专利名称:新的重组基因及其应用的制作方法
本发明涉及一些编码像药剂等一样适用的沙雷胃蛋白酶(国际非专利名称)的或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的具有抗炎性的多肽的DNA及其使用。
常规生产像抗炎剂等一样适用的沙雷胃蛋白酶的方法包括培养沙雷氏(Serratia)菌在内的方法(参阅美国专利3691014号)然而沙雷胃蛋白酶基因未曾被克隆，故一直采用基因技术生产沙雷胃蛋白酶。
使用基因增殖作用可望在用培养沙雷氏菌生产沙雷胃蛋白酶时会提高沙雷胃蛋白的酶的产量。另外有人认为减少用沙雷氏菌生产沙雷胃蛋白酶同时产生的像DNA酶之类的蛋白质可简化沙雷胃蛋白酶的纯化过程。
本发明者发现，带有含有从产生沙雷胃蛋白酶的沙雷氏菌Serratia染色体DNA而得的沙雷胃蛋白酶基因的克隆DNA的质粒的一个转化株，能生产显著数量的沙雷胃蛋白酶和一种具有像沙雷胃蛋白一样的抗炎性的多肽。
本发明人根据这些发现作了进一步的研究，并推进了本发明。
本发明提供一种编码沙雷胃蛋白酶多肽或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎剂性的一种多肽的一种DNA，一种含有上述DNA的质粒，一种带有上述质粒的转化株，一种具有图3(Ⅶ)所示的，从第(1)-(470)位的氨基酸顺序的、其N末端可能有蛋氨酸的多肽，以及提供了它们的生产过程和使用情况。本发明还进一步提供出一种DNA，它具有的碱基顺序表示如下式
ATG TCT ATC TGT CTG ATT GAT ATC AATCAG GTA ATG AGT GGA ATC GAA CCA ATGCAA TCT ACT AAA AAG GCA ATT GAA ATTACT GAA TCC AAC TTC GCG [Ⅷ]或上述碱基顺序的一部分，一种以下式表示的多肽蛋-丝-异-半-亮-异-天-异-天酰-谷酰-缬-蛋-丝-甘-异-谷-脯-蛋-谷酰-丝-苏-赖-赖-丙-异-谷-异-苏-谷-丝-天酰-苯-丙 〔Ⅸ〕上述多肽的一部分，或是一种在上述多肽或上述部分多肽取代，插入，添加或者消去某些氨基残基而成的多肽，以及利于用它来生产像蛋白酶之类的重组蛋白质的生产及其使用情况。
至于编码沙雷胃蛋白酶多肽密码的或者编码具有像上述沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性的多肽密码的DNA，可以列举的有一种DNA是与具有式(Ⅰ)碱基顺序的DNA杂交;或者还有另一种DNA是与具有式(Ⅱ)碱基顺序的DNA杂交，5′ACTTTGTAX1CCGTCCCAX2GTTTGGTTTTC3′[Ⅰ]式中，X1表示T或G，X2表示T或G，5′TCY1TGY2CCY3TGCCA3′[Ⅱ]式中，Y1代表T或C，Y2代表A，G，T或C，Y3代表T或C。
还可作实例说明的是具有图3所示，其5′-末端上有ATG及其3′-末端上有TAA，TAG及TGA三种以外的一种或两种终止密码子〔Ⅲ〕的第731至2236位碱基顺序的一种DNA，以及另一种具有图3所示的其中5′-末端上有ATG或氢原子及其3′-末端上有TAA，TAG及TGA三种以外的一种或二种终止密码子〔Ⅳ〕的第827～2236位碱基顺序的DNA。这种DNA〔Ⅳ〕亦可有其5′-及3′-末端碱基顺序如在图3〔Ⅴ〕所示的第1-2570位一样的碱基顺序。这些DNA也可是上述碱基顺序的一部分，或是从上述碱基顺序中，或其中的一部分的碱基顺序中取代，插入，添加或消去某些碱基获得的一碱基顺序。
上述这种DNA可以编码含有下式的一个氨基酸顺序的多肽的密码组-谷-异-甘-组-丙-亮-35至45氨基酸残基-甘-天-天酰-甘-甘-组-酪--70至80氨基酸残基-亮-天酰-谷-赖-丝-苯-丝-天-缬-甘-甘，或可编码含有从上述氨基酸顺序中取代，插入，添加或消去某些氨基酸残基而得的一个氨基酸顺序。
前面指出的这种取代，插入，添加和消去作用是例如以下的方法异会被亮或蛋取代，异-甘-组会被异-苏-组取代，组-丙-亮会被组-甘-亮，组-丙-缬，或组-甘-缬取代，甘-组-酪会被甘-缬-组-酪取代，以及谷-赖-丝-苯会被谷-丝-苯或者谷-丝-异取代。
例如，前面指出的这种多肽可具有如图3所示的一个第(176)～(315)位的氨基酸顺序或如图3所示的第(146)～(365)位的氨基酸顺序。
例如，具有如图3所示的第(-33)～(470)〔Ⅵ〕位的或第(1)～(470)〔Ⅶ〕位的一个氨基酸顺序的多肽也许可看作是整个氨基酸顺序。
〔Ⅲ〕或〔Ⅴ〕式表达的碱基顺序或它们的部分顺序亦能通过碱基的取代，插入，添加和消去作用的复合而获得。
〔Ⅵ〕或〔Ⅸ〕式表达的多肽或它们的部分多肽亦能通过碱基的取代，插入，添加和消去作用的复合而获得。
应该注意在本说明书里沙雷胃蛋白酶或者具有像沙雷胃蛋白的酶一样的抗炎性的多肽，在某些情况下都被称为“沙雷胃蛋白酶”。
此外，在某些情况里，编码沙雷胃蛋白酶或者编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性的多肽密码的DNA都称为“沙雷胃蛋白酶基因”。
这种编码沙雷胃蛋白酶或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性的多肽密码的DNA，能从像沙雷氏菌属的产沙雷胃蛋白的酶的细菌的染色体DNA获得。
能使用的沙雷氏菌品系包括粘质沙雷氏菌Serratia marcescens.下面提出具体的实例粘质沙雷氏菌Serratia marcescens.ATCC21074，S.marcescens IF03046，S.marcescens IF03735等都能使用。
上述ATCC21074品系从1967年5月15日起已在美国模式菌种收集处注册，并列于1985年16版的美国细菌，噬菌体及rDNA载体模式菌种收藏目录内。
上述IF03046及IF03735品系已编入大阪发酵研究所(IFO)1984年出版的第七版的大阪发酵研究所培养物目录。
从沙雷氏菌的菌胞制备染色体DNA的方法目前是不受专利权限制;它能用Lovett等人的方法〔酶学方法68卷342页(1979)〕进行。
按前面所说那样获得的染色体DNA随后用一种限制性内切酶切割，用限制内切酶部分地分解而得的片段亦能用作染色体DNA。
这样得到的染色体DNA片段随后被用DNA连接酶接到载体DNA上。
用得最普遍的载体包括从ColEl衍生的质粒pBR322〔参阅基因，2卷95页(1977)〕，pBR325〔参阅基因，4卷，121页(1978)〕，pUC12〔Vieira，J.及Messing，J.，参阅基因，19卷，259页(1982)〕，及pUC13〔参阅基因，19卷，259页(1982)〕;然而，任何它的质粒，只要它是保持在寄主内复制的亦能使用。
上述的连接进行如下载体DNA先用限制内切酶切割。通常使用限制性内切酶在某点上切割载体DNA是可取的。能以常规的方法进行上述的切割。
使用DNA连接酶，能以常规的方法将上述的染色体DNA片段接到载体DNA上面。
随后，从如上所得的一些重组体DNA中选出需要重组体DNA。任何寄主载体系统，只要在连接染色体DNA片段到载体之后，通过转化作用而检测到有沙雷胃蛋白酶基因在这个染色体DNA片段上存在的都能使用。例如，能够使用大肠杆菌Escherichia coli寄主-载体系统。更具体地说大肠杆菌按照常规方法转化，例如按照在美国国立科学会议录有时简称Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)69卷2110(1972)所介绍的，使用将染色体DNA片段接连到如上所介绍那样得到的载体而获得的重组体DNA的方法。转化株的筛选可按所用质粒的抗药性来实现。例如，当pBR322作载体使用时能用抗氨比西林或抗四环素作为选择标准。
此外，较理想的克隆能够通过常规的方法作次级筛选，从先前获得的抗药性转化株选得。例如菌落杂交法〔Grunstein-Hogness氏方法;美国科学院会议录72卷，3961页(1975)〕，该方法是使用化学合成的带标记32P的寡核苷酸，其碱基顺序被认为与沙雷胃蛋白酶的氨基酸顺序相对应，而沙雷胃蛋白酶的氨基酸顺序则是一已知的探查物。
能用作探查物的DNA包括一种DNA，其碱基顺序是按Lee，I.S.等人的报导Fedration Proceedings，44卷，3月号1057页(1985)〕从介乎沙雷氏菌蛋白酶第42位与第51位之间(谷-天酰-谷酰-苏-色-天-甘-酪-赖-缬)的氨基酸顺序中推导得到的碱基顺序的转化。其通式表示为5′ACTTTGTAX1CCGTCCCAX2GTTTGGTTTTC3′[Ⅰ]〔式中，X1代表T或G，X2代表T或G.〕。能用作探查物的DNA还包括一种DNA，其碱基顺序是从所述沙雷氏菌蛋白酶第143～147位之间(色-谷酰-甘-谷酰-天)的氨基酸顺序倒推断而得的。其通式表示为5′TCY1TGY2CCY3TGCCA3′[Ⅱ]代表，〔式中，Y1是T或C，Y2是A，G，T或C，Y3是T或C〕。
〔Ⅰ〕式及〔Ⅱ〕式代表的DNA都能用于复合。
通过使用这些探查物的菌落杂交克隆而得的DNA的碱基顺序是用Maxam-Gilbent的方法〔美国科学会议录74卷560页(1977)〕或者用双脱氧法〔Messing，J.等人;核酸研究，9卷309页(1981)〕来测定，并且和已知的氨基酸顺序相比较以检测这种沙雷胃蛋白的酶基因。当编码这种沙雷胃蛋白的酶基因的这一区域未完全复盖时，就要用从可靠的克隆里获得的克隆了的片段重行克隆作为制备一个含有所有沙雷胃蛋白的酶基因编码区的DNA片段的一个新保证。
从如上所得的转化株，采用在核酸研究，7卷，1513页(1979)所说的方法进行的质粒提取以获得理想的其上整合有编码沙雷胃蛋白酶或编码具有类似沙雷胃蛋白酶一样抗炎性的多肽的DNA的质粒。
确切地说，具有〔Ⅴ〕式表示的碱基顺序的DNA能够像在较好的实施例里的所表明的那样用限制性内切酶PstI部分地分解质粒例如pTsP25质粒而产生。
具有分别由〔Ⅲ〕式，〔Ⅳ〕式及〔Ⅷ〕式所表示的碱基顺序的一些DNA，能够用限制性内切酶切割片段的和用连接酶连接片段的，以及在必要时使用化学合成的DNA片段用上述质粒作材料进行复合等常规方法产生。整个顺序用化学合成亦是可能的。
部位定向诱发发生法〔酶学方法，100卷，468页(1983)，纽约学术出版社〕普通用来在碱基顺序中取代，插入，添加和/或消去最少一个碱基。
编码〔Ⅵ〕式所表示的多肽，部分上述多肽，或从在上述多肽或上述部分多肽上至少取代，插入，添加或消去一个氨基残基而得的多肽的DNA亦能够用上述方法产生。
所得的这种编码沙雷胃蛋白酶或编码具有像沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性的多肽的DNA能够在产生沙雷胃蛋白酶或者在产生具有像沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性的多肽中当作结构基因使用。
此外，按前面介绍的那样获得的这种编码〔Ⅵ〕式所表示的多肽，部分上述多肽，或者编码从上述所得的多肽或上述部分多肽中至少取代，插入，添加或消去一个氨基残基而得的多肽的DNA能在产生上述多肽中当作结构基因使用。
一个转化株是使用按前面介绍的方法获得的质粒产生的，其内有编码沙雷胃蛋白酶或编码具有像沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性的多肽的DNA。
以下各物例如像埃希氏菌Escherichia，沙雷氏菌Serratia，芽胞杆菌Bacillus及酵母之类的微生物;以及像动物细胞之类的真核细胞都能用作产生这种转化株的宿主。
能用作宿主的埃希氏菌包括大肠杆菌Escherichia coli。具体地说是大肠杆菌E.coliDHI品系〔参阅自然，217卷1110页(1968)〕E.coliJM103品系〔参阅核酸研究，9卷，309页(1981)〕E.coli JA221品系〔参阅分子生物学杂志120卷517页(1981)〕，E.coli RRI品系〔参阅酶学方法，68卷，262页(1979)〕。
能用作宿主的沙雷氏菌Serratia包括粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，具体地说是，S.marcescensIFO3759.S.marcescens ATCC21074S.marcescensIFO3046，S.marcescensIFO3735.S.marcescens NO.87及S.marcescens Nc-4。
上述粘质沙雷氏菌S.marcescens IFO3759品系从1958年9月23起就存于大阪发酵研究所(IFO)，而且编入由该所1984年出版的大阪发酵研究所培养物的第七版目录里，其细菌学上特征与在细菌学杂志11卷76～77页(1926)所描述的一样。
上述粘质沙雷氏菌S.marcescens ATCC21074品系的细菌学上的特征在美国专利3691014号上描述过。
上述粘质沙雷氏菌S.marcescens87号品系及S.marcescens NC-4品系已用IFO14454存贮号及IFO14504存贮号从1985年5月5日及1986年4月17日分别地存入大阪发酵研究所;这些微生物已经分别地根据布达佩斯条约从1985年11月7日及1986年5月29日用FERM BP-1181及FERM BP-1182的存贮号存入日本通商产业省，工业科技总暑发酵研究所(FRI)以及分别地以存贮号-及-存入CCTCC。
上述S.marcescens 87号及S.marcescens NC-4的细菌特征与在Bergey′s细菌学鉴定手册，第8版上所描述的一样。
能用作宿主的芽孢杆菌Bacillus包括枯草芽孢杆菌Bacillus sud-tilis，具体地所是B.sudtilis MI 114〔基因，24卷，255页(1983)〕。
能够用作宿主的酵母菌包括啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae AH22R〔美国科学院会议录，80卷，第1页(1983)〕。
能够用作宿主的动物细胞包括老鼠L细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以及COS细胞。
能够用来转化上述埃希氏菌或沙雷氏菌的不受版权限制的方法，例如，在美国科学院会议录，69卷21110页(1972)，基因，17卷107页(1982)等所介绍的方法。
根据不受版权限制的方法，像分子遗传学与普通遗传学168卷111页(1979)等所介绍的方法亦能够转化所述芽孢杆菌Bacillus。
转化像酵母和动物细胞等真核细胞的方法亦见于不受版权限制的地方，例如能够用在美国专利4399216号所介绍的方法。
况且，向宿主引进完整的沙雷胃蛋白酶基因或者引进这基因在被接到适当的启动子顺序下游之后从得到的无性繁殖系上切出的部分，能够提高沙雷胃蛋白酶的表现度。需要时，Shine-Dalgarno顺序(SD顺序)就能在启动子的下游插入。
当大肠杆菌Escherichia coli或某一沙雷氏菌Serratia被用作宿主时，一般推荐使用色氨基酸(trp)启动子，衍生噬菌体的PL启动子，乳糖(lac)启动子，蛋白质链延伸因子Tu(tufB)启动子recA启动子等作启动子。
当芽孢杆菌Bacillus被用作宿主时，推荐使用SPO1启动子，Veg启动子，P1启动子〔参阅欧洲专利公开0146901号〕等等。
当某一酵母被用作宿主时，就能用PhO5启动子，GLD启动子，PGK启动子，ADH启动子，PHO81启动子等等。
除此之外，当像某一动物细胞之类的真核细胞被用用作宿主时，任何启动子，只要它适合于宿主种的都可以用。
如前所说，用具有编码沙雷胃蛋白酶的DNA的质粒转化宿主，就获得转化株。
当获得的这种转化株是细菌(埃希氏菌Escherichia，沙雷氏菌Serratia，芽孢杆菌Bacillus)或酵母是时，在培养液里培养这种转化株以便沙雷胃蛋白酶在培养液里积累就有可能产生沙雷胃蛋白酶。
当培养转化株时，其宿主是细菌的话，就建议使用液体培养基，它应含有碳源、氮源，矿物盐及转化株生长所必需的其它物质。能用作碳源的物质包括葡萄糖，糊精，可溶性淀粉及蔗糖;能用作氮源的物质包括铵盐，硝酸盐，玉米浆，胨，干酪素，肉羹，豆饼及其它有机或无机物质;能用的矿物盐包括氯化钙，磷酸二氢钠，氯化镁。酵母提取液，维生素，生长促进因子等亦可以加入。用含有近于0.1%CaCl·2H2O及2%NaH2PO4·2H2O的培养基就特别适于生产蛋白酶。像温度，PH及生长周期之类的培养条件一定要选好以便这种理想的沙雷胃蛋白酶的生产和其活性都处于最高水平。通常较理想的是沙雷氏菌Serratia的培养温度在大约25～35℃，埃希氏菌Escherichia或芽孢杆菌Bacillus大约在20～40℃，培养的PH是微酸至微碱(接近中性更好)，而培养周期大约2天。
当培养其宿主是酵母的转化株时，可用Burkholden基本培养液〔Bostian，K.L.等人，美国科学院会议录，77卷4505页(1980)〕。培养温度一定得在大约15～45℃，最好在24～37℃;培养时间大约得10～96小时，最好24～72小时，必要时得充气，搅拌。
用像动物细胞之类的真核细胞作用宿主所获得的转化株应是以常规培养方法制得以生产沙雷胃蛋白酶。
能使用的培养基包括Eagle氏培养基〔H.Eagle;科学，130卷第432页(1959)〕，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基〔Orgad Laub和William，J.Rutter;生物化学杂志，258.第6043页(1983)〕以及HAT培养基〔Littlefield，J.W.;科学，145卷第709页(1964)〕。
培养应在30～42℃下进行，最好在35～37℃培养大约1～10天。
用常规方法可将积留在细胞里的沙雷胃蛋白酶提取出来，例如，超声分裂法，用法兰西压榨器的分裂法，像研磨之类的机械分裂法，用溶菌酶的酶解等，或者用以酸胍等进行的化学抽提法，然后分离并以无版权限制的纯化方法纯化获得的抽提液或上清液，例如用沉淀器沉淀，等电沉淀，盐析，透析，用像离子交换树脂，凝胶过滤或高性能液相色谱法等的吸附剂吸附。
就是说，通过本发明而获得的含有沙雷胃蛋白酶的液体的沉淀可用磷酸钠，硫酸铵，食盐等盐析，或者用加入像乙醇或丙酮之类的亲水有机溶剂。由于以本发明获得的沙雷胃蛋白酶是稳定的，就可以在减压下浓缩像培养液之类的含有低浓度的沙雷胃蛋白酶液体。其它能够使用的纯化方法包括用磷酸钙，氧化铝，浆土，离子交换树脂等的吸附/脱附;色谱法;用像核酸，鞣酸或钨酸磷之类的蛋白沉淀剂沉淀的;使用重金属盐的杂质分离/去除;等电沉淀及电渗析。
理想的是用本发明所获得的载体具有一个插入的编码信号肽的DNA区域，该信号肽会引起所产的沙雷胃蛋白酶作细胞外分泌，使这种想得到的沙雷胃蛋白酶积存在培养的转化株细胞外面而易于纯化。任何编码这样的信号顺序的DNA区域，只要它们是对宿主适合的都可使用。
此外，推荐使用除沙雷氏菌Serratia之外的其它转化株，因为在培养时培养液里既不产DNA酶也不产其它不想要的蛋白质，因此就易于获得想要的沙雷胃蛋白酶。
当会产生沙雷胃蛋白酶的沙雷氏菌Serratia品系被用作上述的转化株的宿主时，可以通过用本发明来提高其沙雷胃蛋白酶的产率。
如上所述，沙雷胃蛋白酶像一些抗炎剂一样能够使用包括在本发明以内的转化株进行高效能的工业生产。
用本发明包含的方法生产的具有类似沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性的沙雷胃蛋白酶和多肽能够被用来作像美国专利3691014号里所描述的抗炎剂同样的实例。
〔Ⅳ〕式所表示的多肽，其中的一部分或者从上述多肽至少取代，插入，添加或消去一个氨基残基而得的多肽能够用像生产沙雷胃蛋白酶类似的方法生产。这一生产法具有一些像用来生产沙雷胃蛋白酶的方法同样的优点。
由于〔Ⅵ〕所表示的多肽，其中的一部分或者由至少取代，插入，添加或消去一个氨基残基而获得的一些多肽都具有类似沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性，它们能够像使用沙雷胃蛋白酶一样用它作抗炎剂。
人们期望碱基顺序是按〔Ⅷ〕式所表示的顺序或按其中一部分顺序表示的一些DNA在基因工程领域里被用来作为编码信号多肽的基因。因此通过把这个基因连接到上述DNA的下游有可能制造出分泌其产物在细胞外的外源基因。
人们亦期望〔Ⅷ〕式所表示的多肽，它们的一部分，或者在上述多肽取代，插入，添加或消去至少一个氨基残基而得的多肽会在基因工程上被用作信号多肽。
在本说明书里使用的碱基及氨基酸等的缩写是像后面所示那样按照国际纯粹化学和应用化学联合会-国际生物化学联会生物化学命名委员会编写的缩写或者按在相应领域里通用的缩写为基础的。应当指出，当有可能在氨基酸上出现一个光学异构体时，除非另有说明不然的话这个异构体就是L-型。
DNA脱氧核糖核酸 Gln谷氨酰(胺)A腺嘌呤 Glu谷(氨酸)C胞嘧啶 Gly甘(氨酸)G鸟嘌呤 His组(氨酸)T胸腺嘧啶 Ile异(亮氨酸)Ala丙(氨酸) Leu亮(氨酸)Arg精(氨酸) Lys赖(氨酸)Asn天(冬)酰(胺) Met蛋(氨酸)Asp天(冬氨酸) Phe苯(丙氨酸)Cys半(脱氨酸) Pro脯(氨酸)Ser丝(氨酸) Tyr酪(氨酸)Thr苏(氨酸) Val缬(氨酸)Trp色(氨酸)图1～6分别说明由实施例2所得的质粒pTSP20所具的限制性内切酶图谱，由实施例4所得的质粒pTSP21所具的限制性内切酶图谱，由实施例5所得的编码沙雷胃蛋白酶的基因的碱基顺序以及由碱基顺序推断出的氨基酸顺序，由实施例6获得的质粒pTSP26所具的限制性内切酶图谱，以及由实施例8获得的质粒pTSP31所具的限制性内切酶图谱。
从此开始，本发明用较好的具体的一些实施例作更具体的说明。
实施例1粘质沙雷氏菌Serratia marcescens的染色体DNA的分离。
粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074在一个含有40mlL-培养液(pH7.3)的200ml锥瓶里保温28℃生长16小时。L-培养液由1%Tripton(美国Difco实验室)，0.5%酵母提取液(Difco实验室)0.5%NaCl和0/1%葡萄糖配成。将1ml培养得到的培养液接种到在200ml锥瓶里的40mlL-培养液里，在37℃下振荡培养2小时。
离心收集培养物(10ml)的细菌细胞，并用40mMtris盐酸(pH8.5)-25mM EDTA缓冲液冲洗两次，把洗过的细胞悬浮在1ml 40mMtris盐酸(pH8.5)-25mM EDTA缓冲液中，并加入10mg/毫升的溶菌酶溶液0.1ml，在加入后将悬浮液在37℃保温20分钟。然后又加入1ml0.75%Salcosyl，-40mMTris盐酸(pH8.5)-25mM EDTA混合液，65℃下保温8分钟，在这之后再加入0.1ml 5mg/毫升核糖核酸酶溶液，悬浮液在37℃保温30分钟。在37℃保温1小时之前再加入0.1ml 10mg/毫升的链霉蛋白酶溶液。经酚提取之后以乙醇沉淀出DNA。然后将生成的沉淀物溶在0.5ml的40mM Tris HCI(pH8.0)-1mM EDTA(TE缓冲液)的混合液里并在4℃下于同样的缓冲液量渗析2天，得到DNA溶液。
实施例2编码沙雷胃蛋白酶的基因的克隆(A)基因库的制备用10单位限制性内切酶BamH1在37℃下消化2小时1.0微克质粒(PUC12)，然后用0.1单位的碱性酸酶(美国华盛顿公司)在65℃下处理30分钟。经过酚和乙醇提取之后，用乙醇沉淀出DNA。
另外，3微克从实施例1获得的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074的染色体DNA独自地用10单位限制性内切酶BamHl在37℃下消化1小时。随后在65℃用乙醇处理15分钟并沉淀之。
将产获的BamHl酶解过之pUC12(10ng)及BamH1酶解过染色体DNA(40ng)各溶于水后互相合并，在这之后，它们在15℃的一种含有10nMATP，20单位T4DNA连接酶(美国，新英生物实验室)以及一种连接酶缓冲溶液里相互作用16小时。按照在美国科学院会议录，69卷，2110页(1972)上介绍的方法，大肠杆菌Escherichia coli DHI或E.coli JM103可被获得的反应液转化。并产生出大量的抗氨比西林的菌落。
(B)探查物的制备作据Lee，I.S.等人在〔Federation Proceedings，44卷3月号1057页(1985)〕所报导的沙雷氏菌Serratia蛋白酶的氨基酸顺序，按照Crea，R，等人在〔美国科学院会议录75卷，5765页(1978)〕报导的方法分别地化学合成具有通式〔Ⅰ〕所表达的由42～51(谷-天酰-谷酰-苏-色-天-甘-酪-赖-缬)位的氨基酸逆推而得的碱基顺序的DNA，(某-4种化合物的混合物)以及具有通式〔Ⅱ〕所表达的由143～147(色-谷酰-甘-谷酰-天)位的氨基酸(16种化合物的混合物)逆推出的碱基顺序的DNA作为探查物使用。
2μg每种化学合成的寡核苷酸，在50μl含有50mM tris HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM巯基乙醇，40微居里伽马-32PATP以及12单位的T多核苷酸激酶的37℃溶液里保温10分钟，随后，它与2μl0.1mMATP在37℃下相互作用20分钟以便用32P标记其5′末端。
(C)菌落杂交筛选从实施例2(A)获得的大约700抗氨比西林的、对四环素敏感的菌落的一些DNA，用在〔美国科学院会议录72卷3961页(1975)〕上的Grunstein-Hogness)法各被固着在硝酸纤维的滤器上。
随后，固着的那些DNA，用在实施例2(B)里制备的探查物按照Lawn等人在〔核酸研究，9卷6103页(1981)〕上的方法进行杂交，在这之后，用放射自显选出与两种探查物都起阳性反应的一个菌落。使用Brinboim-Doly在〔核酸研究7卷1513页(1979)〕的方法从该菌落分离出一个质粒DNA PTSP20。图1示这质粒的限制性内切酶图谱。
图1
和
分别表示从质粒PUC12衍生及从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074染色体衍生的DNA片段。
实施例3碱基顺序的测定从PTSP20分离得的0.42Kb Hind Ⅲ-PstⅠ片段，按照在〔核酸研究，9卷，309页(1981)〕Messing等人的方法插入到噬菌体M13mp8及M13mp9上，而且其碱基顺序由〔Sanger等;美国科学院会议录，74卷5463(1977)〕的双脱氧法测定。
按前述测得的一部分核苷酸顺序如下表ⅠGCCGCCACAACCGGCTACGAT丙 丙 苏 苏 甘 酪 天(1)GCTGTAGACGAC CTGTTGCAT丙 缬 天 天 亮 亮 组TAT CAT GAG CGG GGC AAC酪 组 谷 精 甘 天酰(15) (20)从这一碱基顺序推断得的氨基酸顺序完全和Lee等人在〔Federatoin Proceedings44卷，3月号11057页(1985)〕上所报导的沙雷氏菌Serratia蛋白酶在第1至第20位上的碱基顺序一致。因此pTSP20显然具有一编码沙雷胃蛋白酶的基因。
实施例4
编码沙雷胃蛋白酶的基因的重克隆在实施例2克隆的编码沙雷胃蛋白酶的基因缺失编码C-末端的区域。这一沙雷胃蛋白酶基因经过重克隆以获得该区域。
质粒pBR322(1μg)用5单位限制性内切酶HindⅢ在37℃中消化1小时并用0.1单位碱性磷酸酶(美国华盛顿公司)在65℃中处理30分钟;经酚及乙醚抽提后用乙醇沉淀之。
从实施例1获得的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074(3μg)的染色体DNA用10单位限制性内的切酶Hind在37℃下消化1小时，在65℃下用乙醇处理15分钟沉淀。
将HindⅢ消化的pBR322(10ng)及HindⅢ消化的染色体DNA(50ng)溶在水里并合并，随后在一种含有10nM ATP，20单位T4DNA连接酶(美国新英生物实验室)及一种连接酶缓冲的溶液于15℃下反应16小时。用所获得的这种反应液，按照美国科学院会议录69卷2110页(1972)所介绍的方法可转化大肠杆菌Escherichia coli DHI，并在会氨比西林(100μg/ml)的琼脂平板上总共产生6000个转化株菌落。
随后，把硝酸纤维滤器(美国，Schreicher和Schul)放在琼脂平板上面而将菌落转移到滤器上。接着以菌落面在最高处保温37℃4小时，从平板上把长着菌落的滤器拆下，放在饱含0.5NNaOH的滤纸上让它留在外面10分钟，再放在饱含1M tris·HCl(pH7.5)-1.5M NaCI的滤纸上留在空气里5分钟，风干30～60分钟并在78℃下加热3小时以便把DNA固定在其滤器上。
在93～391位编码沙雷胃蛋白酶氨基酸的区域是在pTSP20质粒上的0.9KbPstⅠ-BamH1片段上出现。
这个片段根据Maniatis等人在〔分子克隆实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory，1982)〕的方法用切口平移标记的，而且作为探查物通过菌落杂交而克隆这个编码沙雷胃蛋白酶的基因的。结果获得了四个选择的菌落，从其中之一分离得到质粒pTSP21。图2示它的限制性内切酶图谱。在图2上
和
分别表示从pBR322衍生的DNA片段及从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC 21074染色体衍生的DNA片段。
实施例5沙雷胃蛋白酶基因碱基顺序的测定用不同的限制性内切酶切割出实施例2获得的由粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC 21074染色体衍生而来的pTSP20质粒的DNA片段中的一个2Kb PstⅠ-BamH1片段以及实施例4获得的由粘质沙雷氏菌S.marcenscens ATCC 21074染色体衍生得到pTSP21的DNA片段中的一个1.85Kb HindⅢ-Pst1片段。将获得的这些小片段根据Messing等人在〔核酸研究，9卷309页(1981)〕的方法插入到噬菌体M13里;用〔Sanger等人在美国科学院会议录74卷5463页(1977)〕的双脱氧法测定出它们的碱基顺序。图3给出含有沙雷胃蛋白酶基因的以及从碱基顺序得到的氨基酸顺序的DNA的碱基顺序。正为图3所示，这种沙雷胃蛋白酶成熟蛋白的氨基酸顺序完全与由Lee等人在〔Federation Proeccdings，44卷3月号1057页(1985)〕提Edman法则得的沙雷胃氏菌蛋白酶的氨基酸顺序一致。
实施例6含有所有沙雷胃蛋白酶基因的质粒的结构质粒pTSP20缺失编码沙雷胃蛋白酶C-末端区域;pTSP21缺失编码沙雷胃蛋白酶基因的起动子区域。沙雷胃蛋白酶表达质粒可用上述两种质粒按下法构成(1)从pTSP21分离而得的6.8Kb Bam H1片段，用碱性磷酸酶处理并连接到从pTSP20分离而得的2.3Kb BamH1片段上，随后使用这些连接的片段将大肠杆菌Eschemchia Coli DHI及E.coli JM10M转化，产生抗氨比西林的转化株。从其中之一分离得的一个质粒被命名为pTSP25。图4示这个质粒的限制性内的切酶图谱。在图4里
和
分别表示从质粒pBR322衍生而来的DNA片段及从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074染色体衍生而来的DNA片段。
(2)pTSP21被限制性内切酶Eco RV，消化之后，它被用碱性磷酸酶处理并连接到从pTSP20分离而得的1.0Kb Eco RV片段上;随后大肠杆菌DHI及E.coli JM103被这一连接片段转化。从上面所及的抗氨比西林转化株中的一种分离而得的一种质粒被命名为pTSP26。图5示这质粒的限制性内切酶图谱。在图5中
和
分别表示从质粒pBR322衍生而来的DNA片段及从粘质沙雷氏菌S.marcescens ATCC21074染色体衍生而来的DNA片段。
实施例7沙雷氏菌Serratia转化株的生产方法利用实施例4获得的质粒pTSP21或者实施例6获得的pTSP25或pTSP26，可按在基因17卷107页(1982)可说的方法将粘质沙雷氏菌IFO3759，粘质沙雷氏菌87(IFO14454，FERMP-8510)，粘质沙雷氏菌ATCC21074，及粘质沙雷氏菌NC-4转化以产生以下的转化株粘质沙雷氏菌Serratia marcescens IFO3759/pTSP21，S.marcescens IFO3759/pTSP25，S.marcescens IFO3759/pTSP26，S.marcescens 87/pTSP21，S.marcescens 87/pTSP25，S.marcescens 87/pTSP26，S.marcescens-ATCC21074/pTSP21，S.marcescens ATCC21074/pTSP25，S.marcescens ATCC21074/pTSP26，S.marcescens NC-4/pTSP21，S.marcescens NC-4/pTSP25，及S.marcescens NC-4/pTSP26。
实施例8沙雷胃蛋白酶表达质粒的结构接近编码沙雷胃蛋白酶成熟蛋白的第1氨基酸(丙氨酸)的顺序上有一供限制性内切酶XamⅢ用的切割部位。基于这一事实，从pTSP21分离而得的4.0Kb HindⅢ片段被部分地用限制性内切酶XamⅢ切开以产生从编码区的成熟蛋白上游处消去这个5′末端的3.2Kb的XamⅢ-HindⅢ片段，然后将这样得到的片段用S核酸酶处理以制成两边的末端齐平。这些合成的都有一磷酸化的5′末端核苛酸AATTCATGGCC及GGCCATG被连接到修饰了的片段上，这个片段经过用EcoR1处理以修饰EcoR1一部位的两个末端。另外，具有一色氨酸盐(trp)启动子(参阅日本专利公报公布号5096/1986)的表达质粒pTRP781被EcoRⅠ切割;这样获得的EcoR1片段被连接按以产生质粒pTSP31，其沙雷胃蛋白酶基因的方向是朝向色氨酸启动子的。图6示这个质粒的限制性内切酶图谱，在图6上
和
分别地表示从质粒pTSP781衍生的DNA片段及从粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC21074染色体衍生的DNA片段。
实施例9生产大肠杆菌转化株的方法使用实施例4获得的质粒pTSP21，实施例6获得及的质粒pTSP25和pTSP26及实施例7获得的质粒pTSP31，依照美国科学院会议录69卷2110页(1972)以及分子克隆，实验手册(Maniatis等人;Cold Spring Harbor实验室，1982)所介绍的方法可将大肠杆菌DHI(Escherichia coli DHI)及E.coli JM103转化以产生以下的转化株大肠杆菌DHI/pTSP21，大肠杆菌DHI/pTSP25，大肠杆菌DHI/pTSP26，大肠杆菌DHI/pTSP31，大肠杆菌JM103/pTSP21，大肠杆菌JM103/pTSP25，大肠杆菌JM103/pTSP26，以及大肠杆菌JM103/pTSP31。
实施例10沙雷胃蛋白基因的表达将实施例9获得的转化株大肠杆菌JM103/pTSP31接种到含有5ml脑-心浸剂培养基(BHI培养基，Difco实验室)补加有氨比西林(100μg/ml)的试管内并在让它在37℃下振荡生长6小时;将0.5ml这种培养物转移到含有20mlBHI培养液的一个200ml锥瓶里，让它在28℃下振荡生长一天。离心该培养物收集菌胞;用50mMtris·HCl(pH8.0)-50mMNaCl洗菌胞两次，并用乙醇干冰冷冻。将冻结的细胞悬浮在2ml的50mMtris·HCl(pH8.0)-50mMNaCl缓冲液里并用19.5KHz的超声波破碎处理2分钟，随后经离心而制得它们的提取液。
加0.3ml冻丙酮至0.2ml生成的提取液并将这种混合液离心。在沉淀物加入120ml的125mMtris·HCl(pH6.8)-2%去垢剂SDS-20%甘油-0.002%溴酚兰-10%2-巯基乙醇之后，在100℃下加热10分钟并离心。将上清液30ml进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。使用一个电脉转移收集器(transblotter)(放射生物学实验室)将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维滤器上，在这之后，通过兔疫斑渍分析系统(lmmune Blot Assay System)(放射生物实验室)用兔抗沙雷胃蛋白酶抗血清及过氧化酶结合山羊抗兔免疫球蛋白G(放射生物学实验室)测定沙雷胃蛋白酶含量得到每1升培养物生产250μg沙雷胃蛋白酶。按上法获得的产物与抗沙雷胃蛋白酶抗体相作用并在SDS-PAGE中的C出现如同标准沙雷胃蛋白相似的特点;基于这些发现，这种获得的产物按其免疫学特性及分子量可视之为沙雷胃蛋白。
实施例11在粘质沙雷氏菌Serratia marcescens里沙雷胃蛋白酶基因的表达使用在实施例6获得的质粒pTSP26，粘质沙雷氏菌NC-4通过氯化钙方法〔美国科学院会议录69卷第2110页(1972)〕可被转化并产生出一种抗氨比西林的转化株。
粘质沙雷氏菌NC-4和转化株粘质沙雷氏菌NC-4/pTSP26在含有20ml脑-心浸剂培养液的200ml锥瓶里30℃下振荡培养48小时。离心培养物;按〔农业生物化学，28卷(1964)〕那样测定上清液的蛋白酶活性。表Ⅰ示测定的结果，所产的蛋白酶，经SDS电脉后，显示出对抗沙雷胃蛋白抗体起阳性反应。
表Ⅱ细菌品系克莱特值蛋白酶产量(mg/.l)＊粘质沙雷氏菌NC-4 700 3.0粘质沙雷氏菌NC-4/pTSP26 700 7.5＊两次实验的平均值根据这些结果，足以证明这种转化株在培养液里生产了4.5mg/l沙雷胃蛋白酶。
勘误表
权利要求
1.一种生产编码沙雷胃蛋白酶多肽或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的DNA的方法，包括无性繁殖编码沙雷胃蛋白酶多肽或编码具有像从产生沙雷胃蛋白酶微生物的染色体DNA而得的沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的DNA，以及如有需要，可切割，插入，添加或/和消去所述DNA的一些碱基。
2.根据权利要求
1的方法，其中DNA与一个其碱基顺序以下式表示的DNA杂化5′ACTTTGTAX1CCGTCCCAX2GTTTGGTTTTC3′[Ⅰ]式中的X1代表T或G，X2代表T或G。
3.根据权利要求
1或2的方法，其中DNA与一个其碱基顺序以下式表示的DNA杂化5′TCY1TGY2CCY3TGCCA3′[Ⅱ]式中的Y1代表T或C，Y2代表A，G，T或C，Y3代表T或C。
4.根据权利要求
1的方法，其中DNA具有图3所示的在其〔Ⅲ〕的5′端有ATG及3′端有三个终止密码子TAA，TAG及TGA中的1个或2个密码子的第731～2236位的一碱基顺序，其中的部分碱基顺序，或者从所述碱基顺序或其中部分顺序中以取代，插入，添加或消去一些碱基而得的一个碱基顺序。
5.根据权利要求
1的方法，其中DNA具有图3所示的在其〔Ⅳ〕的5′端有ATG或氢原子及3′端有3个终止密码子TAA，TAG及TGA中1个或2个的第827～2236位碱基顺序。
6.根据权利要求
1的方法，其中DNA具有图3〔Ⅴ〕所示的第1～2570位碱基顺序，其中部分或者从所述碱基顺序或其部分碱基顺序经取代，插入，添加或消去一些碱基而得的一碱基顺序。
7.根据权利要求
1的方法，其中DNA编码1个含有下式的氨基酸顺序的多肽组-谷-异-甘-组-丙-亮-35～45氨基酸残基-甘-天-天酰-甘-甘-组-酪-70～80氨基酸残基-亮-天酰-谷-赖-丝-苯-丝-天-缬-甘-甘。
8.根据权利要求
7的方法，其中多肽含有1个从所述氨基酸顺序取代，插入，添加或消去一些氨基酸残基而得的氨基酸顺序。
9.根据权利要求
7的方法，其中的异亮氨酸被亮氨酸或蛋氨酸取代。
10.根据权利要求
7的方法，其中异-甘-组被异-苏-组取代。
11.根据权利要求
7的方法，其中组-丙-亮被组-甘-亮，组-丙-缬或组-甘-缬取代。
12.根据权利要求
7的方法，其中甘-组-酪被甘-缬-组-酪取代。
13.根据权利要求
7的方法，其中谷-赖-丝-苯被谷-丝-苯或者谷-丝-异取代。
14.根据权利要求
7的方法，其中多肽含有图3所示的第(176)～(315)位的1氨基酸顺序。
15.根据权利要求
7的方法，其中多肽含有图3所示的第(146)～(365)位的1氨基酸顺序。
16.根据权利要求
1的方法，其中多肽具有图3所示的第(-33)～(470)位〔Ⅵ〕的氨基酸顺序，所述多肽的一部分，或从所述多肽或者所述部分多肽取代，插入，添加或消去一些氨基残基而得的多肽。
17.根据权利要求
1的方法，其中多肽具有图3〔Ⅶ〕所示的第(1)～(470)位氨基酸顺序，其N端可以有蛋氨酸。
18.一种生产具有以下式表示的一种碱基顺序的DNA的方法，ATG TCT ATC TGT CTG ATT GAT ATC AATCAG GTA ATG AGT GGA ATC GAA CCA ATGCAA TCT ACT AAA AAG GCA ATT GAA ATTACT GAA TCC AAC TTC GCG 〔Ⅷ〕或是所述碱基顺序的一部分，该方法包括无性能繁殖编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像从产生沙雷胃蛋白酶的微生物的染色体DNA得来的沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的DNA，以及包括切割出具有所述碱基顺序的DNA，而且如有需要还包括插入，添加或消去所述DNA的一些碱基。
19.一种生产具有编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的DNA的质粒的方法，包括用限制性内切酶切割出载体DNA，向其内插入一个编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性多肽DNA，以及用DNA连接酶连接获得的DNA。
20.一种生产带有具有编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶那样的抗炎性肽的DNA的质粒转化株的方法，包括用具有一编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性肽的DNA的质粒来转化宿主。
21.一种生产多肽的方法，该多肽是具有图3〔Ⅶ〕所示的第(1)～(470)位的氨基酸顺序、在其N端可以有蛋氨酸，或者是所述多肽的一部分，或者一种具有抗炎性的多肽，它是由所述多肽或所述部分多肽取代，插入，添加或消去一些氨基残基而得的，该方法包括在培养基里培养一种带有具有一个编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的DNA质粒的转化株以便在培养中生产和积累沙雷胃蛋白酶多肽或具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽，及其回收方法。
22.一种生产多肽的方法，该种多肽表示如下式蛋-丝-异-半-亮-异-天-异-天酰-谷酰-缬-蛋-丝-甘-异-谷-脯-蛋-谷酰-丝-苏-赖-赖-丙-异-谷-异-苏-谷-丝-天酰-苯-丙〔Ⅸ〕所述多肽中的一部分，或一种从所述多肽或部分所述多肽取代，插入，添加或消去一些氨基残基而得的多肽，该方法包括在培养基里培养一种带有具有编码沙雷胃蛋白酶多肽的或编码具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎性多肽的一种DNA的质粒的转化株以便在培养中生产和积累沙雷胃蛋白酶多肽或具有像沙雷胃蛋白酶一样的抗炎活性的多肽，以及回收生存的多肽并且从中切割出所述多肽的方法。
专利摘要
本发明涉及一种编码沙雷胃蛋白酶多肽或编码具类似抗炎性的多肽的DNA。使用这种DNA能高效地工业化生产这种沙雷胃蛋白酶多肽或具类似抗炎性的多肽。
文档编号C12R1/43GK86107809SQ86107809
公开日1987年7月15日 申请日期1986年11月15日
发明者菊地正和, 中浜一雄, 丸本龙二 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan