包含CYS-肽的组合物的制作方法

包含cys-肽的组合物
发明领域
1.本发明涉及通过将至少一种寡肽、优选二肽和选自游离半胱氨酸和任选的胱氨酸(cys-cys)的半胱氨酸源混合制备的组合物，所述寡肽具有一个氨基酸为半胱氨酸(cys)，其中所述组合物具有至少为5、优选至少为6的ph值。与游离半胱氨酸/胱氨酸相比，该组合物具有改进的稳定性/溶解度的优点，并且能够用于为细胞、组织、器官和整个生物体提供半胱氨酸/胱氨酸源。
2.此外，本发明涉及生物技术生产方法。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用这种改进的培养基的方法，以及从使用改进的培养基的方法获得的产品。
3.发明背景
4.半胱氨酸是一种重要的氨基酸，其可用于各种应用，从人营养、化妆品到细胞和组织培养方法。它是蛋白质和谷胱甘肽的组成部分，谷胱甘肽是一种重要的细胞抗氧化剂并且参与调节氧化还原稳态。口服营养半胱氨酸/胱氨酸补充剂已被证明具有各种健康益处(由plaza et al.,molecules 2018,23,575综述)
5.半胱氨酸/胱氨酸也存在于细胞培养基制剂中。尽管半胱氨酸不是必需氨基酸，但生物制剂生产的细胞培养过程中受到限制能够导致活力和生产力的严重丧失。另一方面，过量服用半胱氨酸能够导致毒性作用(ritacco et al.,biotechnol prog.,2018,vol.34,no.6)。
6.在用于各种应用的高浓度液体营养液中配制半胱氨酸的一个主要问题是它在氧气存在下迅速氧化为胱氨酸，而胱氨酸在3至9的ph范围内具有《1mm的低溶解度(carta et al.,j.chem.eng.data 1996,41,414-417)。
7.该问题的解决方案是使用易溶性cys-二肽如(ala-cys)2和(lys-cys)2作为半胱氨酸/胱氨酸源。这些肽已发现可用于细胞培养、肠外营养，并已被研究用于化妆品应用(见下文参考文献)。
8.然而，由于生产二肽需要另外的合成和纯化步骤，它们显著贵于游离半胱氨酸和胱氨酸。因此，仍然需要成本效益更高、高度浓缩的半胱氨酸/胱氨酸制剂。取决于肽中其他氨基酸的性质，溶解度增加有时不够高，这进一步限制了制剂的可能性。
9.ep2561065b1公开了包含浓缩的半胱氨酸和酪氨酸的浓缩补料，其支持最大的细胞生长和/或蛋白质，或病毒生产，同时避免由它们有限的溶解度和稳定性引起的问题。
10.us2013/0130317 a1描述了培养具有生产物质能力的动物细胞的方法，该方法包括在补充有具有一个或多个l-半胱氨酸且不包括谷胱甘肽的寡肽的培养基中培养动物细胞。
11.出于同样的原因，cys-肽也被评估为肠外营养(pollack et al.,zeitschrift f
ü
r1989,28:191-200)和化妆品应用(tseng et al.,j.agric.food chem.2015,63:6181-6188)中半胱氨酸的替代品。
12.然而，合成肽显著贵于氨基酸，因此需要用于稳定半胱氨酸以防止沉淀的成本更
低的解决方案。当氧气可以物理排除(参考)但通常不需要时，可以使用还原剂在一定程度上防止半胱氨酸形成胱氨酸。此外，这种方法在存在高氧浓度和供应例如用于细胞培养的充气生物反应器环境的情况下不起作用。
13.对于某些cys-肽(例如(ala-cys)2)，溶解度仍然不够高，无法制备高度浓缩的储液或补料液。然而，在现代细胞培养生物加工中，高度浓缩的氨基酸和肽的溶液对于强化过程和避免能够降低灵活性和生产力、使下游加工复杂化并带来更高环境负担的成本的过度液体加工(例如在灌注系统中)很重要。
14.类似的问题出现在含水食品和化妆品或用于肠外营养的营养液中。
15.发明概述
16.本发明解决了含有高度浓缩的半胱氨酸的液体制剂的上述缺点。本发明由所附独立权利要求的条款定义。本发明的优选实施方案由从属权利要求定义。
17.令人惊讶地发现，通过添加含有半胱氨酸的寡肽、二肽和/或它们的二硫化物，可以稳定高度浓缩的半胱氨酸溶液以抵抗氧化沉淀。甚至更令人惊讶的是，在某些情况下，各自的混合物甚至导致各自的cys-寡肽的溶解度增加。还发现，在存在少量半胱氨酸(或其他巯基，未研究)的情况下，可以通过添加cys-肽来使胱氨酸增溶。
18.获得的组合物代表稳定的半胱氨酸形式，与单独的二肽相比，能够以每个半胱氨酸当量的显著更低的成本制备，因此能够实现另外的比目前更成本敏感的应用。另一个优点是，它们能够用于需要一定量游离半胱氨酸的应用中，例如当寡肽或二肽释放半胱氨酸或胱氨酸的水解速率变为速率限制时。
19.可以通过将确定摩尔比的cys-寡肽或cys-二肽与半胱氨酸混合或通过将确定摩尔比的cys-二肽与半胱氨酸和胱氨酸混合来制备组合物。寡肽结合半胱氨酸与游离半胱氨酸的优选摩尔比为10或更低，优选4或更低，更优选2或更低，更优选1或更低，更优选0.5或更低，最优选0.2或更低。混合物可以是固体形式(结晶粉末、团块等)或含水溶液形式。在含水溶液的情况下，半胱氨酸以至少1mm、优选至少10mm、更优选至少50mm和最优选至少100mm的浓度添加并且二肽以上述的合适的摩尔比添加。
20.根据本发明的组合物还可以是化妆品、营养补充剂、临床营养用营养液或细胞或组织培养基(基础培养基、补料培养基或灌注培养基)的组成部分。
21.因此，本发明涉及通过将至少一种寡肽、优选至少一种二肽和选自游离半胱氨酸和任选的胱氨酸(cys-cys)的半胱氨酸源混合而制备的组合物，所述寡肽具有一个氨基酸为半胱氨酸(cys)。因此，本发明涉及包含该组合物的培养基。
22.本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞、优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
23.本发明的另一方面涉及一种制造细胞培养产品的方法，包括以下步骤：(i)提供能够生产所述细胞培养产品的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产品。
24.本发明的优选实施方案在以下本发明的详述中进一步详细描述。
25.附图简要说明
26.图1描绘了在存在递增浓度的(lys-cys)2的情况下，在37℃和24小时内，ph＝7的100mm半胱氨酸溶液中沉淀物的形成。
27.图2显示了通过添加递增量的半胱氨酸来降低50mm(ala-cys)2悬液的浊度。
28.图3显示了通过添加各种浓度的(lys-cys)2来稳定100mm半胱氨酸溶液以抵抗氧化沉淀。
29.图4显示了通过向50mm半胱氨酸溶液中添加各种浓度的cys-肽提供的抗氧化沉淀的稳定作用。
30.图5显示了通过向25mm半胱氨酸溶液中添加各种浓度的cys-肽提供的抗氧化沉淀的稳定作用。
31.发明详述
32.在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上述20种氨基酸的l-型和d-型。然而，l-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
33.根据本发明，“游离氨基酸”，例如“游离”半胱氨酸，被理解为具有游离形式的氨基和其(α-)羧基官能团的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。根据生物化学和肽生物合成的已知机制，当提及氨基酸作为二肽的一部分或在二肽中时，这应理解为指源自相应氨基酸的相应二肽结构的那部分。
34.本发明一般性涉及一种组合物，该组合物包含至少一种寡肽和(作为半胱氨酸源)游离半胱氨酸，所述寡肽具有一个氨基酸为半胱氨酸(cys)。可以包含任选的游离半胱氨酸和游离胱氨酸(cys-cys)。术语游离半胱氨酸和游离胱氨酸(cys-cys)应包括半胱氨酸和胱氨酸的盐或水合物形式。
35.优选地，寡肽是二肽。
[0036]“肽”应理解为包含至少两个通过α-肽键(r
1-co-nh-r2)彼此共价偶联的氨基酸的分子。
[0037]“多肽”应理解为包含超过二十个通过肽键(r
1-co-nh-r2)彼此共价偶联的氨基酸的分子。
[0038]“寡肽”应理解为包含少于二十个、优选二至十个仅通过α-肽键(r
1-co-nh-r2)彼此共价偶联的氨基酸的分子。谷胱甘肽，一种glu-cys-gly三肽，其包含一个γ-肽键和一个α-肽键，因此被排除在外。
[0039]“二肽”应理解为包含两个通过α-肽键(r
1-co-nh-r2)彼此共价偶联的氨基酸的分子。
[0040]
表述“xxx”在本文中与氨基酸结合使用时，应理解为指以下定义的任何天然氨基酸。
[0041]
在本发明的上下文中，“氨基酸”应理解为包含氨基官能团(-nh2)和羧酸官能团(-cooh)以及对相应的氨基酸具有特异性的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是包括胱氨酸的20种“天然氨基酸”如下：
[0042][0043][0044]
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上述20种氨基酸的l-型和d-型。然而，l-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
[0045]
根据本发明，“游离氨基酸”(例如“游离”半胱氨酸)被理解为具有游离形式的氨基和其(α-)羧基官能团的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。根据生物化学和肽生物合成的已知机制，当提及氨基酸作为二肽的一部分或在二肽中时，这应理解为指源自相应氨基酸的相应二肽结构的那部分。
[0046]
参考化学化合物，例如氨基酸，表述“n-酰化”应理解为表示通过将酰基加成到所述化合物的氮官能团上来修饰的n-酰化的化合物。优选地，酰基被添加到氨基酸的α-氨基上。
[0047]
在本发明的上下文中，通过氧化的半胱氨酸残基形成二硫键的cys-肽应被描述为(xxx-cys)2。肽也可以盐或水合物形式存在。这种二硫键介导的cys-二肽的二聚体，例如(xxx-cys)2，仍然被认为是本发明意义上的二肽。
[0048]
优选地，组合物在25℃具有至少5或优选至少6的ph值。
[0049]
在本发明的有利配置中，肽结合半胱氨酸与游离半胱氨酸的摩尔比为0.1至10，优选0.2至4或更低，最优选0.5至2。在优选实施方案中，寡肽或二肽处于还原态(＝游离巯基)或氧化态(＝二硫键键合)，优选处于氧化态
[0050]
在一个替代实施方案中，组合物包含二肽和半胱氨酸源的混合二硫化物。
[0051]
在本发明的一个优选实施方案中，寡肽或二肽还包含一种或多种天然氨基酸，所
述天然氨基酸在ph范围为ph 6至ph 9的溶解度为至少》10g/l并且优选选自甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、丝氨酸(ser)、脯氨酸(pro)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)或精氨酸(arg)。
[0052]
优选当所述寡肽是其为xxx-cys或cys-xxx的二肽时，其中xxx是天然氨基酸，优选所述二肽优选为asp-cys、cys-asp、lys-cys、cys-lys、ala-cys或pro-cys。在优选配置中，所述二肽以至少1mm、优选至少10mm、更优选至少50mm、更优选至少100mm的浓度存在于所述培养基中。在如此高的浓度下，根据本发明的组合物提供了含半胱氨酸的二肽稳定半胱氨酸以抵抗氧化沉淀的优点。
[0053]
在优选的实施方案中，寡肽或二肽不是n-酰化的。已知n-酰化可提高某些二肽的热稳定性；然而，已经发现n-酰化二肽也可能导致较差的活细胞密度和活力。
[0054]
本发明还涉及一种化妆品、营养补充剂、临床营养用营养液，其包含根据本发明的组合物。
[0055]
化妆品可以是洗发水、护发素、洗剂、霜剂或用于处理皮肤或头发的其他制剂。营养补充剂可以是液体形式，例如糖浆或注射剂，或者是固体形式，例如胶囊、软凝胶、软糖。该组合物也可以是用于临床肠内或肠外营养的营养液的一部分，例如氨基酸溶液例如aminoven(fresenius kabi)的一部分。
[0056]
此外，本发明还涉及一种细胞或组织培养基。
[0057]
本发明的另一个主题涉及包含根据本发明的组合物的细胞或组织培养基，其还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。在一个特别优选的实施方案中，培养基包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和至少一种维生素的全部。
[0058]
在本发明的一个实施方案中，培养基不含生长因子。根据该实施方案，本发明的寡肽或二肽可代替生长因子用于促进培养中细胞的生长和/或增殖。在本发明的另一个实施方案中，培养基不含任何脂质。
[0059]
根据本发明的另一个实施方案，培养基为液体形式、为凝胶、粉末、颗粒、丸剂的形式或为片剂的形式。
[0060]
在优选的实施方案中，本发明的培养基是确定成分培养基或无血清培养基。例如，本发明的组合物可以补充到miltenyi biotech(bergisch gladbach,germany)的chomacs cd培养基、可从lonza(basel,switzerland)获得的powercho-2cd培养基、paa(paa laboratories,pasching,austria)的acti-cho p培养基、可从safc获得的ex-cell cd cho培养基、thermofisher(waltham,usa)的sfm4cho培养基和cdm4cho培养基。本发明的二肽也可以补充到dmem培养基(life technologies corp.，carlsbad，usa)中。然而，本发明不限于对上述培养基的补充。
[0061]
在其他优选实施方案中，培养基是相对于正在使用的培养基的浓度为2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用相应体积的无菌水简单稀释浓缩培养基来制备“即用型”培养基。本发明培养基的这种浓缩形式也可以通过将其添加到培养物中来使用，例如在补料分批培养或灌注方法中。
[0062]
本发明的细胞培养基(细胞或组织培养基础、补料或灌注培养基)可优选包含持续生长和产物形成所需的所有营养物。用于制备培养基、特别是细胞培养基的配方是本领域
技术人员众所周知的(参见例如cell culture technology for pharmaceutical and cell-based therapies,and wei-shou hu eds.,taylor and francis group 2006)。可从各种来源商购获得各种培养基。
[0063]
本发明的培养基可优选包括碳水化合物源。细胞培养基中使用的主要碳水化合物是葡萄糖，常规补充5至25mm。此外，可以使用任何己糖，例如半乳糖、果糖或甘露糖或其组合。
[0064]
培养基通常还可包含至少必需氨基酸(即his、ile、leu、lys、met、phe、thr、try、val)以及非必需氨基酸。如果细胞系不能合成氨基酸或如果细胞系不能产生足够量的氨基酸以支持最大生长，则细胞培养基中通常包含非必需氨基酸。此外，哺乳动物细胞也可以使用谷氨酰胺作为主要能量来源。通常以高于其他氨基酸的浓度包括谷氨酰胺(2-8mm)。然而，如上所述，谷氨酰胺能够自发分解形成氨，某些细胞系更快地产生氨，这是有毒的。
[0065]
本发明的培养基可优选包含盐。将盐添加到细胞培养基中以维持等渗条件并防止渗透失衡。本发明的培养基的重量摩尔渗透压浓度为约300mosm/kg，但是许多细胞系能够耐受该值的约10％或更高的变化。一些昆虫细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度往往高于300mosm/kg，并且这可能是比300mosm/kg高0.5％、1％、2至5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％。细胞培养基中最常用的盐包括na
+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、cl-、so
42-、po
43-和hco
3-(例如，cacl2、kcl、nacl、nahco3、na2hpo4)。
[0066]
培养基中可能存在其他无机元素。它们包括mn、cu、zn、mo、va、se、fe、ca、mg、si和ni。这些元素中的许多元素都与酶活性有关。它们可以盐的形式提供，例如cacl2、fe(no3)3、mgcl2、mgso4、mncl2、nacl、nahco3、na2hpo4，以及微量元素例如硒、钒和锌的离子。这些无机盐和微量元素可以商业获得，例如从sigma(saint louis,missouri)获得。
[0067]
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅助因子。每种细胞系对维生素的需求差异很大，但如果细胞培养基含有很少或不含血清，或者如果细胞以高密度生长，则一般需要额外的维生素。优选存在于本发明培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺(nicotinamide)、d-泛酸钙、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺(niacinamide)、a、b6、b
12
、c、d3、e、k和对氨基苯甲酸(paba)。
[0068]
本发明的培养基还可以包含血清。血清是凝结血液的上清液。血清成分包括附着因子、微量营养素(例如，微量元素)、生长因子(例如，激素、蛋白酶)和保护性元素(例如，抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从包括人、牛或马血清的多种动物来源获得。当包含在根据本发明的细胞培养基中时，血清通常以5-10％(vol.)的浓度添加。优选的细胞培养基是无血清的。
[0069]
为了在无血清或血清减少的培养基中促进细胞生长，可以将一种或多种以下多肽添加到本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(fgf)，包括酸性fgf和碱性fgf、胰岛素、胰岛素样生长因子(igf)、上皮生长因子(egf)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生生长因子(pdgf)和转化生长因子(tgf)，包括tgfα和tgfβ，任何细胞因子，如白介素1、2、6、粒细胞刺激因子、白细胞抑制因子(lif)等。
[0070]
在其他实施方案中，细胞培养基不含多肽(即，具有超过20个氨基酸的肽)。
[0071]
一种或多种脂质也可以添加到本发明的细胞培养基中，所述脂质例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子的脂肪酸，
其中每个碳原子有支链或无支链)、磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。这些脂质中的一种或多种脂质可以作为补充剂包含在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些贴壁依赖性细胞的生长，所述贴壁依赖性细胞例如mdck、小鼠上皮细胞和其他肾细胞系，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇在无血清培养基中刺激人成纤维细胞的生长。乙醇胺和胆固醇也被证明可以促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
[0072]
例如牛血清白蛋白(bsa)或转铁蛋白的一种或多种载体蛋白也可以添加到细胞培养基中。载体蛋白可以帮助运输某些营养素或微量元素。bsa通常用作脂质的载体，例如不溶于含水溶液的亚油酸和油酸。此外，bsa还可以作为例如fe、cu和ni的某些金属的载体。在不含蛋白质的配方中，例如环糊精的bsa的非动物来源替代品可用作脂质载体。
[0073]
例如纤连蛋白、层粘连蛋白和前粘连蛋白(pronectin)的一种或多种附着蛋白也可以添加到细胞培养基中，以帮助促进贴壁依赖性细胞附着到基质上。
[0074]
细胞培养基可以任选地包括一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于n-[2-羟乙基]-哌嗪-n'-[2-乙磺酸](hepes)、mops、mes、磷酸盐、碳酸氢盐和其他适用于细胞培养应用的缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对培养的细胞没有显著细胞毒性的缓冲剂。合适缓冲剂的选择在细胞培养领域的普通技术范围内。
[0075]
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物添加到培养基中以防止细胞结块并促进细胞悬浮生长。
[0076]
在一个优选的实施方案中，培养基为液体形式。然而，培养基也可以是固体培养基，例如凝胶状培养基，例如含有琼脂、卡拉胶或明胶的培养基(粉末、聚集粉末、速溶粉末等)。优选地，培养基为无菌形式。
[0077]
本发明的培养基可以是浓缩形式。它可以是例如2-100倍浓缩形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍(相对于支持细胞生长和产物形成的浓度)。这种浓缩培养基有助于通过用含水溶剂例如水稀释浓缩培养基来制备培养基以供使用。这种浓缩培养基可用于分批培养，但也有利地用于分批补料培养或连续培养，其中将浓缩的营养组合物添加到正在进行的细胞培养中，例如以补充培养期间细胞消耗的营养。
[0078]
在本发明的其他实施方案中，培养基为干燥形式，例如，干燥粉末形式，或颗粒形式，或丸剂形式，或片剂形式。
[0079]
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及本发明的培养基用于生产细胞培养产品的用途。
[0080]
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞、最优选哺乳动物细胞的用途。在具体实施方案中，待培养的细胞是cho细胞、cos细胞、vero细胞、bhk细胞、hek细胞、hela细胞、ae-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。本发明优选的细胞是cho细胞和杂交瘤细胞。本发明最优选的细胞是cho细胞。本发明特别优选的cho细胞是cho dg44和cho dp12细胞。
[0081]
本发明的范围还包括培养细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持细胞培养的条件下使细胞与基础培养基接触，并用根据本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，在超过一天的时间内向基础培养基补充浓缩补料或培养基。
cys)2或(cys-xxx)2，其中xxx是天然氨基酸。
[0101]
11.根据项目10所述的组合物，其中所述寡肽是二肽并且选自(asp-cys)2、(cys-asp)2、(lys-cys)2、(cys-lys)2、(ala-cys)2、(pro-cys)2、(lys-cys)2和(cys-lys)2。
[0102]
12.根据项目10或11所述的组合物，其中(lys-cys)2和/或(cys-lys)2以1至100mm的浓度包含于其中并且半胱氨酸以1至100mm的浓度包含于其中。
[0103]
13.根据项目10或11所述的组合物，其中(ala-cys)2、(asp-cys)2、(cys-asp)2、(pro-cys)2以20至60mm的浓度包含于其中并且半胱氨酸以1至100mm的浓度包含于其中。
[0104]
14.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中半胱氨酸以至少1mm、优选至少10mm、更优选至少25mm、最优选至少50mm的浓度添加到含水溶液中。
[0105]
15.一种化妆品、营养补充剂、临床营养用营养液，其包含根据项目1至14中任一项所述的组合物。
[0106]
16.一种细胞培养基，包含根据项目1至14中任一项所述的组合物，所述培养基还包含至少一种碳水化合物，和/或至少一种另外的游离氨基酸，和/或至少一种无机盐，和/或缓冲剂和/或至少一种维生素。
[0107]
17.根据项目16所述的培养基，其中所述培养基为液体形式、为凝胶、粉末、颗粒、丸剂的形式或为片剂的形式。
[0108]
18.根据项目16或17所述的培养基，其中相对于正在使用的培养基的浓度，所述培养基为2倍至100倍浓缩形式，优选为2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍或100倍浓缩形式。
[0109]
19.根据项目16至18中任一项的培养基用于培养细胞的用途，优选作为含水储液或补料液。
[0110]
20.根据项目19所述的用途，其中所述细胞是动物细胞或植物细胞，优选哺乳动物细胞。
[0111]
21.根据项目19或20所述的用途，其中所述细胞选自由以下组成的列表：cho细胞、cos细胞、vero细胞、bhk细胞、hek细胞、hela细胞、ae-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞、免疫细胞如nk或t细胞和杂交瘤细胞。
[0112]
22.制造细胞培养产品的方法，其包括以下步骤
[0113]-提供能够生产所述细胞培养产品的细胞；
[0114]-使所述细胞与项目16至18中任一项所述的培养基接触；和
[0115]-从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产品。
[0116]
23.根据项目22所述的方法，其中所述细胞培养产品选自由以下组成的列表：治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、例如肝素的多糖、抗体、单克隆抗体、生长因子、白介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
实施例
[0117]
实施例1：通过添加cys-二肽 (lys-cys)
2 稳定半胱氨酸以防止沉淀
[0118]
在所有实施例的所有实验中，在ph＝7的100mm磷酸盐缓冲液中制备物质溶液及其稀释液。通过添加适当浓度的(lys-cys)2可以避免在ph＝7的100mm磷酸盐缓冲液中的100mm半胱氨酸溶液中发生沉淀。
[0119]
在基于微量滴定板的测定中，在600nm处以光度计测量由沉淀引起的浊度。每孔的
液体体积为200μl，并在酶标仪(tecan)中于37℃下在24小时内进行测量。板子没有盖上盖子。
[0120]
当用0、100、200或400mm(lys-cys)2x 2hcl制备ph＝7的100mm半胱氨酸溶液时，获得了令人惊讶的结果。在没有添加肽的情况下可以看到和测量到沉淀。然而，虽然100mm(lys-cys)2甚至加速了沉淀，但200mm和400mm(lys-cys)2则有效地阻止了沉淀。可以目视观察沉淀物并通过比浊法进行测量(参见图1)。
[0121]
图1显示在存在递增浓度的(lys-cys)2的情况下，在37℃和24小时内，ph＝7的100mm半胱氨酸溶液中沉淀物的形成。
[0122]
实施例2：通过添加 (lys-cys)
2 和半胱氨酸增溶胱氨酸
[0123]
在ph＝7的100mm磷酸盐缓冲液中制备20ml表1中所述的组合物，并在封闭的50ml聚丙烯管(falcon)中孵育24小时。当添加足够浓度的(lys-cys)2时，获得澄清溶液，而混合物在较低浓度下保持混浊悬液。
[0124]
表1：在100mm磷酸盐缓冲液中制备毫摩尔浓度的混合物成分，并在25℃下摇动孵育24小时。次日进行目视检查。
[0125] 混合物1混合物2混合物3混合物4混合物5混合物6胱氨酸1.301.301.301.301.301.30(lys-cys)20.000,000.410.821.633.27胱氨酸半0.000.130.130.130.130.13目视检查悬液悬液悬液悬液溶液溶液
[0126]
实施例3：通过添加半胱氨酸增溶(ala-cys)2[0127]
(ala-cys)2在ph＝7和37℃时的最大溶解度低于50mm。制备在ph＝7的磷酸盐缓冲液中的50mm(ala-cys)2浑浊悬液，并添加递增量的半胱氨酸。将混合物在37℃下在微量滴定板中孵育(每孔液体体积为200μl)，30分钟后测量600nm处的浊度。在20mm和更高浓度的半胱氨酸下，(ala-cys)2完全溶解，没有测量到浊度进一步降低。溶液在视觉上是透明的(见图2)。
[0128]
图1显示了通过添加递增量的半胱氨酸来降低50mm(ala-cys)2悬液的浊度。
[0129]
实施例4：通过在氧化条件下添加cys-二肽(lys-cys)2稳定100mm半胱氨酸溶液以防止沉淀
[0130]
在微量滴定板中进行如实施例1所述的实验。在37℃下孵育2小时后，向每个孔中添加14μl的5重量％的h2o2溶液以加速氧化并评估在完全氧化条件下的稳定性。仅含有半胱氨酸的样品在添加了h2o2后立即变得浑浊，这很可能是由胱氨酸的形成引起的。对于含有(lys-cys)2的样品，没有观察到浊度立即增加。随后继续在酶标仪中进行浊度测量。结果示于错误！未找到参考来源中。随着(lys-cys)2浓度的递增，浊度增加显著降低，当添加400mm(lys-cys)2时没有观察到沉淀。
[0131]
图2显示了通过添加各种浓度的(lys-cys)2来稳定100mm半胱氨酸溶液以防止氧化沉淀。将混合物在微孔板中于37℃孵育2小时，并通过光度法测量浊度。随后添加h2o2以加速氧化并评估在完全氧化条件下防止沉淀的稳定性。添加h2o2后直接继续进行浊度测量。单独使用半胱氨酸时，当添加h2o2时，溶液直接变得明显混浊。随着(lys-cys)2添加量的递增，通过浊度测量的沉淀量降低。在400mm(lys-cys)2下，混合物在测量过程中保持完全透明。
[0132]
实施例5：通过在氧化条件下添加各种cys-二肽来稳定25mm和50mm半胱氨酸溶液以防止沉淀
[0133]
为了评估上述稳定化是否也能够通过添加其他cys-二肽进行，如实施例4所述进行实验，不同之处在于使用了50mm和25mm的降低的半胱氨酸浓度以及添加的cys-二肽的浓度为0(＝对照)、5、10、25和50mm。评估了(asp-cys)2、(cys-asp)2、(lys-cys)2、(cys-lys)2、(ala-cys)2和(pro-cys)2的作用。在添加了h2o2后，所有cys-肽都能防止半胱氨酸溶液沉淀。在半胱氨酸浓度为50mm的各种cys-肽之间观察到稳定效率的差异。含有赖氨酸残基的cys-二肽是最有效的稳定剂，而cys-肽与半胱氨酸的摩尔比1:2至1:5提供了足够的稳定性。4.5小时后50mm半胱氨酸的浊度测量结果见表2
[0134]
表2：与各种浓度的cys-二肽混合的50mm半胱氨酸溶液的浊度。4.5小时后在600nm(au)处测量到的浊度
[0135]
cys-肽浓度(asp-cys)2(cys-asp)2(lys-cys)2(cys-lys)2(ala-cys)2(pro-cys)250mm0.0420.0390.0470.0770.0390.11825mm0.0390.2790.0450.0670.0370.76210mm1.3011.5230.5560.0921.1291.3795mm1.4531.7020.9460.3901.0521.5390mm1.2791.2791.2791.2791.2791.279
[0136]
随着半胱氨酸浓度的递减，完全稳定所需的二肽与半胱氨酸的摩尔比降至最低测量比1:10。这在表3中进行了描述，采用25mm半胱氨酸溶液的浊度测量结果。
[0137]
表3：与各种浓度的cys-二肽混合的25mm半胱氨酸溶液的浊度。4.5小时后在600nm(au)处测量到的浊度
[0138]
cys-肽浓度(asp-cys)2(cys-asp)2(lys-cys)2(cys-lys)2(ala-cys)2(pro-cys)250mm0.0400.0400.0470.0840.0500.04225mm0.0380.0380.0420.0680.0370.04010mm0.0390.0370.0410.0500.0370.0395mm0.0380.0810.0390.0440.0390.0780mm0.1220.1220.1220.1220.1220.122
[0139]
表2和3的结果在错误！未找到参考来源和错误！未找到参考来源中可视化。
[0140]
图3显示了通过向50mm半胱氨酸溶液中添加各种浓度的cys-肽而提供的防止氧化沉淀的稳定作用。
[0141]
图4显示了通过向25mm半胱氨酸溶液中添加各种浓度的cys-肽而提供的防止氧化沉淀的稳定作用。
[0142]
实施例6：通过在氧化条件下添加还原和氧化的cys-二肽来稳定50mm半胱氨酸溶液以防止沉淀
[0143]
为了评估上述稳定化是否也能够通过添加还原的半胱氨酸二肽(＝游离巯基)，选择与实施例4中描述的相同的实验设置。在这种情况下，将各种浓度的还原二肽cys-gly和氧化二肽(cys-gly)2添加到50mm半胱氨酸溶液中。在添加了h2o2后，两种cys-肽都能够防止半胱氨酸溶液沉淀。氧化二肽(cys-gly)2在防止沉淀方面更有效，因为在25mm的肽浓度下已经可以完全抑制沉淀，而使用还原的二肽cys-gly仅在50mm时才能获得完全稳定。结果总
结在表4中。
[0144]
表4：与各种浓度的还原的cys-gly和氧化的(cys-gly)2混合的50mm半胱氨酸溶液的浊度。4.5小时后在600nm(au)处测量到的浊度
[0145]
cys-肽浓度cys-gly(cys-gly)250mm0.040.0425mm0.260.0410mm0.370.075mm0.581.070mm1.321.32