雾配置成一系列不同icg浓度分别为0,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml的lip-pfob-icg溶液，再分别加入10μl，浓度为5mm的sosg二甲亚砜溶液。用808nm,1w/cm²近红外激光连续照射5min后，然后分别测定溶液的荧光强度。以相同浓度的纯icg溶液作为对照。

上述检测结果如图4和5所示。结果显示，在相同条件下，在不同照射时间下，lip-pfob-icg溶液总是比纯icg溶液产生更多的单线态氧。在808nm,1w/cm²近红外激光照射5min后，lip-pfob-icg产生的荧光强度具有明显的浓度依赖增强行为；而在纯icg组中，尽管icg浓度也是逐渐增加，但荧光强度却没有显著增加，表明在纳米喷雾中全氟辛基溴pfob是增强光动力效率的主要因素。以上结果表明，lip-pfob-icg可以作为氧气载体克服缺氧来有效提高光动力治疗疗效。

实施例3

实施例1制备的富氧光动力治疗纳米喷雾体外肿瘤细胞杀伤实验：

所用细胞为人源结肠癌细胞hct116，购于上海中科院药物研究所。

制备不同icg浓度(0,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml)的lip-pfob-icg溶液，待细胞在96孔板里贴壁生长约70～80％时，去除培养基，然后分别加入100μl不同icg浓度的lip-pfob-icg溶液孵育4h,用808nm,1w/cm²近红外激光照射5min后，再孵育24h,再用磷酸缓冲溶液清洗三次，最后加入cck-8染色试剂，1h后在酶标仪上测吸光度变化。

上述实验结果如图6所示。实验结果显示，在808nm,1w/cm²近红外激光照射5min的情况下，hct116细胞显示出显著的剂量依赖性细胞毒性；用icg浓度为10μg/ml的lip-pfob-icg溶液处理后，细胞仅维持约20％的活力，表明制备的富氧光动力治疗纳米喷雾具有较好的细胞杀伤效果。

实施例4

实施例1制备的富氧光动力治疗纳米喷雾体内抑制术后肿瘤复发实验：

所用balb/c裸鼠为spf清洁级，购于上海动物实验中心。

在balb/c裸鼠皮下注射100μl,10⁶个/ml的hct116-luc细胞悬浮液，建立hct116-luc荷瘤鼠模型，待肿瘤长至约100mm³进行手术切除。在最大限度切除可观察到的肿瘤后，在术后肿瘤表面喷涂一层icg浓度为200μg/ml的lip-pfob-icg溶液，并用808nm,1w/cm²近红外激光每隔30s照射一次，共照射10min.需要指出的是，icg同时具有光动力和光热效应，为防止光热效应产生，选择每隔30s进行一次近红外光照射。然后用医用胶粘合伤口。在治疗期间，对荷瘤鼠每四天进行一次活体成像拍摄肿瘤复发情况，每两天测量一次小鼠体重及肿瘤体积变化，连续监测17天。以只进行手术切除的裸鼠为对照。

上述实验结果如图7所示。实验结果显示，未经手术切除的裸鼠肿瘤体积连续增长；而在手术切除组，由于手术切除了大块肿瘤，但未进行富氧光动力治疗纳米喷雾的治疗，裸鼠的肿瘤信号在第1天下降。然而，微观残留肿瘤组织再生长，导致在治疗后第5天信号迅速复发。相比之下，喷涂富氧光动力治疗纳米喷雾且进行近红外光照射的裸鼠组，在整个观察期间显示出完全的肿瘤消融，且没有复发。这是由于富氧光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg在近红外光照射过程中，源源不断从周围吸取氧气，持续产生毒性单线态氧，进而完全消除了残留的肿瘤，表明富氧光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg可有效抑制术后肿瘤复发。这些发现将极大促进将富氧光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg用于微观残留肿瘤复杂手术的强大平台。

本发明的富养光动力治疗纳米喷雾lip-pfob-icg不仅在体外具有优异的光动力治疗效果，更在荷瘤小鼠术后切除模型中，展现出完全的微观残余肿瘤消除且无复发和转移。动物实验的药效明显，表明该富养光动力治疗纳米喷雾有望在临床术后辅助治疗中推广。