专利名称:用环糊精制成的7-异丙氧基异黄酮包藏复合物的制备方法
本发明涉及用任何种类的环糊精形成的7-异丙氧基-异黄酮包藏复合物。在本发明的包藏复合物中，分子量约为10，000的α、β、或γ环糊精、heptakis-2，6-氧-二甲基-或heptakis-2，3，6-三-氧-甲基-β环糊精或任何水溶性β-环糊精聚合物均可用来作为环糊精衍生物。
此外，本发明还涉及含有7-异丙氧基-异黄酮包藏复合物作为活性组份的药物组合物，这些包藏复合物是用任何一种环糊精衍生物形成的。
从口服的本发明药物组合物中，伊普尔异黄酮(7-异丙氧基-异黄酮)以未代谢形式药理活性浓度被吸收並可以在血液中检测。
这种伊普尔异黄酮的制备在英国专利1360461说明书中作了描述，该化合物的特征如下分子量280.3;熔点112-118℃;25℃时水中的溶解度1-2微克/毫升。这种化合物难溶于丙酮，而在氯仿和二甲基甲酰胺中是易溶的。
已知片剂洋波拉泼(Yambolap)含有200毫克作为活性成份的伊普尔异黄酮，用来治疗骨质疏松和骨软化症。可是由于它们可溶性和吸收极差，治疗效果並不理想。
给小猎兔犬服用放射性示踪伊普尔异黄酮並测定排放出的该放射性物质的量，发现所服用的放射性物质仅有12%随尿排出。血液的高压液相色谱表明在血液中出现了它们的代谢产物(7-羟基-异黄酮是主要的代谢物)。
已经作出不同的努力来增加伊普尔异黄酮和它的主要代谢产物(7-羟基-异黄酮)的再吸收。在欧洲专利0129893说明书中公开了，溶解度差的药物成份如果与惰性载体一起研磨，就增加了药物成份的吸收和溶解度。例如，把2克伊普尔异黄酮与2克硅胶或2克活性碳或2克活化了的粘土或2克活化的氧化铝一起放在摇摆式钢球磨机中研磨10-60分钟，所得到的产品的溶解度，即带有硅胶的情况下，在37℃50%含水甲醇中30分钟后为20.4微克/毫升，而未研磨过的混合物的溶解度仅为15.0微克/毫升。因此，在体外溶解度的增加达到了1.36倍。分析狗口服药物后的血液水平，在血液中没有检测到伊普尔异黄酮，于硅胶一起研磨，其主要代谢物的吸收作用从0.152微克·小时/毫升增加到0.485微克·小时/毫升，相当于增加了3.19倍。
众所周知各种药物组合物和杀虫剂的不同的不稳定和易挥发的活性成份，如果与环糊精形成“分子胶囊”时就成为稳定的结晶体，从药剂学观点来看，最重要的效果是难溶于水的各种活性成份的包藏复合物变得水可湿性，他们很容易被分散，因此就易于在水中溶解。它们的溶解度和吸收作用一般比游离的、非复合活性成份高出1.3-3倍。(W.F.Smolen和L.A.Ball受控制的药物生物利用率，第3卷365页，John Wiley，纽约，1985)。
我们意外地发现，在施用本发明的包藏复合物后，体外伊普尔异黄酮的溶解度与施用伊普尔异黄酮本身相比高10倍，其主要代谢物的血液水平高15-20倍，以未改变形式的和以药理有效浓度的伊普尔异黄酮的吸收同样可达到。
用环糊精-葡糖基转移酶可由淀粉制备环糊精。存在有三种不同种类的环糊精，即α、β，和γ环糊精，它们是由与α-1，4糖苷链连接的6、7或8个吡喃葡糖单元组成的。这三种环糊精的分子量、水溶性和空心直径是不同的。因此，他们可与大多数不同类型的化合物形成包藏复合物。但同一化合物与不同种类的环糊精形成的包藏复合物具有很不相同的特性，有可能用适当的取代物来对环糊精分子进一步修饰。例如，在二甲基-β环糊精(DIMEB)的情况下，每个葡萄糖单元的两个羟基基团被甲基化，而在三甲基-环糊精(TRIMEB)的情况下，所有的羟基基团均被甲氧基取代。这些化合物的溶解度要好得多。它们形成配合物的能力也与未取代的环糊精不同。
对于环糊精来说，其一般特征为，分子的外表面是亲水的，而内表面是非极性的，並由于其外部空间的大小使得它能包藏适当的“客分子”。用这种方法能实现所谓的“分子胶囊”。
伊普尔异黄酮和环糊精之间形成包藏复合物的证据之一是环糊精增加了伊普尔异黄酮在水中的溶解度。为了确定这一特性，将10毫克的伊普尔异黄酮、不同量的环糊精和5毫升的蒸馏水放入10毫升的试管内，密闭后，于25℃下，以325转/分的速度搅动试管4天，然后在G4玻璃过滤器中过滤试样，滤液在50%含水乙醇溶液中作光度分析，结果示于表Ⅰ
表Ⅰ于25℃在不同浓度的不同环糊精溶液中确定的伊普尔异黄酮的溶解度(微克/毫升)环糊精 α β γ毫克/毫升 环糊精 环糊精 环糊精 DIMEB TRIMEB1 2.523 7.03 22.05 11.44 40.67 15.93 59.19 19.51 77.511 4.12 15.22 2.02 96.2 8.2313 4.68 15.48 2.05 114.8 9.8815 5.08 15.75 2.16 191.3 11.3220 6.10 13.46 2.38 284.4 14.7130 8.19 7.59 2.74 416.8 26.8240 9.63 6.20 3.26 588.2 43.9150 10.61 5.44 3.04 761.0 61.370 14.77 6.08 3.64 1118 96.290 18.24 6.93 4.51 1142 127.5100 21.63 6.64 4.76 1654 179.0110 19.02 5.98 5.12 1824 218.8120 23.65 5.66 5.48 2012 269.3150 2024 435.6
25℃时伊普尔异黄酮在蒸馏水中的溶解度为1-2微克/毫升。从表1的数据中显然可看出，伊普尔异黄酮的溶解度在β环糊精溶液中能增加。取决于β环糊精的浓度，最多可达在蒸馏水中测得的溶解度的15倍。如果β环糊精浓度增加到1%，伊普尔异黄酮的溶解度大约增加到16-20微克/毫升。但进一步增加环糊精浓度，溶解度则先保持恒定，然后当环糊精浓度超过1.8时，溶解度开始减少。当悬浮液中环糊精浓度超过4%时，溶解度达到6微克/毫升的恒定值。这个值被认为是有过量伊普尔异黄酮存在下形成的固体包藏复合物的溶解度的极限值。
在γ环糊精溶液中，溶解度並不显著增加，仅仅可增加3倍。
在α环糊精情况下，伊普尔异黄酮的溶解度在12%的溶液中增加到20-22微克/毫升，意外地，在这种溶液中改变了伊普尔异黄酮的紫外光谱。
利用TRIMEB或DIMEB，观察到溶解度仍然大幅度增加，增加环糊精衍生物的浓度时，伊普尔异黄酮的溶解度几乎是线性增加的。在15%的TRIMEB溶液中溶解度是440微克/毫升，在15%DIMEB的溶液中可得到1700-2000微克/毫升的溶解度。相当于溶解度分别增加了300倍和1770倍。
总结上述结果，本发明的伊普尔异黄酮包藏复合物的溶解度(与活性成份有关)比伊普尔异黄酮本身4倍还大。老鼠口服后，其吸收与以同样剂量服用该游离活性组份后测得血液水平相比至少好10倍。未改变的7-异丙氧基-异黄酮水平至少为总的可再吸收物质的25%。
当7-异丙氧基-异黄酮在任何含水的有机溶媒中与环糊精衍生物起反应时，可以制备本发明的包藏复合物。醇或酮可作为有机溶剂使用。最好这二组份在含水乙醇溶液中反应，乙醇浓度最好为50%，然后通过冷却分离得到结晶产品。
可以选择的另一个方法是，将这两种组份在含水丙酮介质中混合，並蒸发该溶剂。利用DIMEB或TRIMEB或可溶环糊精聚合物时，通过蒸发、喷干、冻干或在DIMEB的情况下通过加热该溶液从反应混合物中分离得到固体粉末状的产品。
在下面非限制性的实例中详细地说明本发明。
制备环糊精-伊普尔异黄酮包藏复合物的例子实例1制备摩尔比为1∶2的伊普尔异黄酮-β环糊精包藏复合物把11.0克(39.2毫摩尔)的伊普尔异黄酮和114.3克(88.3毫摩尔)含水量为12.36%的β环糊精溶解到2.25升按体积计为50%的含水乙醇溶液中，在80℃和剧烈搅拌下，使之冷却至室温，过滤析出的结晶产品，在60℃下干燥24小时，得到96.4克松散的白色粉末。颗粒度小于90微米。伊普尔异黄酮含量10.8%(重量)，伊普尔异黄酮β环糊精比率＝1∶2;涉及活性成份的得率为94，7%为了证明以上产品确实是一个包藏复合物，已经进行了不同的热分析，X射线衍射分析、和溶解分析。
机械混合物和游离组份的热分析的特性几乎是相同的，只有在环糊精分解的同时才能观察到由于加热而引起该复合物的变化。在用差分扫描测热法(DSC)于115℃下测试机械混合物时，对应于伊普尔异黄酮的熔点出现一个吸热峰值，而在该复合物情况下观察不到吸热值值。机械混合物根据其伊普尔异黄酮含量，在130℃-250℃之间显示出一个连续的质量损失，而在复合物的情况下在相同的温度区域内观察不到质量损失或释放出有机物质(热析出分析TEA)。
机械混合物的X射线粉末衍射图由其组份粉末图的叠加而成。而复合物的粉末图含有更少的峰和表示该复合物特征的、与β环糊精(2Q°＝4.5;10.6;12.3)和伊普尔异黄酮出现的(2Q°＝5.8;11.5;15.5;17.3;22.0)特征峰不同的一些新峰(2Q°＝6.7;7.8;20.9)。这证明是一个新的晶体结构，所以间接证明形成了包藏复合物。
为了进行溶解试验，将250毫升的蒸馏水放500毫升的烧瓶内，加热到37℃，然后加入相当于50毫克活性成份的这种产品，这样得到的悬浮体用磁性搅拌器以1000转/分进行搅拌。以固定的间隔取出2-6毫升试样。在玻璃滤器中过滤，稀释后，在水∶乙醇比为1∶1的混合液中测定该溶液的光度。
所获得的结果总结在表Ⅱ中表Ⅱ伊普尔异黄酮，按实施例1制备的伊普尔异黄酮-β环糊精包藏复合物及伊普尔异黄酮与β环糊精的混合物于37℃在250毫升蒸馏水中的溶解作用时间 溶解的伊普尔异黄酮的浓度微克/毫升(分钟) 伊普尔异黄酮 伊普尔异黄酮- 伊普尔异黄酮(50.5毫克)51.5毫克 β环糊精包藏复 +环糊精(444.7毫克)合物471.5毫克1 0.435 13.21 0.4422 0.327 9.26 0.4623 0.401 8.03 0.7265 0.507 7.36 1.2010 0.882 7.62 2.2815 1.123 7.43 3.2120 1.197 7.89 4.6930 1.423 6.89 5.8640 1.508 7.11 6.0760 1.621 6.81 6.2790 1.525 6.89 6.34120 1.482 6.94 6.37
游离活性成份的溶解相对地比较慢，40-50分钟后才达到的伊普尔异黄酮的饱和值(约为1.5微克/毫升)。在含有伊普尔异黄酮-β环糊精包藏物的试样情况中，1分钟之后得到伊普尔异黄酮溶解的最大浓度，即活性成份立即溶解，也就是发生急骤溶解。此外，在一开始，活性成份的浓度是饱和值2倍这样高。伊普尔异黄酮和β环糊精混合物的溶解较慢，只有在30-40分钟后，被溶解的活性成份的浓度才趋于包藏复合物时的浓度值。
还测定了不同pH值下该活性成份的溶解过程，在pH＝1.3(相应于胃酸，HCl)和pH＝7.6(相应于肠内pH值磷酸盐缓冲液)下得到的溶解曲线与在蒸馏水中得到的溶解值並没有什么显然不同，因此，在试验的pH范围内，活性成份的溶解与pH无关。
实例2制备摩尔比为1∶2的伊普尔异黄酮-γ环糊精包藏复合物把0.5克(1.78毫摩尔)的伊普尔异黄酮溶解到50毫升96%的乙醇中，把这样得到的溶液在二小时中一滴一滴地加入到在50毫升蒸馏水中的8.0克(5.35毫摩尔)含水量为13.3%的γ环糊精中;然后将该混合物冷至室温，进一步充份搅拌16小时后，过滤所得产品，在60℃下干燥24小时，得到5.5克产品。伊普尔异黄酮含量7.9%(重量)，伊普尔异黄酮γ环糊精的摩尔比为1∶2.29，有关活性成份的得率87%，该产品还含有游离环糊精。
实例3制备摩尔比为1∶2的伊普尔异黄酮-α环糊精包藏复合物在一只有塞研钵中将0.5克(1.78毫摩尔)的伊普尔异黄酮溶解于10毫升丙酮中，然后加入4.0克(3.70毫摩尔)含有10%重量百分比水份的α-环糊精和2毫升蒸馏水。用持续摩擦来均化该轻悬浮体，直到溶剂被蒸发掉，再在60℃下干燥所得产品24小时，产品含有11.1%的活性成份，还含游离的α环糊精。伊普尔异黄酮与α环糊精的摩尔比为1∶2.1。
含有伊普尔异黄酮-环糊精包藏复合物作为活性成份的药物组合物的配制例和生物试验。
实例4在37℃下，在500毫升胃液中用Erweka ZT-4仪比较下列片剂的溶解性已知的含有7-异丙氧基-异黄酮200毫克的波拉泼片(A);按实施例1制备的含有40毫克β环糊精包藏复合物形式的伊普尔异黄酮片剂(B)和含有200毫克伊普尔异黄酮和330毫克β环糊精混合物的片剂。把一片药片放入该设备中并在247毫微米处通过分光光度法测定被溶解物质的量。
被试的片剂其组成如下片剂A(已知的片剂洋波拉泼，K-020484)伊普尔异黄酮 200毫克玉米淀粉 36毫克乳糖 60毫克聚乙烯基吡咯烷酮 13毫克Esma Spreng 30毫克滑石 7毫克硬脂酸镁 4毫克350毫克片剂B伊普尔异黄酮 200毫克β环糊精 330毫克聚乙烯基吡咯烷酮 20毫克550毫克溶解试验的结果总结在表Ⅲ中表Ⅲ从各种片剂中溶解的活性成份的量时间 被溶解的活性成份的量(毫克)(分钟) A B C2 - 0.80 -5 0.21 1.05 0.2710 0.45 1.10 0.5015 0.58 1.15 0.6030 0.56 1.15 0.6560 0.61 1.30 0.75120 0.60 1.30 1.00180 0.62 1.40 1.15试验结果表明，从该常规片剂中，只溶解出0.62毫克伊普尔异黄酮，而在与这种常规片剂活性成份含量相比只有其五分之一的以β环糊精包藏复合物形式为活性成份的片剂中，被溶解的活性成份量却翻了一倍，而且在2分钟后其溶解量就已超过常规片剂溶解量最大值的30%。在含有伊普尔异黄酮和β环糊精机械混合物的片剂中，溶解作用比较慢些，但尽管如此，被溶解的活性成份还是高于该常规片剂。
采用170-200克重的CFY雄性大鼠进行吸收试验。在禁食16小时后，按剂量25毫克/公斤分A组伊普尔异黄酮;B组按实例1方法制备的伊普尔异黄酮-β环糊精包藏复合物和C组伊普尔异黄酮+β环糊精混合物，后两种药物中含有等摩尔的β环糊精和活性成份。在给药后，让鼠随意进食水和食物。
试验药物需在2毫升1%的甲基纤维素溶液中混合5分钟然后通过胃管给药，用乙醚麻醉动物，切断股静脉使动物致死性出血，采集10、30分钟和1，2和4小时的血浆样品。将血样注入装有肝素的管中离心、真空吸滤並深度冷冻储藏备用。
为了采集尿样，在处理后把动物置于单独的代谢罐并分别收集24小时内的尿和粪便。尿样需要深度冷藏备用。尿样和血浆样品中的未变化的伊普尔异黄酮和其主要代谢产物(7-羟基-异黄酮)的浓度通过高压液相色谱测定。
采用RP-18型液相色谱仪和LiChrosorb逆向柱(颗粒大小对于血样10微米，对于尿样5微米)进行高压液相色谱分析。洗脱液流速1.5毫升/分钟，紫外探测器波长254毫微米。纸速0.2厘米/分钟。
对于血样所用洗脱液为0.05M的乙酸盐缓冲剂(pH＝3)∶乙腈＝60∶40的混合物。对于尿样所用洗脱液为乙酸盐缓冲液与乙腈比例为55∶45的混合物。内标物为2-甲基-7-甲氧-4′硝基-异黄酮乙醇溶液(100微克/毫升)，校准采用含有7-羟基-异黄酮100微克/毫升和10微克/毫升的甲醇溶液。
为分析血浆样品，需向1毫升血浆中加入1毫升乙酸盐缓冲剂(pH＝5)和用10微升蒸馏水稀释10倍的β-葡糖苷酸酶(芳基-磺化酶)(100FU)，然后在37℃保温24小时，保温后加入50微升2当量浓度的NaOH，用苯萃取该混合物并离心分离。分离有机相，水相用400毫升1当量浓度HCl使之呈酸性，在加入50微升内标物溶液后再用8毫升苯重复萃取。将有机相离心分离，蒸发、把残余物溶于100微升洗脱液中，注入50微升该溶液进行测定。
校准曲线方程y＝8.2X-0.08;相关系数0.9999。
为分析尿样，需向0.5毫升尿中加入0.5毫升乙酸盐缓冲剂(pH＝5)和10微升β-葡糖苷酸酶(芳基磺化酶)1000FU。然后用8毫升苯进行萃取，並离心分离，分离有机相，水相用400毫升1当量浓度HCl使之呈酸性，加入50微升内标物溶液后，再用8毫升苯进行萃取。将有机相离心分离并蒸发，把残余物溶于100微升洗脱液，注入10微升该溶液到液相色谱仪中。
标准曲线方程y＝0.911X-0.09，相关系数0.9995。
表Ⅳ和Ⅴ分别表示了动物血液中测定的未变化的伊普尔异黄酮浓度值和主要代谢产物的浓度值。给药按照A组为伊普尔异黄酮本身;B组为本发明的包藏复合物和C组为伊普尔异黄酮和β环糊精的混合物。
表Ⅳ等剂量口服给药后的时间与未变化的伊普尔的血浆水平值微克/毫升A B C时间 伊普尔异黄酮 按实例1制备的 伊普尔异黄酮与β(小时) 包藏复合物 环糊精的混合物0.17 0 0.065 0.4790 0.055 00 0.073 00.5 0 0.468 00 0.149 00 0.194 01 0 0.271 00 0.354 00 0.294 02 0.078 0.514 0.0810 0.402 00.095 0.214 04 0.041 0.148 00 0.363 00 0.054 024 0 0. 00 0 00 0 0
表Ⅴ等剂量口服给药后的时间与主要代谢产物(7-羟基-异黄酮)的血浆水平值 微克/毫升时间 A B C(小时) 伊普尔异黄酮 按实例1制备的 伊普尔异黄酮与包藏复合物 β环糊精的混合0.17 0.156 - 2.0800.265 2.450 0.4570.195 3.650 0.7670.5 0.860 12.270 0.3040.591 4.480 0.3740.365 - 0.3581 0.239 12.190 0.3060.790 4.330 -0.340 3.870 0.2742 1.218 22.040 0.2700.715 - 0.3581.093 3.780 0.8264 0.220 1.740 -0.237 - 0.1300.235 2.520 0.33024 0 0 00 0 00 0 0
只有B组在每个时期都可以测出未变化的伊普尔异黄酮量，其范围在50-500毫微克/毫升，A组与C组相似，仅在很少几个时期(在2小时和4小时)可以测出未变化的伊普尔异黄酮的量。至于主要代谢产物。在各个时期内B组中的血浆水平都比同时期里的A组和B组高10-20倍，即B组的值在3-20微克/毫升而在A组和C组情况中仅有0.2-1.0微克/毫升，不论哪一种情况，在血浆曲线的2小时时间处都出现一个第二峰值，这可能是由于强烈的肠肝循环和小肠更好的再吸收的结果。
表Ⅵ为尿样的高压液相色谱分析结果。在0-24小时内，尿样测不到未变化的伊普尔异黄酮，然而可以测到所有时期的主要代谢产物的量。7-羟基-异黄酮的平均值为952微克，相应的比其他组高3倍。按照我们的经验，主要代谢产物占全部代谢产物总量的50-55%，所以实际上随尿排泄的总量应是测定量的2倍。基于这种考虑，随尿排出的量B组占给药剂量的40%，A组和C组仅为10-14%。
上述事实可以证明，用伊普尔异黄酮-β环糊精包藏复合物对大鼠给药后，血浆水平值与实验对照组相比增加到10-15倍，随尿排泄物的量比实验对照组高约3倍。
表Ⅵ经口服给药等剂量药物后所测得的随尿排泄的主要代谢产物(7-羟基-异黄酮)的量动物号 排泄物总量 以剂量的百分比表示微克 的该排泄物的量 D%D%A伊普尔异黄酮 1 236.4 9.442 344.4 13.77 11.343 270.4 10.81B按实例1制备 4 925.4 37.01 38.09的包藏复合物 5 978.9 39.16C伊普尔异黄酮 6 341.6 13.66与β环糊精的 7 494.3 19.77 13.33混合物 8 163.9 6.5权利要求
1.由7-异丙氧基-异黄酮与任意一种环糊精或其衍生物形成的包藏复合物。
2.由7-异丙氧基-异黄酮与α环糊精形成的包藏复合物。
3.由7-异丙氧基-异黄酮与β环糊精形成的包藏复合物。
4.由7-异丙氧基-异黄酮与γ环糊精形成的包藏复合物。
5.由7-异丙氧基-异黄酮与heptakis-2，6-氧-二甲基-β环糊精形成的包藏复合物。
6.由7-异丙氧基-异黄酮与heptakis-2，3，6-三-氧-甲基-β环糊精形成的包藏复合物。
7.由7-异丙氧基-异黄酮与分子量大于10.000的水溶性环糊精聚合物形成的包藏复合物。
8.由7-异丙氧基-异黄酮与任意一种环糊精形成包藏复合物的方法，其中包括在水-有机溶媒中进行7-异丙氧基-异黄酮与任意一种环糊精的反应。
9.药物组合物，其中含有由7-异丙氧基-异黄酮与任意一种环糊精形成的包藏复合物为活性成份。
专利摘要
本发明是关于一种由7-异丙氧基-异黄酮与环糊或环糊精衍生物形成的包藏复合物，以及以该包藏复合物为活性成分的药物组合物，本发明还涉及该新的包藏复合物的制备。
文档编号A61K47/34GK86106889SQ86106889
公开日1987年7月15日 申请日期1986年9月9日
发明者艾格尼斯·斯塔德勒·尼·索克, 佐茨斯弗·西杰特里, 维克多·韦斯非勒, 佐尔坦·瓦格, 卡塔林·卡洛伊, 维拉·格哥里, 塔玛斯·舒茨 申请人:奇诺英药物化学工厂有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan